本發(fā)明屬于組織工程技術領域，尤其涉及脂肪組織來源外泌體膠及制備方法及應用，具體是用脂肪組織來源的外泌體在體內促進脂肪再生中的應用。

背景技術：

軟組織缺損在創(chuàng)傷、腫瘤切除術后、先天畸形等情況下多有發(fā)生，整形美容領域，需要大量的軟組織修復和重建患者的容貌與功能。組織工程技術的出現(xiàn)為整形美容修復開啟了新的里程。傳統(tǒng)組織工程認為組織再生需要三個關鍵要素，即種子細胞、支架材料與再生所需要的微環(huán)境。而由于脂肪組織來源廣泛，獲取方便且不受到醫(yī)學倫理的限制，從脂肪組織中提取的間充質干細胞由于其多項分化潛能，被廣泛應用于組織工程領域。然而干細胞的應用仍然有不少限制，例如干細胞獲取程序的繁瑣、細胞的衰老以及潛在的惡性轉變及致瘤的可能性。

1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。外泌體是由細胞分泌的一種雙層膜狀結構的小囊泡，直徑約40-150nm，攜帶了母細胞重要的信號分子，例如蛋白質、mRNA、miRNA和脂質等，通過與靶細胞的結合而調控細胞功能，參與細胞間交流。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。

研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織除儲存能量外，還具有活躍的內分泌功能，通過分泌眾多激素和脂肪因子，參與調控多種病理生理過程。脂肪組織外泌體可以保持著與其母細胞相似的生物學功能，脂肪干細胞來源的外泌體在促進脂向分化及血管形成方面具有積極的促進作用。

目前脂肪組織外泌體的提取方法多樣，比如超速離心，膜過濾，免疫磁珠等方法，在提取過程中，但都會存在著有其他來源的蛋白及脂質的污染的技術問題和難點。

脂肪組織外泌體在應用過程中也存在著許多難題，比如首先是外泌體支架材料的篩選，理想的支架材料首先需要安全無害，并且能夠粘附外泌體，在體內可以逐漸吸收而不影響宿主的體內微環(huán)境；其次，因為外泌體的提取過程中會有一系列的物理化學操作，能否保證其安全無害上具有一定的難度。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術問題，本發(fā)明提供一種脂肪組織來源的外泌體膠及制備方法，及其在體內促進脂肪組織再生中的應用，本發(fā)明中用化學試劑法提取組織來源外泌體，提取過程相對簡單且組織來源外泌體的量相對大，將其與操作性強的膠混合，具有操作性強，儲存方便等效果，在體內應用方面也證實了這一混合物的促進成脂的特性。

解決以上技術問題的一種脂肪組織來源外泌體膠，其特征在于：包括脂肪組織外泌體和溶劑，脂肪組織外泌體和溶劑質量體積比為1-3：1，所述溶劑為水凝膠。

所述脂肪組織外泌體和溶劑質量體積比為1：1

所述溶劑為基質膠。

細胞與基底膜間的相互作用是調控細胞行為的重要因素之一?；|膠富含生長因子，可認為是一種可溶性的基底膜基質。主要成分包括：層黏連蛋白、膠原IV等，同時含TGF-β成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子以及其它在EHS腫瘤中自然表達的生長因子等。

本發(fā)明中一種脂肪組織來源外泌體膠的制備方法：包括以下步驟：

(1)脂肪組織的處理：

取已處死大鼠體，做腹股溝切口獲取SD大鼠雙側腹股溝脂肪組織，沖洗后將脂肪組織剪碎成1-2mm³；剪碎后的組織相對面積增大且有利于懸浮培養(yǎng)的攪拌，利于外泌體的產(chǎn)生與收集。

