本發(fā)明涉及農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術領域，具體涉及一種肝素鈉的提取方法。

背景技術：

肝素鈉是帶強負電荷的粘多糖，平均分子量為15000道爾頓，用于防治血栓形成或栓塞性疾病；各種彌漫性血管內(nèi)凝血；也用于血液透析、體外循環(huán)、導管術、微血管手術等操作中及某些血液標本或器械的抗凝處理。肝素鈉粗品是純化肝素鈉的原料，由豬、羊的小腸腸粘膜或牛肺提取而得。

目前肝素鈉粗品提取生產(chǎn)工藝都采用酶解---樹脂吸附法，行業(yè)平均出品率一般在1600-1680條豬小腸提取一個億單位(不含腸皮)，工藝流程主要分為酶解、樹脂吸附、洗滌洗脫、酒精沉淀、脫鹽干燥等工序。其中酶解工序是整個流程中的重要工序，酶解程度的大小是決定出品率高低的關鍵因素。傳統(tǒng)的采用堿性蛋白酶進行酶解的過程大多是加入堿性蛋白酶后直接升溫至50～55℃后完成一次酶解，直接進行過濾和吸附收集肝素鈉，每條豬小腸平均可酶解解離出66000USP單位的肝素鈉(平均質(zhì)量1.25kg，平均長度19米-19.5米的健康豬小腸，下同)，酶解折合出品率1600～1700條/億單位。而理論上每條豬小腸(不含腸皮)含72000-75000USP單位的肝素鈉，其酶解解離回收率為90％-92％，還有8％-10％的肝素未解離出來。

為了提高肝素鈉的產(chǎn)率，出現(xiàn)了一些針對酶解過程的研究和改進，如中國專利CN10600875A和CN104448049A均公開了采用二次酶解的方式從豬腸衣中提取肝素鈉，但是上述公開的二次酶解過程中對于酶解溫度、鹽度等的控制不夠合理，使得對于肝素鈉產(chǎn)率的提升不夠顯著。因此，需要研究開發(fā)出一種新的方法，進一步的提高肝素鈉的提取效率。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種肝素鈉的提取方法，提高從豬小腸提取肝素鈉的產(chǎn)率。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

一種肝素鈉的提取方法，包括以下操作步驟：

1)一次酶解：將準備好的豬腸黏膜原料加入鹽度為4.0～4.5度的氯化鈉水溶液中，混合均勻，得混合液，加入pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)混合液的pH值，并將混合液升溫至33±2℃后，加入堿性蛋白酶，持續(xù)升溫至38±2℃后恒溫保持酶解1～1.5小時，完成第一次酶解；

2)二次酶解：第一酶解結(jié)束后，加入pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)混合液的pH值，調(diào)節(jié)混合液的鹽度為3.0～3.5度，持續(xù)升溫至55±1℃后，恒溫保持酶解2.5～3小時，完成第二次酶解；

3)蛋白質(zhì)變性：第二次酶解結(jié)束后，持續(xù)升溫至81±1℃，除去上層雜質(zhì)，保溫，過濾，得酶解液；

4)將步驟3)制備的酶解液依次經(jīng)過吸附、洗滌、洗脫、沉淀、脫水脫鹽、干燥，即完成。

可選的，步驟1)和步驟2)中調(diào)節(jié)混合液的pH值為9.0±0.2。

進一步的，步驟1)第一次酶解過程中和步驟2)第二次酶解過程中保持混合液的pH不低于8.2。

進一步的，步驟1)和步驟2)中采用實時監(jiān)控和補加pH調(diào)節(jié)劑的方式保持混合液的pH值不低于8.2。

可選的，步驟1)第一次酶解過程中采用實時監(jiān)控的方式控制酶解過程的溫度不低于35℃；步驟2)第二次酶解過程中采用實時監(jiān)控的方式控制酶解過程中的溫度不低于52℃。

