本發(fā)明屬于微藻生物蛋白技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及小球藻的培養(yǎng)方法，特別涉及增加小球藻蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是細(xì)胞的重要組成部分，機(jī)體生長、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)繁殖等生命活動(dòng)都離不開蛋白質(zhì)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織2011年的調(diào)查顯示，人口的增長速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了食品蛋白質(zhì)供應(yīng)的增長速度。蛋白質(zhì)資源缺乏——這一世界性問題已經(jīng)存在多年。隨著我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)的不斷發(fā)展，人民生活水平不斷提高，蛋白質(zhì)總需求量逐年增加。加之我國是人口大國，人口的增長亦使得蛋白質(zhì)缺乏這一問題尤為嚴(yán)重。因此，除努力提高蛋白質(zhì)利用效率外，我們還迫切需要開發(fā)新的蛋白質(zhì)資源以取代魚粉、豆粕等價(jià)格昂貴的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)。

利用生物技術(shù)開發(fā)高效能的單細(xì)胞蛋白引起人們的廣泛關(guān)注，1967年，第一屆國際單細(xì)胞蛋白質(zhì)會(huì)議將富含蛋白質(zhì)的微生物菌體統(tǒng)稱為單細(xì)胞蛋白，其可以作為動(dòng)物飼料，也可以作為食品添加劑、營養(yǎng)保健品被人類食用，以有效緩解食品蛋白質(zhì)供應(yīng)短缺問題。酵母菌、微藻、細(xì)菌和真菌是最重要的單細(xì)胞蛋白來源。

小球藻是第一種實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)的微藻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，易于培養(yǎng)，生長速度快，是進(jìn)行生物技術(shù)研究的好材料。小球藻在自然界分布廣泛，環(huán)境適應(yīng)力較強(qiáng)；且營養(yǎng)價(jià)值較高，胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量可達(dá)到大豆的1.25-1.5倍，各種氨基酸齊全，不飽和脂肪酸含量豐富，此外還含有多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、預(yù)防癌癥、增加免疫力等功效。

發(fā)展小球藻作為飼料或食品添加劑已經(jīng)有30多年的歷史，已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的有小球藻面包、小球藻飲料、小球藻片和膠囊等。日本作為小球藻的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，目前呈現(xiàn)小球藻產(chǎn)品購銷市場(chǎng)空前活躍的局面。

小球藻傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式為利用光能和CO₂的自養(yǎng)，但由于自養(yǎng)培養(yǎng)獲得的小球藻生物量較低，難以獲得理想規(guī)模的藻細(xì)胞體，自養(yǎng)方式的商業(yè)化面臨著經(jīng)濟(jì)和技術(shù)方面的問題。近年來，小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)成為研究熱點(diǎn)。小球藻細(xì)胞在無光照條件下利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長，可大幅度提高細(xì)胞密度，但異養(yǎng)藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量較自養(yǎng)顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn)微藻體內(nèi)的物質(zhì)代謝受外界條件改變而影響，例如，當(dāng)?shù)床蛔銜r(shí)，小球藻胞內(nèi)油脂積累增加，當(dāng)?shù)闯渥銜r(shí)，物質(zhì)代謝流會(huì)朝著蛋白質(zhì)積累的方向進(jìn)行。但小球藻氮代謝未觀察到奢侈性吸收現(xiàn)象，無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的奢侈性生產(chǎn)。如何在保證小球藻高生物質(zhì)產(chǎn)量的前提下提高細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，是小球藻蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用所必需解決的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前異養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量不高的缺陷，提供一種利用過補(bǔ)償吸收效應(yīng)增加小球藻生物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的方法。利用本發(fā)明方法，能夠在保證異養(yǎng)小球藻高生物量的前提下，有效提高細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，實(shí)現(xiàn)小球藻蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種增加異養(yǎng)小球藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的方法，具體包括如下步驟：

所用普通小球藻購于中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫，編號(hào)FACHB-8，生物學(xué)分類屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬。但本發(fā)明不限于此一種小球藻。

