本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及一種厭氧真菌及用其發(fā)酵小麥秸稈生產乙醇的方法。

背景技術：

能源短缺和環(huán)境危機是制約當今世界經濟社會發(fā)展的兩大主要問題。世界各國在努力提高現有能源利用效率的同時，積極尋求新能源出路。生物質能源是當今世界上僅次于煤炭、石油和天然氣的第四大能源，在世界能源總消費量中占14％左右。生物質能源以其可再生、資源豐富、價廉環(huán)保而逐漸成為一種重要的新的替代能源。農作物秸稈是生物質能源的重要組成部分，蘊藏著巨大的養(yǎng)分，是重要的能源和資源，也是一種重要的可再生性生物資源。按熱值計2噸秸稈約相當于1噸標準煤，故被稱為是永不枯竭的能源，如何讓農作物秸稈能源發(fā)揮最大效益，已成為全世界廣泛關注的問題。據Smith(1984)統(tǒng)計，農作物秸稈在世界上的產量每年大約有20-30億噸。其中小麥秸占21％，稻草19％，大麥秸10％，玉米秸35％，谷草5％，高粱秸5％。中國是農業(yè)大國，秸稈資源類型十分豐富，分布廣泛，種類繁多，我國農作物秸稈年總產量達5.5-5.7億多噸，列世界之首，主要秸稈類型是小麥，玉米和水稻等糧食作物。秸稈資源的開發(fā)利用，既可緩解農村肥料、飼料、能源和工業(yè)原料的緊張狀況，又可保護農村生態(tài)環(huán)境、促進農村經濟可持續(xù)協調發(fā)展，但目前我國農村的大量秸稈資源完全處于高消耗、高污染、低利用率、低產出狀況，沒有得到合理開發(fā)利用，畜牧業(yè)能量飼料資源緊缺嚴重，解決人畜爭糧，提高飼料利用率，開發(fā)利用新的飼料資源，解決能源問題已成為亟待解決的問題。隨著石油、煤炭等不可再生資源的日益減少，綜合利用農作物秸稈這種寶貴的可再生資源資源對于節(jié)約資源、保護環(huán)境、促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

Orpin 1975年首次證實瘤胃內有厭氧真菌存在時，厭氧真菌降解纖維素的能力引起了重視。反芻動物和草食動物胃腸道中的瘤胃厭氧真菌是重要的纖維降解菌之一。由于厭氧真菌菌絲具有穿透植物厚壁組織的物理降解作用以及產生一系列高活性的降解植物細胞壁的纖維素降解酶，包括纖維素酶、半纖維素酶和酯 酶等多種木質纖維素降解酶的化學降解作用，被認為在瘤胃的木質化組織的降解中發(fā)揮重要作用。

厭氧真菌可以利用的底物包括可溶性糖，如葡萄糖、果糖、纖維二糖、龍膽二糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖等，以及纖維素、木聚糖、葡聚糖等復雜的結構性多糖，儲存還有淀粉和糖原等貯存性多糖等。Neocallimastix屬菌株利用的多糖種類最多，Caecomyces屬對底物的利用種類最少，同屬厭氧真菌的的不同菌株對各種糖類的利用能力也不一樣。

現有秸稈發(fā)酵生產乙醇的方法以玉米秸稈為載體制備固定化酵母細胞并用于餐廚廢棄物發(fā)酵生產乙醇的方法，需要單獨加入糖化酶和淀粉酶，相應增加了成本。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種厭氧真菌。

本發(fā)明的另一個目的是提供用上述厭氧真菌發(fā)酵小麥秸稈生產乙醇的方法，以解決現有方法存在的乙醇產量低且成本高的問題。

本發(fā)明技術方案如下：一種厭氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZF,CGMCC NO:13392，具有大量產乙醇的能力。

用上述厭氧真菌發(fā)酵小麥秸稈生產乙醇的方法，包括如下步驟：以小麥秸稈為底物，以厭氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZF純培養(yǎng)為接種物，同時加入復合抗生素和配制好的氯霉素，于39℃溫度下厭氧培養(yǎng)7天，所產乙醇濃度為260.0mM。

