本發(fā)明涉及屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種多功能裂解酶及其作為抗菌物質(zhì)在控制金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生性李斯特菌的污染的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：奶牛乳房炎不僅給世界乳品工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還危害到公共衛(wèi)生和人類健康。引起奶牛乳房炎的主要原因是病原微生物感染，其中以金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)、鏈球菌和大腸桿菌為主，約占奶牛乳房炎病例的90％以上。奶牛乳房炎最直接的治療途徑是使用抗生素，但治療過程中乳汁會殘留抗生素，從而會對人體產(chǎn)生一定的危害，更為嚴(yán)重的是，病原會因抗生素的長期攝入及高效量的濫用產(chǎn)生耐藥毒力株。目前更多的途徑是防治奶乳房炎的發(fā)生，防重于治，從而有利于養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展。李斯特菌(Listeria)是一種能夠引起動物和人李斯特菌病的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是最重要的食源性人獸共患病原菌，主要表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、腦膜腦炎和流產(chǎn)等，死亡率高達(dá)25-30％。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰場廢棄物及動物源食品中(肉、奶及其制品、海產(chǎn)品等)，且與大多數(shù)人源病原菌不同的是Lm在低溫環(huán)境中仍可生長繁殖(如2～8℃)，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat,RTE)食品中威脅人類健康的重要病原菌之一。目前在牛奶以及多種即食性食品中均檢測到李斯特菌，其在食品中的污染令人堪憂，且新分離的病原不僅耐藥且對食品中是化學(xué)消毒劑均產(chǎn)生一定耐受性，如何有效的控制李斯特菌的污染已成為食品安全中的重大課題。噬菌體是一類細(xì)菌依賴性的病毒，又稱細(xì)菌病毒。裂解性噬菌體感染細(xì)菌后，可在宿主菌內(nèi)快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。裂解酶是雙鏈DNA噬菌體所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌體表達(dá)的一類肽糖水解酶，該酶通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內(nèi)氨基酸殘基間的連鍵最終使宿主細(xì)胞裂解。溶壁酶不僅特異性作用于宿主，且作用時間短，作用譜較噬菌體廣。裂解酶具有高效、特異且不產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，目前在食品及醫(yī)藥行業(yè)已有成功應(yīng)用的報道。在食品中，由于裂解酶能夠作為抗菌劑來控制細(xì)菌污染，且作用快、無殘留、無副作用，具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種多功能裂解酶。技術(shù)方案一種多功能裂解酶，其特征在于其氨基酸序列為SeqIDNO.2。一種多功能裂解酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為SeqIDNO.1。一種表達(dá)多功能裂解酶的制備方法，具體步驟如下：1)合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO.3，合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶結(jié)合功能的SH3bNO.4，從李斯特菌噬菌體裂解酶序列中獲得能夠結(jié)合細(xì)胞壁的C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列NO.5，對三段序列進(jìn)行連接獲得重構(gòu)酶片段；2)構(gòu)建表達(dá)多功能裂解酶的重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到表達(dá)多功能裂解酶的工程菌；4)異丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組基因表達(dá)產(chǎn)物；5)將重組基因表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)鎳柱親和層析純化分離，得到重組的多功能裂解酶；6)將純化的多功能裂解酶產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進(jìn)行去毒處理即≤0.01EU/μg內(nèi)毒素。所述的一種多功能裂解酶在用于消毒擠奶器具后控制奶牛養(yǎng)殖過程中奶牛乳房炎的發(fā)生及牛乳中金黃色葡萄球和單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染控制的應(yīng)用。所述的一種多功能裂解酶在制備同時抑制金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染或過度生長藥物的應(yīng)用。所述的一種多功能裂解酶在制備抑制金黃色葡萄球和單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染或過度生長藥物應(yīng)用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。所述的一種多功能裂解酶的應(yīng)用，其特征在于用重組表達(dá)的多功能裂解酶產(chǎn)物制成殺菌劑。所述的一種多功能裂解酶的應(yīng)用，其特征在于：將純化的多功能裂解酶產(chǎn)物與賦形劑復(fù)配后，用來即食性食品包裝前抑制食品中金黃色葡萄球和單核細(xì)胞增生性李斯特菌的污染。所述原核細(xì)胞表達(dá)載體為pET-28a(+)。