所用培養(yǎng)基為修改BG11⁺培養(yǎng)基。氮缺乏修改BG11⁺培養(yǎng)基配方：

(1)氮源，2-6 mmol L^-1

(2)有機(jī)碳源，5-30 g L^-1

(3)K₂HPO₄, 3.0-5.0 g溶于100 mL dH₂O

(4)MgSO₄·7H₂O, 6.5-8.5 g溶于100 mL dH₂O

(5)CaCl₂·2H₂O, 2.6-4.6 g溶于100 mL dH₂O

(6) 檸檬酸, 0.4-0.8 g溶于100 mL dH₂O

(7) 檸檬酸鐵銨, 0.4-0.8 g溶于100 mL dH₂O

(8)EDTA-Na₂, 0.05-0.15 g溶于100 mL dH₂O

(9)Na₂CO₃, 1.0-3.0 g溶于100 mL dH₂O

(10)A₅溶液：H₃BO₃, 2.86g L^-1; MnCl₂·4H₂O, 1.86g L^-1; ZnSO₄·7H₂O, 0.22g L^-1; Na₂MoO₄·2H₂O, 0.021g L^-1; CuSO₄·5H₂O, 0.08g L^-1; Co(NO₃)₂·6H₂O, 0.05g L^-1溶于水中。用1M NaOH或HCl調(diào)pH至7.1。

說明：配制母液（3）-（10）號(hào)時(shí)，藥品分別配制，分別存放。（10）號(hào)中的藥品按量配制后混合存放。配制工作液時(shí)，?。?）-（10）號(hào)母液各1mL，另取（1）氮源2-6 mmol L^-1及（2）有機(jī)碳源5-30 g L^-1，加入蒸餾水中并定容至1000 mL，然后用1 M NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.1，并115°C濕熱滅菌20 分鐘。固體BG11⁺培養(yǎng)基為BG11⁺培養(yǎng)基加入15-20 g L^-1的瓊脂粉。

具體操作方法如下。

(1)將固體BG11+平板培養(yǎng)基上的小球藻單菌落接種到BG11⁺液體培養(yǎng)基中，23-35°C，120-200 rpm，培養(yǎng)2-6天，作為一級(jí)種子液。

(2)將一級(jí)種子液以5%-40%(V/V)的接種量接種于BG11⁺液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-6天，作為二級(jí)種子液。培養(yǎng)條件同一級(jí)種子液。

(3) 將二級(jí)種子液以5%-40% (V/V)的接種量接種于氮濃度為2-6 mmolL^-1的BG11⁺培養(yǎng)基中。于23-35°C，120-200 rpm下培養(yǎng)。

(4)待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第2-4 d，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至已滅菌的離心管中，2000-4500 rpm離心3-10 min，棄去上清液，藻體沉淀轉(zhuǎn)移至氮濃度為12-20 mmol L^-1的已滅菌培養(yǎng)基中。繼續(xù)于23-35°C，120-200 rpm下培養(yǎng)。

(5)待小球藻生長至指數(shù)期結(jié)束即4-8 d，將藻液轉(zhuǎn)移到離心管中，4000-8000 rpm離心5-12 min，收集藻體，減壓干燥。

本專利提供的技術(shù)方案具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明區(qū)別于傳統(tǒng)的兩步補(bǔ)料分批發(fā)酵。傳統(tǒng)兩步發(fā)酵的第一階段積累生物量，第二階段積累次級(jí)代謝產(chǎn)物；而本發(fā)明的過補(bǔ)償吸收培養(yǎng)的氮缺乏階段僅給予藻細(xì)胞氮饑餓刺激，氮充足階段同時(shí)進(jìn)行生物量和蛋白質(zhì)產(chǎn)物的積累。而且本發(fā)明方法在小球藻生長對(duì)數(shù)期補(bǔ)充了充足的新鮮培養(yǎng)基以替代原有培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基中含有更豐富的微量元素，有利于小球藻的生長和蛋白質(zhì)的積累；

（2）有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)添加植物激素也能刺激藻細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝，增加小球藻蛋白質(zhì)含量，但植物激素會(huì)使小球藻的生長受到抑制，生物量降低，不利于小球藻蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。與添加植物激素提高小球藻蛋白質(zhì)含量的方法相比，本發(fā)明既能保證小球藻的生物量，又可使其蛋白質(zhì)含量提高；