優(yōu)選地，所述復合抗生素為1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸鏈霉素。

優(yōu)選地，厭氧培養(yǎng)7天后，對厭氧瓶內發(fā)酵液在10000×g 4℃條件下離心5min收集上清測定乙醇產量。

優(yōu)選地，所述秸稈只需粉碎風干，不需要給秸稈去皮。

本發(fā)明厭氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZF,CGMCC NO:13392，已經于2016年12月23日在中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(北京)保藏,地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,中國科學院生物研究所。

干草、樹葉、秸稈、秕殼等這類粗飼料，是反芻動物的重要營養(yǎng)來源，占反芻動物日糧的40％-80％，粗飼料中的纖維素經過瘤胃微生物發(fā)酵形成揮發(fā)酸、二氧化碳及甲烷等產物，是反芻動物的主要能源物質。秸稈的主要成分是木質纖 維素，包括纖維素、半纖維素和木質素等，這些物質很難被動物消化利用。提高秸稈的利用效率，開發(fā)秸稈為成纖維素含量低、蛋白質含量高，營養(yǎng)豐富、成本低、消化率高、適口性好達到變費為寶的目的具有重要的生態(tài)效益和戰(zhàn)略意義，建立高效生物轉化技術是解決我國巨大秸稈資源的根本出路。實現纖維素的生物轉化一個有效途徑就是利用高效纖維酶降解木質纖維素為小分子有機物。

厭氧真菌對底物的降解能力與菌株種屬、底物種類、培養(yǎng)方法、分離動物的飼料和動物的地域分布都有關系，同屬不同菌株的降解能力也不同。一般認為Neocallimastix屬和Piromyces屬降解秸稈的能力較強。

反芻動物瘤胃是一個天然獨特的消化發(fā)酵罐，對粗纖維顯著的降解能力為世界矚目，這源于瘤胃內存在大量能夠降解纖維素的微生物。我國牦牛飼養(yǎng)主要以放牧為主，放牧條件下牦牛所采食的低質牧草細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質素構成。牦牛瘤胃微生物高效協同降解野牧草為牦牛提供營養(yǎng)，使牦牛瘤胃成為高效降解木質纖維素的天然發(fā)酵罐。

本發(fā)明特點在于：1.用本發(fā)明的厭氧真菌降解小麥秸稈產乙醇的方法的生產工藝更加簡便，主要是厭氧環(huán)境的保證。2.本發(fā)明方法對秸稈只需粉碎風干，不需要給秸稈去皮。3.本發(fā)明方法所產乙醇濃度很高，在50mL的厭氧發(fā)酵瓶中接種5mL厭氧真菌降解小麥秸稈，到第7天所產乙醇濃度為260.0mM。

具體實施方式

下面對本發(fā)明做進一步詳細的說明。

1.牦牛瘤胃厭氧真菌的分離和鑒定

1.1材料

1.1.1采樣地點概況與牦牛瘤胃液的采集

研究地點位于甘肅省天祝藏族自治縣烏鞘嶺牧場(102°47′13″E，37°10′37″N)，年均溫-1-1.3℃，最高氣溫26℃，最低氣溫-30℃，年降水量265-632mm，海拔3100-3400m，屬寒冷高原氣候類型，溫度變化劇烈，日照強，雨量充沛，植物生長期約120天，高寒草甸是主要草地類型。野生牧草包括羊茅、苔草、早熟禾、嵩草、藏嵩草、細葉嵩草、棘豆、金露梅、珠芽寥，珠芽蓼(Polygonum viviparum)和線葉嵩草(Kobresia capillifolia)是該地區(qū)的主要優(yōu)勢物種。

2012年春季3月以采食天然牧草，無補飼的全放牧天祝白牦牛中的20頭健 康公牦牛(閹牛，年齡4-5歲，體重250±50kg)為實驗動物。用不銹鋼胃管一頭通過開口器插入瘤胃，另一頭接抽空氣設備抽吸出胃管內空氣形成負壓后瘤胃食糜液從不銹鋼胃管中流出，迅速用無菌注射器分別吸取1mL瘤胃食糜液接種到9mL厭氧真菌液體培養(yǎng)基中，并置39℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.2厭氧真菌培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基：參考Bauchop(1979)培養(yǎng)基做改進。酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO₃7.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4℃離心20min后的上清170mL，鹽溶液I 165mL，鹽溶液II 165mL，蒸餾水定容至1000mL。