所述溶壁酶基因被插入pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoI酶切位點(diǎn)。所述的工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)溫度為37℃。所述誘導(dǎo)表達(dá)所用的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)濃度為0.5～1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為20～26℃。所述的分離純化步驟包括鎳親和層析。有益效果本發(fā)明涉及到的溶壁酶序列是全新序列，其能夠高效殺滅金黃色葡萄球和單核細(xì)胞增生性李斯特菌，該序列制成的制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用為目前預(yù)防奶牛乳房炎及控制食品中金黃色葡萄球和單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染提供一種安全、無毒副作用的酶制劑來源。附圖說明圖1多功能裂解酶LysKZ190表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分析泳道1：純化的裂解酶蛋白LysKZ190M:蛋白分子質(zhì)量Maker圖2多功能裂解酶LysKZ190的殺菌活性鑒定圖3多功能裂解酶LysKZ190在牛奶中的殺菌效果具體實施方式本發(fā)明試驗用噬菌體宿主菌金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus，ATCC25923)購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心(ATCC)；單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，保藏號：GIM1.228)購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。λ噬菌體基因組快速提取試劑盒(北京艾比根生物技術(shù)有限公司)。實施例1：多功能裂解的構(gòu)建a)合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶酰胺酶活性的N端序列NO.3，合成具有金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶結(jié)合功能的SH3bNO.4，從李斯特菌噬菌體裂解酶序列中獲得能夠結(jié)合細(xì)胞壁的C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列NO.5，對三段序列進(jìn)行連接獲得重構(gòu)酶片段；b)將合成的片段通過EcoRⅠ和XhoI位點(diǎn)插入表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建表達(dá)多功能裂解酶的重組表達(dá)載體pET-LysKZ190；c)將測序正確的質(zhì)粒pET-LysKZ190轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含有卡那青霉素(100μg/ml)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取陽性克隆接種于含卡那青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，對陽性克隆進(jìn)行PCR及測序列鑒定，重組菌命名為DE3(pET-LysKZ190)。實施例2：多功能裂解酶LysKZ190的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將重組菌DE3(pET-LysKZ190)接種到含卡那青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)；次日，按1:100比例轉(zhuǎn)接至100mLLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.5時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，28℃誘導(dǎo)5h。收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，4℃，10,000rpm/min離心10min，收集上清，并將上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表達(dá)情況。將過濾的裂解上清用His親和層析鎳柱(GEHealthcare,Sweden)純化，具體按試劑盒說明步聚進(jìn)行。將純化的裂解酶LysKZ190產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒(Novagen公司)進(jìn)行去毒處理(≤0.01EU/μg內(nèi)毒素)，進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白純化效果。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1所示，重組菌DE3(pET-LysKZ190)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其上清純化的融合his蛋白在58kD的位置有較粗的誘導(dǎo)蛋白條帶，與預(yù)期大小相符，從而表明，表達(dá)的多功能裂解酶蛋白產(chǎn)物L(fēng)ysKZ190為可溶性蛋白，其純化濃度經(jīng)測定為1.2mg/ml。實施例3：多功能裂解酶裂解活性鑒定將金黃色葡萄球菌ATCC25923及單核細(xì)胞增生性李斯特菌GIM1.228培養(yǎng)至OD600＝0.8，用PBS洗滌后重懸，取900μl，加入100μl(100μg)純化的裂解酶產(chǎn)物，混勻，室溫下作用1h，用分光光度計動態(tài)測定菌液的OD600值，OD600的下降表明細(xì)菌被裂解。結(jié)果如圖2所示，純化的LysKZ190產(chǎn)物對兩種菌均有具有良好的裂解活性，在作用1h后，OD值從起始的0.8分別降到0.21和0.30，表明多功能裂解酶LysKZ190裂解活性較強(qiáng)。