上述對pH和溫度的實時監(jiān)控具體為每20～30分鐘測定一側(cè)pH值和溫度。

上述鹽度采用波美比重計測定。

可選的，步驟1)中堿性蛋白酶的加入量為每條豬腸對應加入4～4.5g堿性蛋白酶。

進一步的，所述堿性蛋白酶為胰蛋白酶或糜蛋白酶。

可選的，所述pH調(diào)節(jié)劑為2.2～2.5mol/L的氫氧化鈉溶液。

可選的，步驟2)中所述氯化鈉水溶液的質(zhì)量百分濃度為3.0～3.5％。

可選的，步驟3)中保溫時間為10～15分鐘。

可選的，步驟4)所述吸附為將步驟3)制備的酶解液降溫至56±2℃后，調(diào)整酶解液的pH＝8.5±0.2，鹽度＜4度，加入吸附樹脂，攪拌吸附。

可選的，所述吸附樹脂的加入量為每條豬腸加入15～20g吸附樹脂。

可選的，所述攪拌吸附的時間≥8小時，通常采用攪拌吸附過夜。完成吸附操作后的酶解液的pH值應為8.0±0.5，鹽度應為3～4度。

可選的，步驟4)中所述洗滌為取吸附完成后的吸附樹脂用熱水清洗、瀝干。吸附完成后的酶解液取出吸附樹脂后作為廢液按要求排放。

可選的，步驟4)中所述洗脫為在洗滌后的吸附樹脂中加入2倍樹脂量質(zhì)量百分濃度為4％的氯化鈉溶液中，在55±5℃溫度下保溫攪拌30～50分鐘，完成一次洗脫，固液分離得一次洗脫液和一次洗脫樹脂；在一次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在55±5℃溫度下保溫攪拌4～5小時，完成二次洗脫，固液分離得二次洗脫液和二次洗脫樹脂；在二次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在55±5℃溫度下保溫攪拌1～1.5小時，完成三次洗脫，固液分離得三次洗脫液和三次洗脫樹脂。

可選的，步驟4)中所述沉淀為合并一次洗脫液、二次洗脫液和三次洗脫液，得混合洗脫液，在混合洗脫液中加入乙醇至乙醇質(zhì)量百分濃度為40～45％，攪拌30～50分鐘，靜置過夜分層，下層為肝素鈉沉淀，固液分離得肝素鈉粗品。

可選的，步驟4)中所述脫水脫鹽為在肝素鈉粗品中加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇溶液脫鹽脫水2～3次。

可選的，步驟4)中所述干燥為將脫水脫鹽后的肝素鈉粗品在70～80℃條件下烘干。

可選的，所述豬腸黏膜原料由健康豬腸制備而成，具體為：取豬腸用清水仔細清洗去除內(nèi)外污物和外部皮膚脂肪，得到潔凈的豬腸，將潔凈的豬腸絞碎成糜狀，得豬腸黏膜原料。

上述采用的健康豬腸每條的平均重量為1.25kg的健康豬小腸。

本發(fā)明肝素鈉常溫下可貯存3個月，0～10℃溫度下密封可長期保存。

本發(fā)明肝素鈉的提取方法，采用在不同溫度和鹽度條件下二次酶解的方式，并且在現(xiàn)有技術中沒有公開溫度和鹽度的調(diào)整能夠提高肝素鈉的產(chǎn)量的前提下，創(chuàng)造性的選擇一次酶解的溫度為38±2℃，鹽度為4.0～4.5，選擇二次酶解的溫度為55±1℃，鹽度為3.0～3.5度，使肝素鈉出品率達到1490～1510條/億單位，相比傳統(tǒng)的一次酶解和現(xiàn)有技術中公開的二次酶解的方法，提高酶解解離回收率，最終提高肝素鈉的產(chǎn)率。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細說明。

實施例1

一種肝素鈉的提取方法，具體操作步驟為：

1)準備豬腸黏膜：取每條平均重量為1.25kg的健康豬小腸，用清水仔細清洗去除內(nèi)外污物和外部皮膚脂肪，得到潔凈的豬腸，將潔凈的豬腸絞碎成糜狀，得豬腸黏膜；