鹽溶液I包括NaCl 6g，(NH₄)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，MgSO₄·2H₂O 0.6g，蒸餾水定容至1000mL。

鹽溶液II包括4gK₂HPO₄，蒸餾水定容至1000mL。

分離純化培養(yǎng)基：在液體基本厭氧培養(yǎng)基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸稈。

瓊脂滾管培養(yǎng)基：在液體基本培養(yǎng)基中添加1.0g/L葡糖糖和20g/L瓊脂粉，

秸稈培養(yǎng)基：在液體基本培養(yǎng)基中添加以粉碎的小麥秸稈、玉米秸稈或水稻秸稈為底物的液體培養(yǎng)基，添加量為1％(w/v)。

傳代培養(yǎng)基：在液體基本培養(yǎng)基中添加1％(w/v)的小麥秸稈。

培養(yǎng)基分裝到亨氏厭氧管或厭氧瓶中，厭氧管或厭氧瓶通過針頭接入帶有真空泵和高純CO₂的抽氣裝置進行培養(yǎng)基除氧。首先真空泵抽出管中氣體達到負壓時培養(yǎng)基顏色改變，然后充入高純CO₂。每管抽氣充氣3次，其中第一次約15min，其余二次每次5min，最后一次充氣后用無菌株針再放氣使得厭氧管內外壓平衡，并于121℃高溫高壓濕熱滅菌20min備用。

復合抗生素：醫(yī)用青霉素鈉0.48g(80萬單位)與醫(yī)用硫酸鏈霉素1g(100萬單位)溶解于5mL液體培養(yǎng)基中，使得青霉素和硫酸鏈霉素的終濃度分別達到1600IU/mL和2000IU/mL。(消除細菌)。

氯霉素溶液：60mg氯霉素溶解于3mL乙醇(以無菌水為溶質，濃度50％(v/v)的乙醇)，使其濃度達到20mg/mL。厭氧真菌傳代時每次添加25uL到10mL反應體系，使其在培養(yǎng)基中的終濃度為50μg/mL。(消除甲烷菌)。

1.2方法

1.2.1厭氧真菌的選育

采用亨蓋特滾管技術選育真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物。用無菌注射器吸取1mL牦牛瘤胃食糜樣品，接種到39℃預熱的9mL液體基本培養(yǎng)基中，即制成10^-1稀釋液，再取稀釋液依次梯度稀釋至10^-2、10^-3，1mL稀釋液被接種到亨蓋特厭氧管，厭氧管內有9mL液體基本培養(yǎng)基、葡萄糖(1g/L)和融化的瓊脂(20g/L)。接種的同時，每管液體培養(yǎng)基中用七號注射針頭無菌注射器加入復合抗生素溶液2滴，同時再添加配好的20mg/mL氯霉素溶液到亨氏厭氧管的10mL反應體系中，被接種的厭氧管立即在冰上滾管后放置39℃培養(yǎng)4天。真菌單菌在接種后2-3天長出，在厭氧條件下，用接種環(huán)挑取單菌接種到無秸稈的，添加葡萄糖(1g/L)的液體基本培養(yǎng)基中，接種的同時，每管液體培養(yǎng)基中用7號注射針頭無菌注射器加入復合抗生素溶液2滴，同時再添加配好的氯霉素溶液到亨氏厭氧管的10mL反應體系中。這個過程在亨蓋特瓊脂滾管和葡萄糖液體培養(yǎng)基之間重復4-5次，直到亨蓋特瓊脂滾管上的真菌菌落鏡檢后形態(tài)一致，即獲得了真菌單菌。將獲得的單菌接種于小麥秸稈培養(yǎng)基中，39℃培養(yǎng)，每4天傳代1次，每次傳代時加入復合抗生素溶液。

