本發(fā)明涉及耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的定性PCR檢測方法，尤其涉及耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法，屬于耐除草劑大豆的定性檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種植面積和轉(zhuǎn)基因作物品種都大量增加，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品安全性也引起全球范圍內(nèi)的關(guān)注和擔(dān)憂。為了有效監(jiān)管轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品，保障消費(fèi)者的合法權(quán)益，目前，包括中國在內(nèi)的全世界50多個(gè)國家頒布并實(shí)施了轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)識(shí)制度和配套的管理規(guī)定。中國的基因工程育種技術(shù)發(fā)展迅速，近年來育成了一系列的轉(zhuǎn)基因品種作物，因此制定相關(guān)的轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)方法顯得尤其重要。

在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品安全檢測方法中，PCR技術(shù)以其靈敏度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作簡便成為國際上轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測的主要方法，中國近年來頒布的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品安全評價(jià)方法也是以PCR檢測方法為主。根據(jù)檢測目的基因的不同，PCR檢測方法分為篩查、基因特異性、構(gòu)建特異性和轉(zhuǎn)化體特異性檢測；其中，轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法的特異性最高，篩查檢測和轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法是實(shí)際檢測中應(yīng)用最廣泛的方法。篩查檢測方法主要用于初步檢測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法可以準(zhǔn)確確定轉(zhuǎn)基因植物的身份。

轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆SHZD32-1由上海交通大學(xué)研發(fā)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將密碼子經(jīng)優(yōu)化的耐草甘膦基因G10-EPSPS導(dǎo)入了栽培大豆品種“中豆32”獲得轉(zhuǎn)G10-EPSPS基因的耐草甘膦大豆SHZD32-1。G10是一個(gè)新的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。溫室試驗(yàn)和中間試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)G10基因耐草甘膦大豆的耐草甘膦性能良好，能夠達(dá)到耐除草劑的運(yùn)用水平，已經(jīng)獲批進(jìn)行環(huán)境試驗(yàn)。到目前為止，中國尚未發(fā)布專門針對耐草甘膦大豆SHZD32-1及其衍生品種檢測的方法。因此，迫切需要盡快制定相關(guān)檢測方法，為中國轉(zhuǎn)基因生物安全管理部門實(shí)施各項(xiàng)安全管理制度提供科學(xué)方法和技術(shù)支撐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供用于檢測耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是建立一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明根據(jù)耐除草劑大豆SHZD32-1的兩端側(cè)翼序列，分別在兩端設(shè)計(jì)了引物和探針。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針的核苷酸序列如下：

右側(cè)的引物為由核苷酸序列為SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物組成的引物對1；所述探針為核苷酸序列為SEQ ID No.3所示的探針1；

左側(cè)的引物為由核苷酸序列為SEQ ID No.4所示的正向引物和SEQ ID No.5所示的反向引物組成的引物對2；所述探針為核苷酸序列為SEQ ID No.6所示的探針2。

本發(fā)明進(jìn)一步分別利用這兩端的引物和探針擴(kuò)增SHZD32-1大豆基因組DNA，對兩側(cè)設(shè)計(jì)得到的引物做標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證引物工作效率，篩選最佳的引物和探針組合。擴(kuò)增結(jié)果證明，右側(cè)的引物與探針明顯優(yōu)于左側(cè)的引物和探針。本發(fā)明將右側(cè)的引物與探針分別命名為SHZD32-1QF(SEQ ID No.1所示)、SHZD32-1QR(SEQ ID No.2所示)、SHZD32-1P(SEQ ID No.3所示)。

本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針能夠應(yīng)用于檢測耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待檢測大豆樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，以本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；(3)如果發(fā)生特異性擴(kuò)增(即從待檢測樣品中擴(kuò)增獲得典型的擴(kuò)增曲線)，則待檢測的大豆樣品是耐除草劑大豆SHZD32-1或其衍生品種；如果未發(fā)生特異性擴(kuò)增(即從待檢測樣品中未能擴(kuò)增出典型的擴(kuò)增曲線)，則待檢測的大豆樣品不是耐除草劑大豆SHZD32-1或其衍生品種。

進(jìn)一步優(yōu)選的，一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待檢測大豆樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，以所述的引物對1和探針1建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；(3)如果發(fā)生特異性擴(kuò)增(即從待檢測樣品中擴(kuò)增獲得典型的擴(kuò)增曲線)，則待檢測的大豆樣品是耐除草劑大豆SHZD32-1或其衍生品種；如果未發(fā)生特異性擴(kuò)增(即從待檢測樣品中未能擴(kuò)增出典型的擴(kuò)增曲線)，則待檢測的大豆樣品不是耐除草劑大豆SHZD32-1或其衍生品種。