(2)脂肪組織提取液的獲?。?/p>

將由步驟(1)獲取的剪碎的脂肪組織轉移到Celstir懸浮培養(yǎng)瓶中，加入α-MEM培養(yǎng)基，保持懸浮培養(yǎng)基為100-110rpm的轉速，存放于35-38℃，4-5％CO2的培養(yǎng)箱，連續(xù)三天后用細胞篩過濾并收集上清液，離心、過濾上清液，離心、過濾上清液后再用0.20-0.25微米的濾器過濾取過濾液放于3KD膜的離心過濾器中，溫度3-5℃，4500-5200g轉速離心28-32min，獲得脂肪組織提取液；α-MEM培養(yǎng)基不含有血清，懸浮培養(yǎng)體系放在孵箱中，保持100rpm的轉速連續(xù)轉動3天，保持脂肪組織懸浮的狀態(tài)，獲取的外泌體的量比較多且穩(wěn)定；細胞篩孔徑為150目，目的在于過濾掉組織殘渣而獲取液體。

優(yōu)化方案中脂肪組織與培養(yǎng)基的體積比為1:3-4；

優(yōu)化方案中保持懸浮培養(yǎng)基為100rpm的轉速，存放于35℃，5％CO2的培養(yǎng)箱，連續(xù)三天后用細胞篩過濾并收集上清液，離心、過濾上清液后再用0.20-0.25微米的濾器過濾；再取過濾液放于3KD膜的離心過濾器中，溫度4℃，5000g轉速離心30min。

放于懸浮培養(yǎng)瓶中保持懸浮的狀態(tài)培養(yǎng)相對于傳統(tǒng)的貼壁法(即為靜止狀態(tài))獲取的外泌體的量比較多且穩(wěn)定。

上清液分別兩次離心轉速，第一次離心目的是為了去除細胞篩未過濾干凈的組織塊殘留和細胞碎片，而第二次離心加上了膜過濾，為的是初步篩選含有分子量接近外泌體的因子的液體，同時進行濃縮。

(3)脂肪組織來源外泌體的獲?。?/p>

將由步驟(2)獲得的脂肪組織提取液中加入外泌體提取試劑，脂肪組織提取液和外泌體提取試劑用量比例為1.8-2.2：1，3-5℃過夜后以3-5℃、8000-12000g離心50-70min，取沉淀，即得脂肪組織來源外泌體；過夜和3-5℃為讓提取溶劑與提取液充分混合溶劑。

優(yōu)化方案中脂肪組織提取液和外泌體提取試劑用量比例為2：1，4℃過夜后以4℃、10000g離心1h。

(4)基質膠復合脂肪組織來源外泌體植入物的制備：

將溶劑置于冰上，3-5℃冰箱過夜融化，同時預冷操作工具；取脂肪組織來源外泌體用融化后的液態(tài)溶劑重懸，外泌體最終濃度為0.8-1.2mg/ml，將獲得的混有脂肪組織來源外泌體的液態(tài)溶劑轉移入預冷的一次性醫(yī)用注射器中，置于冰上保存。優(yōu)化方案中外泌體最終濃度為1mg/ml。

置于冰上預冷，溫度保持在4攝氏度左右，保證溶劑為可注射液態(tài)時間在進行體內實驗注入溶劑截止，一般在1h以內。

混有脂肪組織來源外泌體的液態(tài)溶劑為粘性較大的液體狀態(tài)，可被注射器吸取注射，呈流動狀態(tài)，滴出不能成形，濕潤角小于九十度。

外泌體提取試劑可為Total Exosome Isolation^TM reagent(Life Technologies,USA)、Exo Quick-TC(SBI)或exoEasy Maxi Kit(qiagen)等。

本發(fā)明中的制備方法中直接組織來源，無需額外培養(yǎng)，有著懸浮培養(yǎng)的應用，從整體技術方案和效果上都有好的作用。

所述步驟(2)中脂肪組織提取液的濃度為2-5mg/ml。

所述步驟(2)中上清液以2100-2200g,離心22-28min，再取上清液用0.20-0.25微米的濾器過濾；優(yōu)化方案中上清液以2180g,離心25min，再取上清液用0.22微米的濾器過濾。純度上，要求在提取外泌體之前，沒有細胞殘留，沒有細胞碎片，這樣可以減少其他來源的蛋白及脂質污染。