厭氧真菌的傳代：傳代時用無菌注射器吸取1mL共培養(yǎng)物到厭氧管中的9mL小麥秸稈培養(yǎng)基，4天傳代1次。

1.2.2厭氧真菌形態(tài)學鑒定

用普通光學顯微鏡觀察固體瓊脂管培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天的厭氧真菌菌體形態(tài)、假根、菌絲、孢子囊和孢子梗，用相差顯微鏡(BX41-PHD-P11，上海，中國)觀察真菌在無秸稈，添加葡萄糖為底物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天的厭氧真菌菌體形態(tài)、孢子囊、孢子梗、假根、菌絲體和游動孢子鞭毛及運動狀態(tài)，根據形態(tài)學特征對其做出種屬鑒定。

1.2.3厭氧真菌分子生物學鑒定

1.2.3.1厭氧真菌總DNA的提取

采用液氮研磨菌體后使用天根植物基因組試劑盒(天根生化科技，北京)提取厭氧真菌總DNA。

(1)10mL厭氧真菌及甲烷菌共培養(yǎng)物菌液接種到90mL，無秸稈，添加0.1％(w/v)葡萄糖的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5天后將菌液移到離心管后12000×g離心5min，棄上清，收集菌體沉淀轉入研缽，加入液氮將菌體快速充分研磨成粉末。

(2)將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700μL 65℃預熱緩沖液GP1的離心管中(實驗前在預熱的GP1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1％(w/v)，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65℃水浴20min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品。

(3)加入700μL氯仿，充分混勻，12000×g離心5min。

(4)將上一步所得水層上相轉入一個新的離心管中，加入700μL緩沖液GP2。

(5)將混勻的液體轉入吸附柱CB3中，12000×g離心30s，棄掉廢液。(吸附柱容積為700μL左右，可分次加入離心。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000×g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，10000×g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重復操作步驟(7)。

(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000×g離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(10)將吸附柱CB3轉入干凈的離心管，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置5min，12000×g離心2min，將溶液收集到離心管中。

(11)將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3，室溫放置2min，12000×g離心2min。

(12)DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。

1.2.3.2厭氧真菌ITS1序列的PCR擴增

利用厭氧真菌ITS1專用引物Neo18S For(5’-AAT CCT TCG GAT TGG CT-3’)和Neo5.8S Rev(5’-CGA GAA CCA AGA GAT CCA-3’)擴增厭氧真菌的ITS1全序列(Edwards等，2008)。使用MyCycler PCR儀(Bio-rad，美國)進行擴增，PCR反應緩沖液(總體積10μL)包括40mM Tricine-KOH(pH 8.0),16mM KCI，3.5mM MgC1₂，100μg/mL牛血清白蛋白，800μM dNTP，500nM上下游引物，0.2μL 50×TITANIUM Taq酶和模板DNA大約50ng。PCR反應條件是：95℃5min，然后10個循環(huán)95℃30s，68℃30s(每個循環(huán)降1℃)和72℃30s，然后25個循環(huán)95℃30s，58℃30s和72℃30s，最后72℃延伸6min。沒有模板的PCR反應體系作為空白對照。

1.2.4厭氧真菌的進化關系分析

厭氧真菌ITS1序列測序結果提交NCBI，在NCBI數據庫中通過BLAST比對分析，采用ClustalX V1.83對序列做多序列的全部比對，獲得進化樹最終序列，使用MEGA6.0(Tamura等，2013)軟件的neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹。

1.3試驗結果

1.3.1牦牛瘤胃厭氧真菌的分離純化和鑒定

從天祝牦牛瘤胃液中分離純化5個厭氧真菌。細菌特定引物968f/1401r擴增顯示每一個共培養(yǎng)中都沒有細菌污染。5個厭氧真菌接種于亨氏厭氧管中小麥秸稈培養(yǎng)基，4天傳代1次以保證其活性。光學顯微鏡、相差顯微鏡下觀察真菌形態(tài)，基于厭氧真菌的形態(tài)學鑒定和ITS1序列分析，得到本發(fā)明產乙醇最好的株厭氧真菌是：Piromyces Yak TZF。

2.牦牛瘤胃厭氧真菌降解秸稈功效及其產乙醇研究

2.1材料

基本培養(yǎng)基：參考Bauchop(1979)培養(yǎng)基做改進。酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO₃7.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4℃離心20min后的上清170mL，鹽溶液I 165mL，鹽溶液II 165mL，蒸餾水定容至1000mL。

