本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種篩選棉花抗旱相關(guān)基因的方法，特別涉及一種通過檢測經(jīng)和未經(jīng)干旱脅迫處理的棉花基因組甲基化水平的變化來篩選棉花抗旱相關(guān)基因的方法。

背景技術(shù)：

全球氣候變化加劇，水資源缺乏，溫室效應(yīng)加劇，土壤鹽漬化嚴(yán)重，已嚴(yán)重制約我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。從世界范圍內(nèi)來看，干旱是影響面積最廣，造成經(jīng)濟損失最為嚴(yán)重，被認(rèn)為是世界上最嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一。全世界土地28％干旱，我國有2/3土地干旱。隨著我國糧棉爭地的矛盾日益突出，棉花、馬鈴薯等經(jīng)濟作物的生產(chǎn)形勢起伏不定，不容樂觀。針對棉花的抗旱性研究，一直都是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，更是增加棉花單位面積產(chǎn)量、提高棉花品質(zhì)，解決棉花產(chǎn)能不足的關(guān)鍵所在。據(jù)統(tǒng)計，我國旱地總面積約為7.58×10⁷hm²，占我國總耕地面積的73.70％，截止2010年我國共有5.5×10⁵hm²耕地受旱，每年造成的經(jīng)濟損失約占總自然災(zāi)害的70％以上。因此，開展干旱脅迫對我國經(jīng)濟作物的影響研究，合理開發(fā)利用旱地，對我農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟發(fā)展具有重要戰(zhàn)略意義。

棉花因具有較強的抗逆性，而被譽為鹽堿地的先鋒作物。研究棉花的抗旱性，挖掘抗旱相關(guān)基因，提高棉花抗逆性，具有重要意義。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象的重要內(nèi)容之一，與動植物的正常生長發(fā)育、植物防御、逆境脅迫等許多生命活動有密切聯(lián)系，在整個生命過程中都發(fā)揮著重要作用。在正常情況下，開花被子植物基因組中有20-30％的胞嘧啶殘基會發(fā)生甲基化，最近研究表明，這個比例還會更高，絕大部分都發(fā)生在CG二核苷酸和CNG三核苷酸中，其它位點相對較少。DNA甲基化位點和模式的變化是一個動態(tài)變化，會隨著植物生長發(fā)育，逆境響應(yīng)等生命過程發(fā)生變化。甲基化水平和狀態(tài)的改變相應(yīng)的會引起基因表達水平的改變，研究表明，基因轉(zhuǎn)錄受甲基化影響，甲基化程度較高的基因會抑制表達，而本身發(fā)生去甲基化的基因?qū)鰪姳磉_表達。

甲基化敏感擴增多態(tài)性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技術(shù)在改良的AFLP的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)，采用不同的限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和MspⅠ對5′-CCGG-3′位點進行甲基化酶切，兩種酶對甲基化敏感性不同，但二者均能識別并切割CCGG序列，可產(chǎn)生不同的切割片段，通過擴增這些切割產(chǎn)物來分析甲基化水平和模式變化。這種方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻和棉花等許多其他作物，已經(jīng)被認(rèn)為是一種經(jīng)典的DNA甲基化檢測方法。但是關(guān)于干旱脅迫誘導(dǎo)陸地棉D(zhuǎn)NA甲基化變化的報道還鮮有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的篩選與棉花抗旱性相關(guān)基因的方法。

本發(fā)明所提供的篩選與棉花抗旱性相關(guān)基因的方法，具體可包括如下步驟：

(1)設(shè)置如下實驗組和對照組：

實驗組：對待測棉花進行干旱脅迫處理；

對照組：對所述待測棉花不進行干旱脅迫處理；

所述實驗組和所述對照組的差別僅僅在于是否經(jīng)過干旱脅迫處理，其余所有條件保持一致。

(2)檢測并比較所述實驗組和所述對照組中所述待測棉花的基因組DNA的甲基化水平和/或模式，找到兩組中甲基化水平和/或模式存在顯著性差異的基因，即為或候選為與棉花抗旱性相關(guān)基因。

在本發(fā)明中，所述棉花為陸地棉，具體為陸地棉“中H177”。

在所述方法的步驟(1)中，對所述待測棉花進行干旱脅迫處理時選擇在棉花幼苗長至三葉一心時期進行，待土壤相對含水量下降至7.0％時完成干旱脅迫處理。

在所述方法的步驟(2)中，本發(fā)明是采用MSAP技術(shù)檢測并比較所述實驗組和所述對照組中所述待測棉花的基因組DNA的甲基化水平的。

本發(fā)明采用MSAP技術(shù)檢測并比較所述實驗組和所述對照組中所述待測棉花的基因組DNA的甲基化水平和/或模式時，所用如下：

(a1)雙酶切組合為EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I。

(a2)針對EcoR I的接頭由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子互補配對形成；針對Hpa II和Msp I的接頭由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子互補配對形成。