（3）本發(fā)明得到的異養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量顯著提高，達(dá)到50%以上，與自養(yǎng)小球藻水平相當(dāng)；

（4）本發(fā)明工藝簡單、操作簡便、生產(chǎn)周期短，條件溫和，原料易得，易于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1： 無菌離心法與普通培養(yǎng)法所得小球藻的蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)產(chǎn)量及生物量。

圖2：此方法所得小球藻中主要成分。

圖3：此方法所得小球藻氨基酸組成。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面將結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋。但需要特別說明的是，實(shí)施實(shí)例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋，本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施實(shí)例表示的范圍。

實(shí)施實(shí)例1

將固體BG11⁺平板培養(yǎng)基上的小球藻接種到已滅菌的BG11⁺液體培養(yǎng)基中，25°C，180 rpm，培養(yǎng)3天，作為一級(jí)種子液。

將一級(jí)種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的BG11⁺液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，作為二級(jí)種子液。培養(yǎng)條件同一級(jí)種子液。

將二級(jí)種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的低氮濃度為3 mmol L^-1的BG11⁺培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm。

待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第3 d時(shí)，在無菌操作條件下4000 rpm離心8 min、收集藻細(xì)胞。

將藻細(xì)胞立即重懸浮于等體積新鮮的已滅菌的18 mmol L^-1高氮濃度培養(yǎng)基中，于25°C中繼續(xù)培養(yǎng)。

待小球藻生長至第7 d時(shí)，4000 rpm離心10 min收集藻體，減壓干燥，重量法測(cè)定其生物量，凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

如附圖1所示，相比普通培養(yǎng)方法，此方法顯著提高了小球藻蛋白質(zhì)含量，可以達(dá)到53.8%。此法獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量達(dá)1.62 g L^-1，生物量為3.01 g L^-1。小球藻細(xì)胞成分見附圖2、氨基酸成分見附圖3。

實(shí)施實(shí)例2

將固體BG11⁺平板培養(yǎng)基上的小球藻接種到已滅菌的BG11⁺液體培養(yǎng)基中，25°C，180 rpm，培養(yǎng)3天，作為一級(jí)種子液。

將一級(jí)種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的BG11⁺液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，作為二級(jí)種子液。培養(yǎng)條件同一級(jí)種子液。

將二級(jí)種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的低氮濃度為3mmol L^-1的BG11⁺培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm。

待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第3 d時(shí)，在無菌操作條件下4500 rpm離心5 min、收集藻細(xì)胞。

將藻細(xì)胞立即重懸浮于等體積新鮮的已滅菌的15 mmol L^-1高氮濃度培養(yǎng)基中，于25°C中繼續(xù)培養(yǎng)。

待小球藻生長至第7 d時(shí)，4500 rpm離心8 min收集藻體，減壓干燥，重量法測(cè)定其生物量，凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

此方法顯著提高了小球藻蛋白質(zhì)含量，使之達(dá)到50.0%，產(chǎn)量為1.54 g L^-1，生物量為3.04 g L^-1。

實(shí)施實(shí)例3

將固體BG11⁺平板培養(yǎng)基上的小球藻接種到已滅菌的BG11⁺液體培養(yǎng)基中，25°C，180 rpm，培養(yǎng)3天，作為一級(jí)種子液。

將一級(jí)種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的BG11⁺液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，作為二級(jí)種子液。培養(yǎng)條件同一級(jí)種子液。

將二級(jí)種子液以10%(V/V)的接種量接種于已滅菌的低氮濃度為3mmol L^-1的BG11⁺培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度25°C，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm。

待小球藻生長至指數(shù)期末期即在培養(yǎng)過程的第3 d時(shí)，在無菌操作條件下4500 rpm離心5 min、收集藻細(xì)胞。

將藻細(xì)胞立即重懸浮于等體積新鮮的已滅菌的12 mmol L^-1高氮濃度培養(yǎng)基中，于25°C中繼續(xù)培養(yǎng)。

待小球藻生長至第7 d時(shí)，4500 rpm離心8 min收集藻體，減壓干燥，重量法測(cè)定其生物量，凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

此方法顯著提高了小球藻蛋白質(zhì)含量，使之達(dá)到47.1%，產(chǎn)量為1.32 g L^-1，生物量為2.81 g L^-1。