本發(fā)明所述的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法中，所述PCR擴(kuò)增體系包括：反應(yīng)體系總體積為25.0μL；其中，10×PCR緩沖液2.5μL，25mmol/L氯化鎂溶液2.5μL，dNTPs混合溶液2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，10μmol/L探針0.5μL，終濃度為0.025U/μL的Taq DNA聚合酶，25mg/L DNA模板2.0μL，余量為雙蒸水。所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的程序包括：95℃變性5min；95℃變性15s，60℃退火延伸60s，循環(huán)數(shù)40；在第二階段的退火延伸(60℃)時(shí)段收集熒光信號。

本發(fā)明還公開了一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測試劑盒，包括：10×PCR緩沖液，氯化鎂溶液，dNTPs混合溶液，檢測引物對，探針，Taq DNA聚合酶和雙蒸水；其中，所述檢測引物對、探針為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針；優(yōu)選的，所述檢測引物對為引物對1，所述探針為探針1。

特異性檢測結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法，除在1％SHZD32-1的基因組DNA中得到擴(kuò)增曲線，在其他轉(zhuǎn)基因混合物中均未得到特異的擴(kuò)增曲線。證明本發(fā)明方法具有高度的特異性。

線性區(qū)間測試表明，將SHZD32-1大豆的基因組DNA分別稀釋至50ng-0.016ng進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR測試，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率符合要求，表明本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法在此區(qū)間有較好的線性關(guān)系。

檢出限測試結(jié)果表明，0.025ng的樣品60個(gè)平行均能獲得典型的擴(kuò)增曲線。因此，本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限達(dá)到0.05％(以PCR檢測反應(yīng)體系中加入50ng DNA模板確定)。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明根據(jù)耐除草劑大豆SHZD32-1的兩端側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)并篩選獲得一對實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針。本發(fā)明進(jìn)一步利用所述實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測引物對和探針建立了一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法，該方法的特異性高，檢出限達(dá)到0.05％，能夠用于耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的定性檢測。

附圖說明

圖1為耐除草劑大豆SHZD32-1的載體圖(A)與整合示意圖(B)；

圖2為左右兩側(cè)引物與探針的擴(kuò)增效果；

圖3為實(shí)時(shí)熒光PCR方法引物與探針濃度測試；

圖4為擴(kuò)增靶標(biāo)序列；其中，雙下劃線部分為實(shí)時(shí)熒光PCR方法SHZD32-1QF和SHZD32-1QR引物序列，方框內(nèi)部分為實(shí)時(shí)熒光PCR方法SHZD32-1P探針序列；1～108bp為外源插入片段部分序列，109～234bp為大豆基因組部分序列；

圖5為實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性測試；

圖6為實(shí)時(shí)熒光PCR方法的線性區(qū)間測試；

圖7為實(shí)時(shí)熒光PCR方法的LOD測試。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的定性PCR方法--實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立

1、耐除草劑大豆SHZD32-1分子特征

耐除草劑大豆SHZD32-1的表達(dá)載體為P1300(圖1)，表達(dá)框內(nèi)含有CaMV35S啟動(dòng)子、新型EPSPS基因及CaMV35S-polyA作為終止子，研發(fā)者Southern雜交表明，耐除草劑大豆SHZD32-1基因組中整合了單一拷貝的表達(dá)框。5′端分離到序列長度為517bp的側(cè)翼序列，0-299bp比對到載體上，251-517bp比對到大豆基因組參考序列上，比對到參考序列上的坐標(biāo)為Gm15:15989180-15989446bp；3′端分離到序列長度為456bp的側(cè)翼序列，0-456bp比對到參考序列上，比對到參考序列上的坐標(biāo)為Gm15:15990978-15991438bp，450-502bp比對到載體上。

2、主要技術(shù)參數(shù)確定原則

2.1引物篩選

實(shí)時(shí)熒光PCR方法，利用引物探針設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì)，選擇一條最優(yōu)的探針及相應(yīng)的正反向引物，根據(jù)熒光曲線的線形、擴(kuò)增效率、相對Ct值等，確定引物和探針組合。

2.2反應(yīng)退火溫度和引物濃度的寬容度測試

實(shí)時(shí)熒光PCR方法，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件一般參照使用的試劑(盒)建議的條件進(jìn)行，對引物和探針濃度進(jìn)行測試，根據(jù)熒光曲線的線型、相對Ct值等，確定引物和探針的濃度。

2.3檢測方法特異性測試

選用不同作物及其主要的商業(yè)化轉(zhuǎn)化體進(jìn)行測試，驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)是僅在陽性樣品中獲得預(yù)期的擴(kuò)增。