(a3)針對EcoR I的預(yù)擴增引物為序列表中序列5所示單鏈DNA分子；針對Hpa II和Msp I的預(yù)擴增引物為序列表中序列6所示單鏈DNA分子。

(a4)針對EcoR I的選擇性擴增引物為序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示單鏈DNA分子；針對Hpa II和Msp I的選擇性擴增引物為序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示單鏈DNA分子。

相應(yīng)的，預(yù)擴增PCR體系采用50μL反應(yīng)體系，含5μL連接稀釋產(chǎn)物、兩條預(yù)擴增引物分別為1μL(引物濃度為10μM)、2.5U Taq酶、1×PCR buffer、5μL 2.5mM dNTP。預(yù)擴增PCR反應(yīng)程序為：94℃2min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。

選擇性PCR擴增體系采用20μL反應(yīng)體系，含2μL預(yù)擴增產(chǎn)物、1μL選擇性擴增引物(上下游引物各1μL，引物濃度為10μM)、1×PCR buffer、0.5U Taq酶、2μL2.5mM dNTP。選擇性PCR反應(yīng)程序為：94℃30s(變性)；65℃1min(退火)，72℃1min(延伸)；從第2個循環(huán)至第13個循環(huán)，退火溫度逐次遞減，每個循環(huán)降低0.7℃；從第14個循環(huán)到35個循環(huán)退火溫度保持在56℃，而其它的程序不變；最后72℃延伸10min。

所述方法中，所述找到兩組中甲基化水平和/或模式存在差異的基因，具體可為：根據(jù)MSAP電泳結(jié)果，找到所述實驗組和所述對照組中的差異條帶，將所述差異條帶切割回收測序，根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，找出相應(yīng)基因，即為或候選為與棉花抗旱性相關(guān)基因。

含有如下組合的產(chǎn)品在篩選與棉花抗旱性相關(guān)基因中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍：

(1)限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hpa II和Msp I；

(2)針對EcoR I的接頭，以及針對Hpa II和Msp I的接頭；

所述針對EcoR I的接頭由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子互補配對形成；所述針對Hpa II和Msp I的接頭由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子互補配對形成；

(3)針對EcoR I的預(yù)擴增引物和針對Hpa II和Msp I的預(yù)擴增引物；

所述針對EcoR I的預(yù)擴增引物為序列表中序列5所示單鏈DNA分子；所述針對Hpa II和Msp I的預(yù)擴增引物為序列表中序列6所示單鏈DNA分子；

(4)針對EcoR I的選擇性擴增引物和針對Hpa II和Msp I的選擇性擴增引物；

所述針對EcoR I的選擇性擴增引物為序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示單鏈DNA分子；所述針對Hpa II和Msp I的選擇性擴增引物為序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示單鏈DNA分子。

本發(fā)明還請求保護一種用于篩選與棉花抗旱性相關(guān)基因的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的用于篩選與棉花抗旱性相關(guān)基因的產(chǎn)品，含有如下：

(1)限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hpa II和Msp I；

(2)針對EcoR I的接頭，以及針對Hpa II和Msp I的接頭；

所述針對EcoR I的接頭由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子互補配對形成；所述針對Hpa II和Msp I的接頭由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子互補配對形成；

(3)針對EcoR I的預(yù)擴增引物和針對Hpa II和Msp I的預(yù)擴增引物；

所述針對EcoR I的預(yù)擴增引物為序列表中序列5所示單鏈DNA分子；所述針對Hpa II和Msp I的預(yù)擴增引物為序列表中序列6所示單鏈DNA分子；

(4)針對EcoR I的選擇性擴增引物和針對Hpa II和Msp I的選擇性擴增引物；

所述針對EcoR I的選擇性擴增引物為序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示單鏈DNA分子；所述針對Hpa II和Msp I的選擇性擴增引物為序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示單鏈DNA分子。

在所述應(yīng)用和所述產(chǎn)品中，所述棉花可為陸地棉，具體可為陸地棉“中H177”。

本發(fā)明利用MSAP技術(shù)分析陸地棉幼苗在干旱脅迫下的甲基化和/或模式變化差異，分析脅迫前后CCGG位點胞嘧啶甲基化水平和/或模式的變化，利用甲基化差異片段來搜索抗旱相關(guān)基因，可以為棉花抗旱表觀遺傳調(diào)控機制研究和抗旱相關(guān)基因篩選提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為棉花干旱脅迫前后形態(tài)變化。

圖2為棉花材料中H177基因組DNA電泳結(jié)果。

圖3為DNA甲基化MSAP擴增圖譜。其中，H：HpaⅡ/EcoRⅠ；M：MspⅠ/EcoR。類型I：未甲基化條帶；類型II：半甲基化條帶；類型III：全甲基化條帶。