鹽溶液I包括NaCl 6g，(NH₄)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，MgSO₄·2H₂O 0.6g，蒸餾水定容至1000mL。

鹽溶液II包括4gK₂HPO₄，蒸餾水定容至1000mL。

傳代培養(yǎng)基：厭氧管傳代。液體基本培養(yǎng)基中不加葡萄糖，以粉碎的小麥秸稈1％(w/v)為底物。

秸稈培養(yǎng)基：在100mL厭氧瓶中加入45mL液體基本培養(yǎng)基，不加葡萄糖，以粉碎的500mg小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈作為底物。

目標菌株：5株厭氧真菌純培養(yǎng)中因為菌株Piromyces Yak TZF生長最快，底物小麥秸稈因為真菌Piromyces Yak TZF的生長利用產氣而最早浮起，因此以厭氧真菌Piromyces Yak TZF作為目標菌株。

2.2方法

以瘤胃厭氧真菌純培養(yǎng)Piromyces Yak TZF為目標菌株，每1個培養(yǎng)物在小麥秸稈為底物的厭氧管中傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)同時用無菌注射器分別接種5mL 培養(yǎng)物到以500mg小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈為底物的45mL液體厭氧培養(yǎng)基中，測定7天培養(yǎng)期內真菌純培養(yǎng)Piromyces Yak TZF降解3種秸稈底物的功效，包括：總產氣量、木質纖維素降解酶活性、干物質降解率、中性洗滌纖維素降解率和乙醇產量。

2.2.1實驗設計和取樣

分別以小麥秸稈、玉米秸稈和水稻秸稈為底物，以真菌純培養(yǎng)Piromyces Yak TZF為接種物。每1個培養(yǎng)物加入每1種秸稈為底物做3個平行。5mL培養(yǎng)物被接種到45mL秸稈為底物的液體培養(yǎng)基中，同時加入復合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸鏈霉素)和配制好的氯霉素，39℃厭氧培養(yǎng)7天。隔24h取出培養(yǎng)物的3個平行厭氧瓶，厭氧瓶內發(fā)酵液5000×g 4℃離心10min收集上清測定木聚糖酶(Xylanase)、羧甲基纖維素酶(CMCase)、濾紙酶(FPase)、阿魏酸酯酶(FAE)、乙酰酯酶(AE)、香豆酸酯酶(CAE)的活性，進一步10000×g4℃離心5min收集上清測定乙醇產量。厭氧瓶內殘留底物秸稈量用來測定干物質降解率(IVDMD)、中性洗滌纖維降解率(NDFD)。不接種培養(yǎng)物的液體秸稈培養(yǎng)基作為空白對照。

2.2.2秸稈基本營養(yǎng)成分測定

所用底物為小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈。干物質(DM)根據AOAC的方法進行測定，(1999，ID 930.5)。粗蛋白通過凱氏定氮儀(Foss Electric，丹麥)進行測定(AOAC，1999，ID 948.13)?；曳?ID 942.05)、鈣(ID 927.02)和磷(ID965.17)參照AOAC的方法進行(1999)。中性洗滌纖維(NDF)和參照Van Soest等(1991)的方法進行。在NDF測定中沒有使用α-淀粉酶，使用了亞硫酸鈉，NDF測定值中包含著殘渣灰分。

2.2.3厭氧真菌降解秸稈的產氣量測定

接種共培養(yǎng)物于厭氧管后接AGRS-1型體外產氣自動記錄裝置和軟件系統(tǒng)(國家發(fā)明專利授權號ZL200610011301.X)測定實時產氣量。

2.2.4厭氧真菌降解秸稈的酶活測定

將共培養(yǎng)物的發(fā)酵液1000×g 4℃離心10min，取上清液測定酶活性。采用分光光度計用DNS法測定木聚糖酶、羧甲基纖維素酶和濾紙酶活性，用酶標儀測定阿魏酸酯酶和乙酰酯酶活性。