2.4檢測方法的檢出限

轉(zhuǎn)基因的檢出限(Limit of detection,LOD)一般是指不低于95％的檢出情況下的轉(zhuǎn)基因含量，嚴(yán)格的測試實(shí)驗(yàn)是在60次平行中至少檢出59次陽性。

3、主要技術(shù)參數(shù)確定過程

3.1引物探針設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)耐除草劑大豆SHZD32-1的兩端側(cè)翼序列，利用Primer press軟件分別在兩端設(shè)計(jì)了引物和探針，左右兩端挑選最佳的引物和探針組合(表1)。

表1 兩端引物與探針

分別利用這兩端的引物和探針擴(kuò)增SHZD32-1大豆基因組DNA，擴(kuò)增模板濃度為：50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng，對兩側(cè)設(shè)計(jì)得到的引物做標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證引物工作效率。結(jié)果見圖2。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算擴(kuò)增效率：E＝(10^-1/斜率-1)×100，要求標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率：-3.6≤斜率≤-3.1，即擴(kuò)增效率達(dá)到90－110％。同時(shí)相關(guān)性系數(shù)(R²)≥0.98。根據(jù)擴(kuò)增的表現(xiàn)，右側(cè)的引物與探針要優(yōu)于左側(cè)的引物和探針。本發(fā)明將右側(cè)的引物與探針名稱修改為SHZD32-1QF、SHZD32-1QR、SHZD32-1P。

3.2實(shí)時(shí)熒光PCR方法引物與探針濃度測試

分別設(shè)置引物濃度：0.32μM、0.4μM、0.48μM、0.56μM；探針濃度：0.16μM、0.2μM、0.24μM、0.28μM，做正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PCR體系優(yōu)化，結(jié)果見圖3，各個(gè)濃度的Ct值都在23附近。根據(jù)平臺(tái)期的信號強(qiáng)度，及擴(kuò)增的效率、穩(wěn)定性，選擇引物濃度0.4μM，探針濃度0.2μM作為本發(fā)明的引物及探針濃度。PCR擴(kuò)增體系見表2，擴(kuò)增靶標(biāo)序列見圖4。

PCR擴(kuò)增程序：95℃變性5min；95℃變性15s，60℃退火延伸60s，循環(huán)數(shù)40；在第二階段的退火延伸(60℃)時(shí)段收集熒光信號。

表2 擴(kuò)增體系

3.3實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性測試

轉(zhuǎn)基因混合物材料：

(1)其他轉(zhuǎn)基因大豆混合物：SHZD32-5、SHZD32-9、356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12，每種轉(zhuǎn)化體含量各1％。

(2)轉(zhuǎn)基因水稻混合物：TT51-1、KF-6、KF-2、KMD-1、M12、KF-8，每種轉(zhuǎn)化體含量各1％。

(3)轉(zhuǎn)基因玉米混合物：Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460，每種轉(zhuǎn)化體含量各1％。

(4)轉(zhuǎn)基因油菜混合物：MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2，每種轉(zhuǎn)化體含量1％。

(5)轉(zhuǎn)基因棉花混合物(MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913，每種轉(zhuǎn)化體含量1％。

選取轉(zhuǎn)基因混合物材料，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)的種間特異性測試，以1％的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-1作為陽性對照，并設(shè)置陰性和空白對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除在1％SHZD32-1的基因組DNA中得到擴(kuò)增曲線，在其他轉(zhuǎn)基因混合物中均未得到特異的擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果如圖5。

3.4實(shí)時(shí)熒光PCR方法線性區(qū)間測試

將SHZD32-1大豆的基因組DNA分別稀釋至50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR測試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率符合要求，表明本發(fā)明建立的方法在此區(qū)間有較好的線性關(guān)系。

3.5實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢出限

如果實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限達(dá)到0.05％(以PCR檢測反應(yīng)體系中加入50ng DNA模板確定)，則實(shí)時(shí)熒光PCR方法能檢測到0.025ng SHZD32-1大豆的基因組DNA。0.025ng的樣品60個(gè)平行均能獲得典型的擴(kuò)增曲線(圖7)。因此，本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢出限達(dá)到0.05％(以PCR檢測反應(yīng)體系中加入50ng DNA模板確定)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測方法

<130> ZJ-2001-170113A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

tcgtttcccg ccataagg 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

catcaaccaa gagcaacagc at 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

tccgaccacc acgagaccgt agtaca 26

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

ccttccccct tcgctgtt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 5

tccagatccc ccgaattaat t 21

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 6

aactcattgc acaaagaccc cctaaccg 28