圖4為干旱脅迫與對照之間棉花基因組的DNA甲基化模式分析。其中H⁰和M⁰為對照的MSAP帶型，H和M為干旱脅迫處理的MSAP帶型；H⁰和H為HpaⅡ/EcoRⅠ酶切，M⁰和M為MspⅠ/EcoRⅠ酶切。

圖5為M1-M5這幾個同源基因在干旱脅迫下的相對表達量。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

陸地棉抗旱材料中H177：來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。記載于“宋貴方.陸地棉抗旱相關(guān)基因(GhTrx、GhGR)克隆及其功能分析.河南大學(xué)，2012，碩士論文”一文，公眾可從申請人處獲得，僅可用于重復(fù)本發(fā)明實驗使用。

實施例1、利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)篩選陸地棉抗旱相關(guān)基因

一、試驗材料

本發(fā)明采用棉花抗旱材料中H177，采用沙培法，在培養(yǎng)箱中育苗(光照14h，30℃；暗10h，25℃)。挑選籽粒飽滿，均勻一致的種子，經(jīng)濃度為5％的次氯酸鈉消毒后，用無菌水進行沖洗干凈，在無菌培養(yǎng)皿中催芽36h，挑選發(fā)芽一致的種子進行種植。在棉花幼苗長至三葉一心時期進行干旱脅迫，監(jiān)測沙土含水量變化，待土壤相對含水量下降至7.0％左右時，進行葉片取樣，液氮速凍，-80℃保存。其中，棉花中H177干旱脅迫前后形態(tài)變化如圖1所示。

實驗同時設(shè)置未經(jīng)干旱脅迫處理的中H177作為對照。

二、基因組DNA的提取、純化和測定

以改良的CTAB法(Porebski S,Grant-Bailey L,Baum B R.Modification fof a CTAB extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components.Plant Molecular Biology Reporter,1997,15(1):8-15.)提取基因組DNA，用RNA酶(10mg·mL-1)處理，去除RNA，純化后的DNA質(zhì)量用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳(圖2)和核酸測定儀(Nanodrop_2000)進行檢測，分裝，4℃和-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、甲基化敏感擴增多態(tài)性分析(MSAP)

1、試驗方法

參照Zhao等(Zhao Y L,Yu S X,Ye WW,et al.Study on DNA cytosine methylation of cotton(Gossypium hirsutum L.)genome and its implication for salt tolerance.Agricultural Science in China,2010,9(6):783-791.)的方法進行MSAP分析，雙酶切組合為EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ，接頭、預(yù)擴增和選擇性擴增引物見表1。

表1接頭、預(yù)擴增和選擇性擴增引物

酶切體系(20μL)：400ngDNA，EcoR I和HpaII(或MspI)各10U，酶切3h。

連接體系(20μl)：200ng酶切產(chǎn)物，5pmol EcoRI接頭，50pmol HpaII-MspI接頭，10U T4連接酶，16℃過夜。連接產(chǎn)物稀釋10倍，備用。

預(yù)擴增PCR體系(50μL)：5μL連接稀釋產(chǎn)物，預(yù)擴增引物E1和HM1分別為1μL(引物濃度為10μM)，2.5U Taq酶，1×PCR buffer，5μL 2.5mM dNTP。預(yù)擴增PCR反應(yīng)程序：94℃2min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。產(chǎn)物稀釋10倍備用。

選擇性PCR擴增體系(20μ)：2μL預(yù)擴增稀釋產(chǎn)物、1μL選擇性擴增引物(上下游引物各1μL，引物濃度為10μM)、1×PCR buffer、0.5U Taq酶、2μL 2.5mM dNTP。選擇性PCR反應(yīng)程序為：94℃30s(變性)；65℃1min(退火)，72℃1min(延伸)；從第2個循環(huán)至第13個循環(huán)，退火溫度逐次遞減，每個循環(huán)降低0.7℃；從第14個循環(huán)到35個循環(huán)退火溫度保持在56℃，而其它的程序不變；最后72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，基因組DNA經(jīng)過酶切組合HpaⅡ/EcoRⅠ(H)和MspⅠ/EcoRⅠ(M)酶切后通常產(chǎn)生4種帶型，但是在聚丙烯酰胺凝膠電泳上只能檢測出3種帶型(圖3)。類型Ⅰ，2條泳道均有帶，表明無甲基化發(fā)生；類型Ⅱ，H泳道有帶，而M泳道沒有帶，表明CCGG位點發(fā)生半甲基化；類型Ⅲ，H泳道無帶，而M泳道有帶，表明CCGG位點發(fā)生全甲基化。根據(jù)電泳結(jié)果所呈現(xiàn)的H/M泳道的帶型情況，進行統(tǒng)計分析。

