本發(fā)明涉及一種通過(guò)重組而獲得新的基因的技術(shù)。

背景技術(shù)：

溶菌酶，又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

目前，與人類(lèi)生活密切相關(guān)的溶菌酶主要雞蛋清溶菌酶，廣泛來(lái)源于禽類(lèi)的蛋清，其來(lái)源廣泛，純化工藝簡(jiǎn)單，是認(rèn)識(shí)最為清楚，也是唯一得到工業(yè)化應(yīng)用的溶菌酶，但存在過(guò)敏性和活性低等缺點(diǎn)。

人溶菌酶（hLZ）是溶菌酶家族的成員之一，作為人體的非特性免疫物質(zhì)之一，人溶菌酶在全身粘膜組織中廣泛表達(dá)，包括淚液、唾液、鼻粘液、尿液、消化液、汗水及人的乳汁，發(fā)揮著抗菌消炎的重要功能。同時(shí)作為一種免疫因子，人溶菌酶尤其在中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分泌物中發(fā)揮作用。

相比蛋清溶菌酶，人溶菌活性最高，為雞蛋清溶菌酶的3倍，有更高的熱穩(wěn)定性，無(wú)過(guò)敏性，臨床應(yīng)用時(shí)無(wú)刺激性及副作用等突出優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)潛力巨大。但是，目前人溶菌酶來(lái)源渠道狹小，主要來(lái)源于母乳和血液的提純，限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

通過(guò)基因工程技術(shù)，重組人溶菌酶已在酵母、植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中等系統(tǒng)中獲得表達(dá)，其中以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺表達(dá)最為突出。1994年Mega等首先進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)人溶菌酶的研究，他們利用alpha s1 酪蛋白啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)溶菌酶的表達(dá)，表達(dá)量為0.2到0.7克/升；1998年，Mega等的研究結(jié)果進(jìn)一步表明轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人溶菌酶的奶樣具有同標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶相同的活性。這些結(jié)果暗示著溶菌酶的轉(zhuǎn)基因研究在乳品加工業(yè)有著巨大的應(yīng)用前景。2006年，國(guó)內(nèi)首次利用體細(xì)胞克隆的方法獲得了乳腺特異性表達(dá)重組人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因牛。雖然如此，已有技術(shù)所獲得的人溶菌酶主要是乳腺表達(dá)，而不能實(shí)現(xiàn)身體多個(gè)部位的表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種能在動(dòng)物體多個(gè)組織中全身性表達(dá)重組人溶菌酶的方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，

hLZ BAC克隆，GenBank號(hào)為RP11-72P21，含有人溶菌酶基因組序列和完整的調(diào)控序列（來(lái)源于Genome Systems公司）；

SW102菌株、PL452質(zhì)粒（來(lái)源于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院生物資源分部）；

Taq DNA聚合酶購(gòu)于大連TaKaRa公司，引物合成及序列測(cè)定由上海生工完成；兔抗人溶菌酶多克隆抗體購(gòu)自US Biological公司，人溶菌酶ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Biomedical Technologies公司；酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟采用《分子克?。ǖ谌妫返募夹g(shù)，

第一步：人溶菌酶BAC克隆選擇Genome Systems公司的GenBank號(hào)為RP11-72P21作為目標(biāo)hLZ BAC克隆，該hLZ BAC克隆含有155kb 5’調(diào)控區(qū)—CPSF6冗余基因，4.8kb hLZ基因組序列和6kb 3’調(diào)控區(qū)；

第二步：冗余基因CPSF6的去除：為避免冗余基因CPSF6對(duì)hLZ基因的干擾，通過(guò)重組方法去除冗余基因CPSF6，具體步驟如下：

（1）hLZ BAC克隆通過(guò)電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入SW102菌株（該菌株已轉(zhuǎn)入了Red重組系統(tǒng)所需要的exo蛋白、bet蛋白、gam蛋白）；SW102菌株是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院生物資源分部提供，