所述步驟(3)中進行先提純濃縮后再加入外泌體提取試劑，提純步驟為脂肪組織提取液用3KD分子量膜過濾后采用高速離心，即3-5℃以8000-12000g離心50-70min在優(yōu)化方案中提純步驟為脂肪組織提取液用3KD分子量膜過濾后采用高速離心，即4℃以10000g離心60min。

本發(fā)明中一種脂肪組織來源外泌體膠的應用，在體內促進脂肪再生中的應用，也在各種損傷造成的軟組織缺損模型上的應用。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明應用的是組織來源的外泌體，不但避免了應用干細胞帶來的耗時、潛在惡性癌變等弊端，而且創(chuàng)新性應用組織來源外泌體提高提取效率的同時使得成脂微環(huán)境更加地接近體內真實環(huán)境。結果顯示在脂肪組織來源外泌體的促進下，體內能夠形成成熟的脂肪組織，這為組織工程脂肪的獲取提供了有效可靠的新思路。

本發(fā)明脂肪組織來源外泌體，不僅包含了脂肪干細胞分泌的外泌體，同時也包含了其他細胞例如內皮細胞、成纖維細胞、血管周細胞等細胞分泌的外泌體。我們運用的這一外泌體的混合物比起單一細胞來源的外泌體更加接近體內的成脂微環(huán)境。且由于外泌體不含有主要組織相容性復合體，避免了以干細胞為基礎的再生中面臨的免疫源性問題，加之外泌體易于儲存與運輸，這一非細胞生物活性物質在脂肪組織再生中顯示出良好的運用前景。

本發(fā)明利用脂肪組織來源外泌體可以促進宿主來源細胞增殖分化形成新生脂肪組織的特性，克服了傳統(tǒng)組織工程技術中干細胞的免疫源性、潛在惡性轉變及致瘤的可能，為獲取組織工程脂肪提供了新的思路，為整形美容領域的發(fā)展奠定了基礎。

附圖說明

圖1以流程圖形式顯示了脂肪組織外泌體的獲取過程圖

圖2A為脂肪組織外泌體的透射電鏡圖

圖2B是脂肪組織來源外泌體的粒度分析圖

圖3為植入的硅膠管形態(tài)圖

圖4A為植入8周后的大體圖

圖4B為去除外圍硅膠管后樣本的大體觀圖

圖4C為HE染色圖

具體實施方式

以下有具體實施例來對本發(fā)明作進一步的說明，其中本發(fā)明用的外泌體提取試劑為Total Exosome Isolation^TM reagent(Life Technologies,USA)，

實例1脂肪組織外泌體的獲取(圖1)

步驟一、脂肪組織的處理

取已處死4周齡SD大鼠體，75％乙醇Ⅰ消毒30min，75％乙醇Ⅱ消毒30min。轉入無菌操作臺，做腹股溝切口獲取SD大鼠雙側腹股溝脂肪組織，無菌PBS沖洗，用組織剪將脂肪組織剪碎(1-2mm³)，能以巴氏管正常抽取為宜。

步驟二、脂肪組織提取液的獲取

將由步驟一獲取的剪碎的脂肪組織轉移到Celstir懸浮培養(yǎng)瓶中，加入無血清的α-MEM培養(yǎng)基，脂肪組織與培養(yǎng)基的體積比為1:3.5，保持懸浮培養(yǎng)為100rpm的轉速，存放于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱，三天后150目細胞篩過濾去脂肪組織收集上清液。收集到的上清液以2180g，25min去除死細胞和大的碎片，棄沉淀，上清液以0.22微米的濾器過濾去除大顆粒雜質，再用0.22微米的濾器過濾，過濾液可以保存于-80℃轉移至3KD膜的離心過濾器中，4℃，5000g轉速離心30min，獲得的上清液即為脂肪組織提取液，提取液的濃度可用BCA試劑盒測定，提取液可于-80℃保存；脂肪組織提取液的濃度為4mg/ml。