實施例4：多功能裂解酶LysKZ190在牛奶中的滅菌作用將巴氏殺菌牛奶分裝為兩組，A組接種宿主菌金黃色葡萄球菌ATCC25923及單核細(xì)胞增生性李斯特菌各105cfu/mL，加入100μg的LysKZ190蛋白；B組中僅加入金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生性李斯特菌作為對照，同時設(shè)PBS對照。將制備好的樣品分別置于25℃(即室溫)，在作用3h后檢測宿主菌數(shù)量。結(jié)果如圖3所示，25℃作用3h后，金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生性李斯特菌數(shù)量分別下降了約3.57log和3.88log，與對照組比較呈顯著性差異，從而表明LysKZ190在食品中有具有良好的殺菌作用，能夠應(yīng)用于食品的生物防控。實施例5多功能裂解酶LysKZ190在預(yù)防奶牛乳炎中的抗菌效果選自某奶牛場奶牛10頭(顯示疑似奶牛乳房炎表癥)，隨機(jī)分為2組。A組為LysKZ190預(yù)防組：將擠奶器具用含有多功能裂解酶的溶液(100μg/10ml)進(jìn)行接觸表面涂擦，再行擠奶，并在擠完奶后再次將乳房洗凈擦干后用含有多功能裂解酶的溶液(500μg/50ml)直接涂擦乳房表面。B組為對照組，僅洗凈擦干，不用任何藥物。A組及B組用藥均為每天早晚各2次，連用7天為一個預(yù)防療程。由表1可以看出，經(jīng)多功能裂解酶LysKZ190預(yù)防的A組，體細(xì)胞數(shù)與初始數(shù)量比較有顯著下降；而對照組中，體細(xì)胞數(shù)沒有顯著變化，且體細(xì)胞數(shù)仍高于正常體細(xì)胞數(shù)，表明伴有一定的炎癥，需要加強(qiáng)預(yù)防，從而防止奶牛乳房炎的發(fā)病。表1不同藥物治療奶牛乳房炎病牛的體細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果組別用藥用酶前體細(xì)胞數(shù)(萬/ml)用酶后體細(xì)胞數(shù)(萬/ml)A裂解酶組51.0±47.133.5±28.3B對照組49.0±39.750.5±29.4SEQUENCELISTING<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種多功能裂解酶及其制備方法和應(yīng)用<130><160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1374<212>DNA<213>人工序列<400>1atgggatacaaagcagaaccgaaacctacaactcattttgttgcactgcctaaaacgata60aaacatagtttaatcgtcgatgttgatgcttattatggtttggactcggcaatcgattta120cctaactatattttttacgttggtagtaatagatactggaactttaagacaccaggcaac180gcaagagctatgcctgaaggggattttgtctataaagtgcggcaatgtaacacttctaga240tctcctaaaccagcactgtggacaggtggtgcatggtatgcaaattatagatatggtcca300tcaactaaaagtaaatacaattggaacacttggggacacactaaacaggtggttggtatt360gttgtatacttttatagtgaagatcagtctaactctcctgcagcaggtaaaccaacgaag420tttggtgtaagacccggcagtggtggtgatatactaccaaattggaataacgttagtaca480ccggaggcaccagttgtaggtaactattgccctaccggtgaatggaaaatatacggaact540tggtatgcaacaccggaaaaagtcaatggtccacaacctaaagtaactagattcggtggt600ccattcgggttaaatagaatacttggcggtaactttgtattacccgcagctacaattgca660ggtgtacatagttgtatcagacacattactggttataatcaacagaaggacaataaagaa720gcttacaactgtaacagaacttgtaacggtccgccacctaatcttataaaacgcgttgcc780acaggagtatctagaactgacagacttacaggtccatctggagcagtagtggataaaaaa840aatttgctatccaaaatggatagtcccattgaatttaaatctacaaaccaagcagaacag900cgccaccatctaaacaagctaaccaagacaactacatagaaaatggactctagcggacgc960tatacactaagttggctaaacagtatggtagtaacagagttgctaactattcaggaacag1020ctaacactagccagacactccaagttggcttggggtcaacaagaggaagtttttttagta1080aaattaacggtaagaaaggtcgcatataggatggtatcagtacgaaagttctgcgaatta1140aaagcggcattcacacaaattcgaaagacccagtatggaatatccaagacagtagccgca1200gaaactataagccaccaacatgtacctctgtgtatcaagcacctgacgctatcggtgtta1260aggctactaaattcggagcagcagctactatccaaattaaccctactaaagatatatacg1320aaatccaaagaggaaacggtgcagaccgagttctccaatttggtaataaaccgc1374<210>2<211>457<212>PRT<213>人工序列<400>2MetGlyTyrLysAlaGluProLysProThrThrHisPheValAlaLeu151015ProLysThrIleLysHisSerLeuIleValAspValAspAlaTyrTyr202530GlyLeuAspSerAlaIleAspLeuProAsnTyrIlePheTyrValGly354045SerAsnArgTyrTrpAsnPheLysThrProGlyAsnAlaArgAlaMet505560ProGluGlyAspPheValTyrLysValArgGlnCysAsnThrSerArg65707580SerProLysProAlaLeuTrpThrGlyGlyAlaTrpTyrAlaAsnTyr859095ArgTyrGlyProSerThrLysSerLysTyrAsnTrpAsnThrTrpGly100105110HisThrLysGlnValValGlyIleValValTyrPheTyrSerGluAsp115120125GlnSerAsnSerProAlaAlaGlyLysProThrLysPheGlyValArg130135140ProGlySerGlyGlyAspIleLeuProAsnTrpAsnAsnValSerThr145150155160ProGluAlaProValValGlyAsnTyrCysProThrGlyGluTrpLys165170175IleTyrGlyThrCysTyrAlaThrProGluLysValAsnGlyProGln180185190ProLysValThrArgPheGlyGlyProPheGlyLeuAsnArgIleLeu195200205GlyGlyAsnPheValLeuProAlaAlaThrIleAlaGlyValHisSer210215220CysIleArgHisIleThrGlyTyrAsnGlnGlnLysAspAsnLysGlu225230235240AlaTyrAsnCysAsnArgThrCysAsnGlyProProProAsnLeuIle245250255LysArgValAlaThrGlyValSerArgThrAspArgLeuThrGlyPro260265270SerGlyAlaValValAspLysLysAsnLeuLeuSerLysMetAspSer275280285ProIleGluPheLysSerThrAsnGlnAlaGluGlnArgHisHisLeu290295300AsnLysLeuThrLysThrThrThrLysMetAspSerSerGlyArgTyr305310315320ThrLeuSerTrpLeuAsnSerMetValValThrGluLeuLeuThrIle325330335GlnGluGlnLeuThrLeuAlaArgHisSerLysLeuAlaTrpGlyGln340345350GlnGluGluValPheLeuValLysLeuThrValArgLysValAlaTyr355360365ArgMetValSerValArgLysPheCysGluLeuLysAlaAlaPheThr370375380GlnIleArgLysThrGlnTyrGlyIleSerLysThrValAlaAlaGlu385390395400ThrIleSerHisGlnHisValProLeuCysIleLysHisLeuThrLeu405410415SerValLeuArgLeuLeuAsnSerGluGlnGlnLeuLeuSerLysLeu420425430ThrLeuLeuLysIleTyrThrLysSerLysGluGluThrValGlnThr435440445GluPheSerAsnLeuValIleAsnArg450455<210>3<211>471<212>DNA<213>人工序列<400>3atgggatacaaagcagaaccgaaacctacaactcattttgttgcactgcctaaaacgata60aaacatagtttaatcgtcgatgttgatgcttattatggtttggactcggcaatcgattta120cctaactatattttttacgttggtagtaatagatactggaactttaagacaccaggcaac180gcaagagctatgcctgaaggggattttgtctataaagtgcggcaatgtaacacttctaga240tctcctaaaccagcactgtggacaggtggtgcatggtatgcaaattatagatatggtcca300tcaactaaaagtaaatacaattggaacacttggggacacactaaacaggtggttggtatt360gttgtatacttttatagtgaagatcagtctaactctcctgcagcaggtaaaccaacgaag420tttggtgtaagacccggcagtggtggtgatatactaccaaattggaataac471<210>4<211>324<212>DNA<213>人工序列<400>4gttagtacaccggaggcaccagttgtaggtaactattgccctaccggtgaatggaaaata60tacggaacttggtatgcaacaccggaaaaagtcaatggtccacaacctaaagtaactaga120ttcggtggtccattcgggttaaatagaatacttggcggtaactttgtattacccgcagct180acaattgcaggtgtacatagttgtatcagacacattactggttataatcaacagaaggac240aataaagaagcttacaactgtaacagaacttgtaacggtccgccacctaatcttataaaa300cgcgttgccacaggagtatctaga324<210>5<211>579<212>DNA<213>人工序列<400>5actgacagacttacaggtccatctggagcagtagtggataaaaaaaatttgctatccaaa60atggatagtcccattgaatttaaatctacaaaccaagcagaacagcgccaccatctaaac120aagctaaccaagacaactacatagaaaatggactctagcggacgctatacactaagttgg180ctaaacagtatggtagtaacagagttgctaactattcaggaacagctaacactagccaga240cactccaagttggcttggggtcaacaagaggaagtttttttagtaaaattaacggtaaga300aaggtcgcatataggatggtatcagtacgaaagttctgcgaattaaaagcggcattcaca360caaattcgaaagacccagtatggaatatccaagacagtagccgcagaaactataagccac420caacatgtacctctgtgtatcaagcacctgacgctatcggtgttaaggctactaaattcg480gagcagcagctactatccaaattaaccctactaaagatatatacgaaatccaaagaggaa540acggtgcagaccgagttctccaatttggtaataaaccgc579當(dāng)前第1頁1 2 3