2.2.5.1木聚糖酶(Xylanase)活性的測定

稀釋的粗酶液(稀釋至OD值大約在0.2-0.8范圍)、底物10g/L樺木木聚糖(SigmaX-0502)和50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)置39℃預熱15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸鈉緩沖液和500μL底物，39℃反應15min后，加入3000μL DNS終止反應。沸水浴5min后冷卻至室溫，取2000μL于比色皿中，在540nm下檢測吸光值。根據木糖的標準曲線計算木聚糖酶活性。

1個酶活力單位(U)是指在以上所述酶促反應條件下，1mL酶液在1min內自標準底物羧甲基纖維素鈉中釋放1μmol葡萄糖所需的酶量。

2.2.5.2羧甲基纖維素酶(CMCase)活性的測定

稀釋的粗酶液、底物10g/L羧甲基纖維素鈉和50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)置39℃預熱15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸鈉緩沖液和500μL底物，39℃反應15min后，加入3000μLDNS終止反應。沸水浴5min后冷卻至室溫，取2000μL于比色皿中，在540nm下檢測吸光值。根據葡萄糖標曲計算CMCase酶活。

1個酶活力單位(U)是指在以上所述酶促反應條件下，1mL酶液在1min內自標準底物羧甲基纖維素鈉中釋放1μmol葡萄糖所需的酶量。

2.2.5.3濾紙酶(FPase)活性的測定

稀釋的粗酶液,底物1×6cm Whatmen No.1濾紙和50mM磷酸鈉緩沖(pH 6.8)置39℃預熱15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸鈉緩沖液和500μL底物，39℃反應15min后，加入3000μLDNS終止反應。沸水浴5min后冷卻至室溫，取2000μL于比色皿中，在540nm下檢測吸光值。根據葡萄糖的標曲計算FPase酶活。

1個酶活力單位(U)是指在以上所述酶促反應條件下，1mL酶液在1min內自標準底物Whatmen No.1濾紙中釋放1μmol葡萄糖所需的酶量。

DNS溶液：準確稱取10.0g 3,5-二硝基水楊酸(分析純)，轉移至1000mL燒杯中，加入500mL蒸餾水，放到磁力攪拌器上，將加熱溫度調到45℃，邊加熱邊攪拌。然后加入10.0g氫氧化鈉，直至溶液清澈透明。然后逐步加入四水酒石酸鉀鈉208g，苯酚2.0g，無水亞硫酸鈉0.5g。繼續(xù)45℃加熱，同時補加約300mL蒸餾水，直至加入的藥品完全溶解。將溶液冷卻，定容至1000mL，然后用燒結玻璃過濾器(測定粗纖維用過濾器)過濾后，將濾液轉移至棕色瓶中，避光于冰箱保存一周后備用，有效期為6個月。

2.2.5.4阿魏酸酯酶(FAE)活性的測定

稀釋粗酶液并置39℃預熱15min，含100μM阿魏酸甲酯(Sigma Chemicals)的100mM 3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)溶液(pH 6.8)作為底物置39℃預熱15min。在100μL粗酶液中加入200μL底物，39℃反應30min，用酶標儀(680XR，Bio-rad，美國)在340nm下檢測反應0min和30min時的吸光值，根據阿魏酸及阿魏酸甲酯標準曲線計算阿魏酸酯酶活性。

1個酶活力單位(U)是指在以上所述酶促反應條件下，1mL酶液在1min內自標準底物阿魏酸甲酯中釋放1μmol阿魏酸所需的酶量。

100mM MOPS緩沖液(pH 6.8)：稱取5.2323g MOPS，溶于150mL去離子水中，用NaOH調pH至6.8，用去離子水定容至250mL。

2.2.5.5乙酰酯酶(AE)活性的測定

稀釋粗酶液并置39℃預熱15min，2mM對-硝基苯乙酯作為底物和50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)置于39℃預熱15min。向50μL粗酶液中加入100μL磷酸鈉緩沖液和50μL底物，39℃反應30min后，用酶標儀(680XR，Bio-rad，美國)在415nm下檢測吸光值，根據對-硝基苯的標準曲線計算乙酰酯酶活性。