步驟三、脂肪組織來源外泌體的獲取

將由步驟二獲得的脂肪組織提取液中加入1/2體積的外泌體提取試劑(Total Exosome Isolation^TM)，4℃過夜，過夜的樣本4℃，10000g離心1h，棄去上清，獲得的沉淀即為外泌體。外泌體的濃度運用BCA試劑盒檢測，外泌體沉淀可重懸于PBS中-80℃保存。

實例2脂肪組織來源外泌體的鑒定

步驟一、透射電鏡形態(tài)學鑒定

外泌體用1％戊二醛固定，4℃過夜，洗去固定劑后將混勻的外泌體滴加到載樣銅網(wǎng)上，然后滴加水磷鎢酸負染外泌體1min，透射電鏡(Hitachi H-7650)成像并拍照，可見到直徑為100nm左右的圓形囊泡狀結構(圖2A)。

步驟二、粒度分布鑒定

取50微升樣品注射入專用通道測定外泌體的粒度分布，可見粒度分布的高峰位于100nm左右，粒度主要分布于60-150nm之間(圖2B)。結果證明了獲取的樣品為外泌體，也說明了從脂肪組織獲取的外泌體符合外泌體的形態(tài)特征。

實例3基質膠復合脂肪組織來源外泌體植入物的制備

將標準型的基質膠置于冰上，4℃冰箱過夜融化，同時預冷所需槍頭與1ml一次性醫(yī)用注射器。取新鮮離心獲取的200微克外泌體沉淀用200微升融化的液態(tài)基質膠重懸(外泌體最終濃度為1mg/ml)。將獲得的混有脂肪組織來源外泌體的液態(tài)基質膠轉移入預冷的1ml一次性醫(yī)用注射器中，置于冰上備用。

標準型的基質膠指的是未對基質膠中所含有的蛋白和生長因子進行干預的基本型基質膠，模擬了體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能。

基質膠體積稀釋不可過高，比如不能大于3:1，以免在37℃的體內環(huán)境中不可交聯(lián)成固態(tài)，外泌體一般注射量取決于實驗動物的體型大小，以動物能耐受為限制。

實施例4

脂肪組織來源外泌體膠，包括脂肪組織外泌體和基質膠，脂肪組織外泌體和基質膠體積比為1：3。

其制備方法中的其它內容如實施例1和3中的內容，其中：

脂肪組織提取液的獲?。?/p>

將由步驟(1)獲取的剪碎的脂肪組織轉移到Celstir懸浮培養(yǎng)瓶中，加入α-MEM培養(yǎng)基，脂肪組織與培養(yǎng)基的體積比為1:3，保持懸浮培養(yǎng)基為105rpm的轉速，存放于36℃，4％CO₂的培養(yǎng)箱，連續(xù)三天后用細胞篩過濾并收集上清液，離心過濾上清液，即以2100g,離心28min，再取上清液用0.20微米的濾器過濾，取過濾液于3KD膜的離心過濾器中，溫度3℃，4500g轉速離心32min，獲得脂肪組織提取液；脂肪組織提取液的濃度為2mg/ml。脂肪組織來源外泌體的獲取：

將由步驟(2)獲得的脂肪組織提取液加入外泌體提取試劑，脂肪組織提取液和外泌體提取試劑用量比例為1.8：1，3℃過夜后以3℃、8000g離心70min，取沉淀，即得脂肪組織來源外泌體；

脂肪組織來源外泌體膠的制備：

將基質膠置于冰上，3℃冰箱過夜融化，同時預冷操作工具；取脂肪組織來源外泌體用融化后的液態(tài)基質膠重懸，外泌體最終濃度為0.8mg/ml，將獲得的混有脂肪組織來源外泌體的液態(tài)基質膠轉移入預冷的一次性醫(yī)用注射器中，置于冰上保存。