2)一次酶解：將準備好的豬腸黏膜泵入酶解罐，開啟攪拌并泵入濃鹽水至鹽度為4.2度，加入2.5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為9.0，得混合液，開啟加溫閥，將混合液升溫至33℃時，按照每條豬腸加入4.2g的加入量，加入堿性蛋白酶，繼續(xù)升溫至38℃后，關閉加溫閥，復測pH值，補加2.5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為9.0，保溫攪拌1小時，完成一次酶解，保溫攪拌過程中每隔20分鐘測定一次pH值和溫度，通過補加2.5mol/L氫氧化鈉溶液，開啟加溫閥加溫的方式控制pH值不低于8.2，溫度不低于35℃；

3)二次酶解：一次酶解完成后，開啟加溫閥，升溫至55℃，關閉加溫閥，復測pH值，補加2.5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為9.0，測定酶解液的鹽度，調(diào)整酶解液的鹽度為3.2度，保溫攪拌3小時，完成二次酶解，保溫攪拌過程中每隔30分鐘檢測一次pH值和溫度，通過補加2.5mol/L氫氧化鈉溶液，開啟加溫閥加溫的方式控制pH值不低于8.2，溫度不低于52℃；

4)蛋白質(zhì)變性：二次酶解完成后，開啟加溫閥，快速升溫至81℃后，撇去上浮油沫，保溫10分鐘后，測定肝素鈉的效價，符合要求后，過濾，得酶解液；

5)吸附：將步驟4)制備的酶解液降溫至56℃，調(diào)整其pH值為8.5，鹽度小于4度，按照每條豬腸加入18g吸附樹脂的加入量加入吸附樹脂，攪拌吸附過夜，時間為9小時，完成吸附；

6)洗滌：測定肝素鈉的效價，符合要求后，將步驟5)完成吸附后的酶解液進行固液分離，得吸附完成后的吸附樹脂，采用熱水清洗、瀝干吸附樹脂，完成洗滌；

7)洗脫：在洗滌后的吸附樹脂中加入2倍樹脂量的質(zhì)量百分濃度為4％的氯化鈉溶液，55℃溫度下保溫洗脫30分鐘后，完成一次洗脫，固液分離，得一次洗脫液和一次洗脫樹脂；在一次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在55℃溫度下保溫攪拌4小時，完成二次洗脫，固液分離得二次洗脫液和二次洗脫樹脂；在二次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在55℃溫度下保溫攪拌1小時，完成三次洗脫，固液分離得三次洗脫液和三次洗脫樹脂，三次洗脫樹脂浸泡在飽和氯化鈉溶液中可用于下一次吸附操作；

8)沉淀：合并一次洗脫液、二次洗脫液和三次洗脫液，得混合洗脫液，在混合洗脫液中加入乙醇至乙醇質(zhì)量百分濃度為42％，攪拌30分鐘，靜置過夜分層，下層為肝素鈉沉淀，固液分離得肝素鈉粗品；

9)脫水脫鹽：在步驟8)制備的肝素鈉粗品中加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇溶液脫鹽脫水2次，回收乙醇溶液重復利用；

10)干燥：將步驟9)脫水脫鹽后的肝素鈉粗品在75℃條件下烘干；

11)檢測、入庫、貯存：步驟10)干燥后的肝素鈉檢測效價后，入庫貯存。

實施例2

一種肝素鈉的提取方法，具體操作步驟為：

1)準備豬腸黏膜：取每條平均重量為1.25kg的健康豬小腸，用清水仔細清洗去除內(nèi)外污物和外部皮膚脂肪，得到潔凈的豬腸，將潔凈的豬腸絞碎成糜狀，得豬腸黏膜；

2)一次酶解：將準備好的豬腸黏膜泵入酶解罐，開啟攪拌并泵入濃鹽水至鹽度為4.0度，加入2.2mol/L氫氧化鈉溶液至pH為8.8，得混合液，開啟加溫閥，將混合液升溫至31℃時，按照每條豬腸加入4g的加入量，加入堿性蛋白酶，繼續(xù)升溫至36℃后，關閉加溫閥，復測pH值，補加2.2mol/L氫氧化鈉溶液至pH為8.8，保溫攪拌1.5小時，完成一次酶解，保溫攪拌過程中每隔20分鐘測定一次pH值和溫度，通過補加2.2mol/L氫氧化鈉溶液，開啟加溫閥加溫的方式控制pH值不低于8.2，溫度不低于35℃；