1個酶活力單位(U)是指在以上所述酶促反應條件下，1mL酶液在1min內自標準底物對-硝基苯乙酯中釋放1μmol對-硝基苯所需的酶量。

2.2.6厭氧真菌降解秸稈纖維降解率測定

2.2.6.1干物質降解率測定

采用尼龍袋法。

2.2.6.2中性洗滌纖維降解率測定

中性洗滌纖維(NDF)按照Van Soest等(1991)的方法進行，測定如下：

(1)中性洗滌劑的配制

稱取37.22g乙二胺四乙酸二鈉(Na₂EDT，化學純)和13.62g四硼酸鈉(Na₂B₄O₇·10H₂O)同放入第一個1000mL燒杯中，加少量水加熱溶解后，再加入60g十二烷基硫酸鈉和20mL乙二醇乙醚。稱取9.3g無水磷酸氫二鈉(相當于25.2g十二水磷酸氫二鈉)，置于另一燒杯中，加少量水，微微加熱溶解后傾于第一個燒杯中，定容至2000mL。此溶液pH在6.9-7.0左右(一般不需調整)。注意：由于十二烷基硫酸鈉是起泡劑，所以在溶解時先將其他試劑放入燒 杯中用蒸餾水加熱溶解，邊加熱溶解邊加入十二烷基硫酸鈉。

(2)濾袋和樣品的準備

將待測秸稈樣品烘干后過40目和60目篩(大于60目小于40目)。用2B鉛筆給濾袋編號，置于105℃烘箱中烘干，稱重(m₁)。

(3)稱樣

稱取制備好的秸稈樣品(m)于濾袋中。

(4)封口

在距離濾袋上邊緣大約5mm用封口機封口。將樣品在濾袋中展均勻分布。(5)空白對照

至少取一個空白濾袋(C₁)C₁為空白袋子校正系數(烘干后質量m₃/原來質量m₀)，同時做空白測定。

(6)消煮

將濾袋放入消煮器(200-300mL高型燒杯，上蓋表面皿)中，將煮沸的中性洗滌劑溶液按照1個樣品100mL的量加入，按1個樣品0.5g的量加入無水亞硫酸鈉，適量熱穩(wěn)定α-淀粉酶(17400單位/mL，1個活性單位表示能將1mg可溶性淀粉用30min水解)，然后將上述溶液加入消煮器中。大約1.8L中性洗滌劑煮24個樣，邊加熱邊攪拌，加熱并維持溶液溫度100℃，處理時間75min，包括加熱升溫時間。每隔10min用粗玻棒在燒杯內壁擠出濾袋中溶液，并輕微攪動使中性洗滌劑再次進入袋內充分作用于樣品。在沸騰時，保持微沸煮1h。保證消煮過程中洗滌劑濃度不變。

(7)淋洗

消煮結束，停止加熱和攪拌，取出濾袋，輕輕擠干多余溶液，加2000mL預先加熱好的(85-90℃)去離子水，重復2次，共淋洗3次。

(8)丙酮處理

最后一次淋洗后，將濾袋從濾袋支架上取下來，輕輕擠壓去掉多余的水。然后將濾袋放入250mL燒杯中，加丙酮至覆沒濾袋，浸泡3-5min，然后取出并輕輕擠壓去掉多余的丙酮。)