實施例5

脂肪組織來源外泌體膠，包括脂肪組織外泌體和基質膠，脂肪組織外泌體和基質膠量體積比為1：2。

其制備方法中的其它內容如實施例1和3中的內容，其中：

脂肪組織提取液的獲?。?/p>

將由步驟(1)獲取的剪碎的脂肪組織轉移到Celstir懸浮培養(yǎng)瓶中，加入α-MEM培養(yǎng)基，脂肪組織與培養(yǎng)基的體積比為1:4，保持懸浮培養(yǎng)基為110rpm的轉速，存放于38℃，4.5％CO₂的培養(yǎng)箱，連續(xù)三天后用細胞篩過濾并收集上清液，離心過濾上清液，即以2200g,離心22min，再取上清液用0.25微米的濾器過濾，取過濾液于3KD膜的離心過濾器中，溫度5℃，5200g轉速離心28min，獲得脂肪組織提取液；脂肪組織提取液的濃度為5mg/ml。脂肪組織來源外泌體的獲取：

將由步驟(2)獲得的脂肪組織提取液加入外泌體提取試劑，脂肪組織提取液和外泌體提取試劑用量比例為2.2：1，5℃過夜后以5℃、12000g離心50min，取沉淀，即得脂肪組織來源外泌體；

脂肪組織來源外泌體膠的制備：

將基質膠置于冰上，5℃冰箱過夜融化，同時預冷操作工具；取脂肪組織來源外泌體用融化后的液態(tài)基質膠重懸，外泌體最終濃度為1.2mg/ml，將獲得的混有脂肪組織來源外泌體的液態(tài)基質膠轉移入預冷的一次性醫(yī)用注射器中，置于冰上保存，即可。

實例6體內促進脂肪再生的應用

步驟一、裸鼠體內脂肪再生模型的建立

取6-8周齡的裸鼠5只，按每千克10ml 1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后分別于裸鼠背部左右兩側，前后肢中線部位皮下植入一個內徑為4.77mm，高5mm的硅膠管(圖3)，縫合術創(chuàng)，縫線環(huán)繞固定硅膠管，同期將準備好的置于冰上的混有脂肪組織來源外泌體的200微升液態(tài)基質膠注射到右側硅膠管中，左側硅膠管中直接注射200微升液態(tài)基質膠作為空白對照。

步驟二、移植材料的檢測

術后8周，脫頸處死實驗裸鼠，剝離裸鼠背部皮膚，可見植入物外覆有纖維包膜，與對照組相比，實驗組可見硅膠管外有纖維包膜包裹，有明顯的血管化與脂肪組織的形成,(圖4A)，實驗組去除外圍硅膠管，可見管內為血管化良好的軟組織，即血管化良好的脂肪組織形成(圖4B)，獲得的樣本多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋、按樣本縱軸切片，行HE染色觀察組織結構，可見實驗組由富有血管的脂肪組織組成(圖4C)，脂肪細胞大小較為一致，組織為一血管化良好的脂肪組織。以上實驗結果都證實了脂肪組織來源外泌體在體內具有促進脂肪組織再生的作用。與只注射基質膠的對照組相比，注射混有外泌體的基質膠后，在兩周就能在切片上看到脂肪細胞的形成，8周左右新生組織達到成熟狀態(tài)。

本發(fā)明從脂肪組織提取的外泌體，將其應用于裸鼠體內，可以新生出成熟的脂肪組織。這一發(fā)明克服了傳統(tǒng)組織工程中種子細胞的來源不足，潛在惡性癌變及成瘤的缺點，與傳統(tǒng)細胞為基礎的療法相比，脂肪組織來源外泌體具有穩(wěn)定性好、便于保存和運輸，且應用方便快捷、副作用少的優(yōu)點。本發(fā)明為組織工程脂肪的獲取提供了一條新的思路。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。