3)二次酶解：一次酶解完成后，開啟加溫閥，升溫至54℃，關閉加溫閥，復測pH值，補加2.2mol/L氫氧化鈉溶液至pH為8.8，測定酶解液的鹽度，調(diào)整酶解液的鹽度為3.0度，保溫攪拌2.5小時，完成二次酶解，保溫攪拌過程中每隔30分鐘檢測一次pH值和溫度，通過補加2.2mol/L氫氧化鈉溶液，開啟加溫閥加溫的方式控制pH值不低于8.2，溫度不低于52℃；

4)蛋白質(zhì)變性：二次酶解完成后，開啟加溫閥，快速升溫至80℃后，撇去上浮油沫，保溫15分鐘后，測定肝素鈉的效價，符合要求后，過濾，得酶解液；

5)吸附：將步驟4)制備的酶解液降溫至54℃，調(diào)整其pH值為8.3，鹽度小于4度，按照每條豬腸加入15g吸附樹脂的加入量加入吸附樹脂，攪拌吸附過夜，時間為8小時，完成吸附；

6)洗滌：測定肝素鈉的效價，符合要求后，將步驟5)完成吸附后的酶解液進行固液分離，得吸附完成后的吸附樹脂，采用熱水清洗、瀝干吸附樹脂，完成洗滌；

7)洗脫：在洗滌后的吸附樹脂中加入2倍樹脂量的質(zhì)量百分濃度為4％的氯化鈉溶液，50℃溫度下保溫洗脫50分鐘后，完成一次洗脫，固液分離，得一次洗脫液和一次洗脫樹脂；在一次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在50℃溫度下保溫攪拌5小時，完成二次洗脫，固液分離得二次洗脫液和二次洗脫樹脂；在二次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在50℃溫度下保溫攪拌1.5小時，完成三次洗脫，固液分離得三次洗脫液和三次洗脫樹脂，三次洗脫樹脂浸泡在飽和氯化鈉溶液中可用于下一次吸附操作；

8)沉淀：合并一次洗脫液、二次洗脫液和三次洗脫液，得混合洗脫液，在混合洗脫液中加入乙醇至乙醇質(zhì)量百分濃度為40％，攪拌50分鐘，靜置過夜分層，下層為肝素鈉沉淀，固液分離得肝素鈉粗品；

9)脫水脫鹽：在步驟8)制備的肝素鈉粗品中加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇溶液脫鹽脫水3次，回收乙醇溶液重復利用；

10)干燥：將步驟9)脫水脫鹽后的肝素鈉粗品在70℃條件下烘干；

11)檢測、入庫、貯存：步驟10)干燥后的肝素鈉檢測效價后，入庫貯存。

實施例3

一種肝素鈉的提取方法，具體操作步驟為：

1)準備豬腸黏膜：取每條平均重量為1.25kg的健康豬小腸，用清水仔細清洗去除內(nèi)外污物和外部皮膚脂肪，得到潔凈的豬腸，將潔凈的豬腸絞碎成糜狀，得豬腸黏膜；

2)一次酶解：將準備好的豬腸黏膜泵入酶解罐，開啟攪拌并泵入濃鹽水至鹽度為4.5度，加入2.4mol/L氫氧化鈉溶液至pH為9.2，得混合液，開啟加溫閥，將混合液升溫至35℃時，按照每條豬腸加入4.5g的加入量，加入堿性蛋白酶，繼續(xù)升溫至40℃后，關閉加溫閥，復測pH值，補加2.5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為9.2，保溫攪拌1.2小時，完成一次酶解，保溫攪拌過程中每隔20分鐘測定一次pH值和溫度，通過補加2.4mol/L氫氧化鈉溶液，開啟加溫閥加溫的方式控制pH值不低于8.2，溫度不低于35℃；