(9)烘干

在通風櫥中展開濾袋，讓其自然干燥。完全干燥后放入105℃烘箱烘干6h， 在丙酮完全揮發(fā)掉之前不能把濾袋放入烘箱中。

(10)稱重

從烘箱中取出濾袋，直接放入干燥器中冷卻至室溫，然后稱重(m₂)。

(11)中性洗滌纖維(NDF)計算

試樣中中性洗滌纖維(中性洗滌纖維主要包括半纖維素、纖維素、木質素和灰分)質量分數按以下公式計算：

NDF(％)＝(m_2—(m₁×C₁))×100/m

m₁：為空袋質量(g)。

m：為樣品質量(g，DM)。

m₂：為提取處理后樣品殘渣+濾袋質量(g，DM)。

C₁：為空白袋子校正系數(烘干后質量m₃/原來質量m₀)。

(12)中性洗滌纖維降解率(NDFD)計算

未接種培養(yǎng)物的NDF作為起始NDF。NDFD(％)＝[(起始NDF﹣剩余NDF)/起始NDF]×100。

2.2.7厭氧真菌降解秸稈產乙醇量的測定

樣品處理將發(fā)酵后的樣品在7000r/min轉速離心5min，得上清液，再將上清液抽真空過0.45μm微孔濾膜，置冰箱備用。取待測樣品10mL于50mL容量瓶中，甲醇定容，再將待測定液在3000r/min下離心10min后過0.45μm有機濾膜，備用。甲醇為樣品的稀釋劑。正丙醇作為乙醇定量分析的內標物。乙醇(色譜純，CAS：64-17-5，西隴化工股份有限公司)，甲醇(色譜純，CAS：67-56-1，北京化工廠)，正丙醇(色譜純，CAS71-23-8，天津市津科精細化工研究所)。

氣相色譜儀(Agilent 7890A)，FID檢測器(美國AGILENT公司)，Chemstation化學工作站，7683B自動進樣器(美國AGILENT公司)，AG-1602型空氣泵(北京科普生分析科技有限公司)，HG-1803型高純氫氣發(fā)生器(北京科普生分析科技有限公司)。色譜條件為：色譜柱HP-INNOWAX毛細管柱(30m×0.25mm×25μm)，FID檢測器溫度220℃，氫氣流速40mL/min，空氣流速400mL/min，尾吹(N₂)流速30mL/min，進樣口溫度200℃，分流比為20∶1，柱流速為1mL/min，柱溫平衡時間0.5min，程序升溫60℃(保持1min)，以10℃/min升至120℃(保持1min)，進樣量1μL。該測定方法的乙醇回收率在97.3-107.1％之間，重復性實 驗的相對標準偏差(RSD)為4.11％。

2.3試驗結果

2.3.1厭氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸稈產氣量

真菌Piromyces Yak TZF以小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈為底物的總產氣量分別為：150mL/g DM，180mL/g DM和163mL/g DM。

2.3.2厭氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸稈酶活

真菌Piromyces Yak TZF以小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈為底物的木聚糖酶分別為：4100mU,3980mU和3510mU,濾紙酶活分別為：151.5mU,131.0mU,和90.5mU,阿魏酸酯酶分別為：9.1mU,5.5mU和4.0mU,乙酰酯酶分別為：108.0mU,99.7mU和92.0mU,香豆酸酯酶分別為：0.35mU,0.38mU和0.39mU。

2.3.3厭氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸稈的纖維降解率

真菌Piromyces Yak TZF以小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈為底物的干物質降解率IVDMD為：62.1％,67.7％和65.3％。真菌Piromyces YakTZ以小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈為底物的中性洗滌纖維降解率為：40.3％，44.1％和46.8％

2.3.4厭氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸稈所產乙醇量

真菌純培養(yǎng)Piromyces Yak TZF降解3種秸稈(小麥秸稈，玉米秸稈和水稻秸稈)產生大量代謝產物，包括氫氣，乙酸，乳酸和乙醇，其中所產乙醇量尤為突出，明顯高于目前厭氧真菌產乙醇量的報道，而且產量達到近年工業(yè)生產乙醇的工業(yè)用菌株所產乙醇量，見下表1(真菌純培養(yǎng)Piromyces Yak TZF降解秸稈產生乙醇量的測定)。

表1

注：^a，^b，^c，^d表示統(tǒng)計學差異性(p<0.05)。

總結以上實驗表明：來自天祝放牧牦牛瘤胃真菌真菌純培養(yǎng)Piromyces Yak TZF是高效降解秸稈者，降解秸稈的同時能夠有效轉化廉價木質纖維素—秸稈產生大量乙醇，以小麥秸稈為底物在7天培養(yǎng)期內產生最高乙醇濃度達到260.3mM，高于所有以前厭氧真菌產乙醇量的報道，并達到工業(yè)產菌株生產乙醇量，證明了天祝放牧牦牛瘤胃純培養(yǎng)真菌菌株PiromycesYak TZF高效降解小麥秸稈的同時能夠轉化秸稈為大量乙醇的顯著優(yōu)勢和重要的工業(yè)生產乙醇的應用前景。