2、試驗結(jié)果

(1)干旱脅迫引起的棉花基因組DNA甲基化水平變化

采用表1中的16對引物(選擇性擴增引物共計16種組合)進行MSAP分析，在未經(jīng)干旱脅迫處理的棉花材料中H177中可擴增的條帶總數(shù)為324條，甲基化條帶比率為26.85％，全甲基化條帶比率為20.06％。而經(jīng)干旱脅迫處理后可擴增的條帶數(shù)為354條，甲基化條帶比率為29.94％，全甲基化條帶比率為24.57％，具體見表2。即經(jīng)干旱脅迫后，棉花基因組的甲基化水平升高。

表2干旱脅迫對棉花葉片DNA甲基化水平影響

注：擴增條帶總數(shù)＝I+II+III；甲基化條帶總數(shù)＝II+III；全甲基化條帶總數(shù)＝III。

(2)干旱脅迫引起的棉花基因組DNA甲基化模式變化

通過MSAP分析，了解經(jīng)干旱脅迫處理后特定CCGG位點甲基化模式變化情況。結(jié)果顯示試驗材料的MSAP分析共擴增出11種帶型(圖4，11種帶型與表3中的類型相對應(yīng))，分多態(tài)性和單態(tài)性2種。多態(tài)性是指對照與干旱脅迫處理組在甲基化模式上不同，又有3種狀態(tài)即甲基化(B型)、去甲基化(C型)和不定類型(D型)；單態(tài)性即對照與處理之間有相同的帶型(A型)，表明處理后的甲基化狀態(tài)沒有改變。B型表示脅迫以后甲基化水平增加，C型表示脅迫以后甲基化水平下降，D型表示對照與處理組中的DNA甲基化狀態(tài)無法確定。通過對帶型的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)棉花經(jīng)干旱脅迫后，DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生了很大的變化，具體見表3。

表3干旱脅迫對棉花葉片DNA甲基化狀態(tài)的影響

注：H為HpaⅡ/EcoRⅠ酶切，M為MspⅠ/EcoRⅠ酶切；+：有帶，-：無帶；C表示甲基化胞嘧啶。

四、MSAP差異片段的回收、測序及同源比對

對對照組和實驗組的MSAP差異片段進行回收、擴增和序列分析。具體如下：采用滅菌的手術(shù)刀片切割MSAP差異片段，然后用載玻片將切下的條帶壓碎。差異條帶采用Poly-Gel(Omega BioTek,USA)進行回收，回收產(chǎn)物用作DNA擴增模板，然后測序。根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，找出抗旱相關(guān)基因(表4)。

表4差異序列的同源性分析

根據(jù)本課題前期抗旱雙向電泳實驗分析結(jié)果(參考文獻：陸許可等.干旱脅迫下不同抗旱水平陸地棉的葉片蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究.西北植物學(xué)報,2013,33(12):2401-2409)，表明表4中的基因與抗旱性相關(guān)。

五、同源基因表達量檢測(qRT-PCR)

采用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測同源基因的mRNA表達水平。提取實驗組和對照組樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20℃保存用于qRT-PCR分析。以cDNA為模板，以肌動蛋白(Actin)為內(nèi)參基因，同源基因引物如下：M1：5′-GATCTGCGAGTCCCTACTGC-3′，5′-GGGGCGACCATACTTGTTCA-3′；M2：5′-AAAACAGCGGTAGCCACAGA-3′，5′-TACCTGCGCCACAGAAGATG-3′；M3：5′-CAGCTACAGCGCGTTCTTTG-3′，5′-TGCCAGGCCAGACAATTAGG-3′；M4：5′-GAGGTGATGCAACTGGGACA-3′，5′-GTTGATTCCGATGGCCCTGA-3′；M5：5′-ACCCAGCAAACCAAGTAGGG-3′，5′-CACTCAGCACGATGGACAGT-3′。熒光定量PCR體系為20μL，擴增程序為94℃30s；94℃5s，55℃15s，72℃10s，40-45個循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后收集CT值，采用2^-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

結(jié)果如圖5所示，可見M1-M5這幾個同源基因在干旱脅迫下的相對表達量較對照相比有不同程度的升高，且差異顯著。

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所

<120> 一種篩選棉花抗旱相關(guān)基因的方法

<130> GNCLN170535

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 1

ctcgtagact gcgtacc 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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catctgacgc atggttaa 18

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gacgatgagt ctagaa 16

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

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ctactcagat cttgc 15

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtagactgcg taccaattca 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gatgagtcta gaacggt 17

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<212> DNA

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gtagactgcg taccaattca ca 22

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gtagactgcg taccaattca ct 22

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