3)二次酶解：一次酶解完成后，開啟加溫閥，升溫至56℃，關閉加溫閥，復測pH值，補加2.4mol/L氫氧化鈉溶液至pH為9.2，測定酶解液的鹽度，調(diào)整酶解液的鹽度為3.5度，保溫攪拌2.8小時，完成二次酶解，保溫攪拌過程中每隔30分鐘檢測一次pH值和溫度，通過補加2.4mol/L氫氧化鈉溶液，開啟加溫閥加溫的方式控制pH值不低于8.2，溫度不低于52℃；

4)蛋白質(zhì)變性：二次酶解完成后，開啟加溫閥，快速升溫至82℃后，撇去上浮油沫，保溫12分鐘后，測定肝素鈉的效價，符合要求后，過濾，得酶解液；

5)吸附：將步驟4)制備的酶解液降溫至58℃，調(diào)整其pH值為8.7，鹽度小于4度，按照每條豬腸加入20g吸附樹脂的加入量加入吸附樹脂，攪拌吸附過夜，時間為10小時，完成吸附；

6)洗滌：測定肝素鈉的效價，符合要求后，將步驟5)完成吸附后的酶解液進行固液分離，得吸附完成后的吸附樹脂，采用熱水清洗、瀝干吸附樹脂，完成洗滌；

7)洗脫：在洗滌后的吸附樹脂中加入2倍樹脂量的質(zhì)量百分濃度為4％的氯化鈉溶液，60℃溫度下保溫洗脫40分鐘后，完成一次洗脫，固液分離，得一次洗脫液和一次洗脫樹脂；在一次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在60℃溫度下保溫攪拌4.5小時，完成二次洗脫，固液分離得二次洗脫液和二次洗脫樹脂；在二次洗脫樹脂中加入等倍樹脂量的飽和氯化鈉溶液，在60℃溫度下保溫攪拌1.2小時，完成三次洗脫，固液分離得三次洗脫液和三次洗脫樹脂，三次洗脫樹脂浸泡在飽和氯化鈉溶液中可用于下一次吸附操作；

8)沉淀：合并一次洗脫液、二次洗脫液和三次洗脫液，得混合洗脫液，在混合洗脫液中加入乙醇至乙醇質(zhì)量百分濃度為45％，攪拌40分鐘，靜置過夜分層，下層為肝素鈉沉淀，固液分離得肝素鈉粗品；

9)脫水脫鹽：在步驟8)制備的肝素鈉粗品中加入質(zhì)量百分濃度為95％的乙醇溶液脫鹽脫水2次，回收乙醇溶液重復利用；

10)干燥：將步驟9)脫水脫鹽后的肝素鈉粗品在80℃條件下烘干；

11)檢測、入庫、貯存：步驟10)干燥后的肝素鈉檢測效價后，入庫貯存。

對比例1

本對比例與實施例1不同的是，酶解過程中溫度設定為55℃，酶解4小時，僅進行一次酶解，其他同實施例1。

對比例2

本對比例與實施例1不同的是，一次酶解過程中鹽度調(diào)整為5度，溫度為52℃，二次酶解過程中鹽度調(diào)整為4.2度，溫度為62℃，其他同實施例1。

比較試驗：

對比實施例1、對比例1和對比例2對同等質(zhì)量的豬小腸肝素鈉提取效果對比，如下表1所示：

表1

表1中酶解解離回收率(％)為：酶解后測定的肝素鈉單位效價*總體積/理論總效價*100％(一般一條小腸理論總效價為7.2萬單位)

由上述表1所示的數(shù)據(jù)可知，相比對比文件1的一次酶解和對比文件2公開的二次酶解，實施例1中通過具體限定二次酶解過程中每次酶解的溫度和鹽度，進一步提高了酶解解離回收率，最終提高肝素鈉的產(chǎn)率。

實施例2和實施例3對肝素鈉的提取效率基本等同，本發(fā)明方法提取肝素鈉的平均出品率為1450～1490條/億單位(不含腸皮)。