（2）選擇CPSF6冗余基因外顯子1為重組置換區(qū)域，設(shè)計(jì)同源臂，以pBR322-loxP-Neo質(zhì)粒設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增loxP-Neo基因片段，同時(shí)將同源臂和引物連接，獲得包含如下重組引物的PCR產(chǎn)物，F(xiàn)-Neo：5’-TCT CTG AGG ATG CAG AAA CAA GAC ATT GTT TTT GGT CAT ACG CCG TTC ACA GAA TGC CCG CCG CCT CCA TCC AGT CTA TT -3’；R-Neo：5’-TTA TCT GTG GCT CCA AAA GTC AAA GGA CTT GTT GCA AAT GAG CCC GCA CCT CAG TCG CCTGTC GCC GCA TAC ACT ATT CT-3’，其中，CG CCT CCA TCC AGT CTA TT和GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT為引物，其他為同源臂，

（3）重組引物所得到的PCR產(chǎn)物，切膠回收后，電擊轉(zhuǎn)入含有含hLZ BAC的SW102菌株中，發(fā)生重組，獲得去除冗余基因的人溶菌酶pBAC-hLZ-Neo。

本發(fā)明與已有技術(shù)相比，所獲得的該人溶菌酶pBAC-hLZ-Neo經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，具有能在身體的多個(gè)部位都有表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1表達(dá)載體pBAC-hLZ-Neo構(gòu)建和鑒定；

(A) 利用重組方法，通過(guò)Neo抗性的置換去除冗余基因CPSF6；

(B) PCR鑒定陽(yáng)性克隆，發(fā)生重組的菌株（編號(hào)1-10）均能擴(kuò)增出2.5kb條帶，NC為陰性對(duì)照；

(C) 測(cè)序法進(jìn)一步確認(rèn)重組的發(fā)生，箭頭所指為重組發(fā)生的起始位置；

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠的分子生物學(xué)檢測(cè)；

(A) PCR檢測(cè)，陽(yáng)性小鼠14、18、22、30可擴(kuò)增637bp的條帶，陰性對(duì)照NC無(wú)條帶；

(B) Southern blot檢測(cè). 陽(yáng)性質(zhì)粒P和陽(yáng)性小鼠14、18、22、30可雜出3.3kb條帶，陰性對(duì)照NC無(wú)條帶；

(C) RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠重組人溶菌酶的轉(zhuǎn)錄，重組人溶菌酶在心H、肝Li、脾Sp、肺Lu、腎K、胃St、腸I、肌肉Mu等組織中均有RNA水平的轉(zhuǎn)錄；

圖3 重組人溶菌酶表達(dá)檢測(cè)與活性分析；

(A) Western blot檢測(cè)重組人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因小鼠各個(gè)組織器官中的表達(dá)，重組人溶菌酶在脾Sp、肺Lu、腎K、胃St、腸I、肝Li等組織中均有蛋白水平的表達(dá)。

(B)Western blot檢測(cè)重組人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的表達(dá). 陽(yáng)性對(duì)照PC上揚(yáng)兩為1 μg，陰性對(duì)照NC為普通小鼠血清，1-7為轉(zhuǎn)基因小鼠的血清（上樣量為10 μL）。

(C) 瓊脂平板法測(cè)定血清中表達(dá)的重組人溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，陽(yáng)性對(duì)照PC上樣量為1 μg，陰性對(duì)照NC為普通小鼠血清，1-7為轉(zhuǎn)基因小鼠的血清（上樣量為10 μL）。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

第一步：人溶菌酶BAC克隆選擇Genome Systems公司的GenBank號(hào)為RP11-72P21作為目標(biāo)hLZ BAC克隆，該hLZ BAC克隆含有155kb 5’調(diào)控區(qū)—CPSF6冗余基因，4.8kb hLZ基因組序列和6kb 3’調(diào)控區(qū)，

hLZ BAC克隆的提取采用試劑盒（NucleoBond BAC 100 Kit）提供的方法和步驟進(jìn)行,粗提hLZ BAC克隆則是在加完P(guān)1、P2和P3等溶液后，直接用0.7倍體積的異丙醇沉淀,粗提的hLZ BAC克隆用于SW102菌株的電擊轉(zhuǎn)化:

第二步：冗余基因CPSF6的去除：為避免冗余基因CPSF6對(duì)hLZ基因的干擾，通過(guò)重組方法去除冗余基因CPSF6，步驟如下：

（1）hLZ BAC克隆通過(guò)電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入SW102菌株（該菌株已轉(zhuǎn)入了Red重組系統(tǒng)所需要的exo蛋白、bet蛋白、gam蛋白）；SW102菌株是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院生物資源分部提供，

（2）選擇CPSF6冗余基因外顯子1為重組置換區(qū)域，設(shè)計(jì)同源臂，以pBR322-loxP-Neo質(zhì)粒設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增loxP-Neo基因片段，同時(shí)將同源臂和引物連接，獲得包含如下重組引物的PCR產(chǎn)物，F(xiàn)-Neo：5’-TCT CTG AGG ATG CAG AAA CAA GAC ATT GTT TTT GGT CAT ACG CCG TTC ACA GAA TGC CCG CCG CCT CCA TCC AGT CTA TT -3’；R-Neo：5’-TTA TCT GTG GCT CCA AAA GTC AAA GGA CTT GTT GCA AAT GAG CCC GCA CCT CAG TCG CCTGTC GCC GCA TAC ACT ATT CT-3’，其中，CG CCT CCA TCC AGT CTA TT和GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT為引物，其他為同源臂，

pBR322-loxP-Neo質(zhì)粒是由pBR322質(zhì)粒（pBR322為常規(guī)質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室保留）和PL452質(zhì)粒（由國(guó)外同行贈(zèng)與，具體網(wǎng)址為http://recombineering.ncifcrf. gov/Plasmid.asp#PL452）雜合而成，擴(kuò)增PL452質(zhì)粒的loxP-Neo片段，通過(guò)PstI酶切位點(diǎn)，插入到pBR322質(zhì)粒中的抗性AMP基因內(nèi)（破壞了AMP基因），從而構(gòu)建該質(zhì)粒，

（3）重組引物所得到的PCR產(chǎn)物（該P(yáng)CR產(chǎn)物含兩端各帶60 bp的同源臂（或稱(chēng)重復(fù)序列，即與BAC的特定序列相重復(fù)，相當(dāng)于可以鉚釘在BAC的具體位置上），以及LoxP-Neo基因片段），切膠回收后，電擊轉(zhuǎn)入含有hLZ BAC的SW102菌株中，發(fā)生重組，獲得去除冗余基因的人溶菌酶pBAC-hLZ-Neo:

具體步驟如下：

A、 SW102菌株的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備

a．初始培養(yǎng)，用槍頭挑取SW102菌株單克隆，加入盛有5ml LB培養(yǎng)基的滅菌管中，32℃，220rpm，過(guò)夜培養(yǎng)；

b．?dāng)U大培養(yǎng)，將過(guò)夜培養(yǎng)液按大約1:70的比例轉(zhuǎn)移到盛有50ml LB培養(yǎng)基的滅菌三角瓶中，32℃，220rpm，待OD600達(dá)到0.4時(shí)，停止培養(yǎng)；

c．將菌液平均分成2份，第一份于42℃（嚴(yán)格）水浴，220rpm，振蕩孵育15min；第二份為對(duì)照，32℃水浴，220rpm，振蕩孵育15min；

d．將2份菌液在冰水浴中快速冷卻10min以上，之后于4℃，5000rpm離心10min；

e．棄上清，重新將管置于冰水浴中，加入1ml冰上預(yù)冷的ddH₂O，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)重懸，再加入10ml預(yù)冷的ddH₂O，快速倒轉(zhuǎn)幾次，4℃，5000rpm離心5min；

f．棄上清，重新將管置于冰水浴中，加入1ml冰上預(yù)冷的10%甘油+90% ddH₂O，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)重懸，再加入10ml預(yù)冷的10%甘油+90% ddH₂O，快速倒轉(zhuǎn)幾次，4℃，5000rpm離心5min；

g．棄上清，加入100-200 μL預(yù)冷的10%甘油+90% ddH₂O，重懸沉淀；

h．分裝，每0.5ml的小管中加入40μl，液氮速凍后-80℃保存，備用，該保存、備用物即為感受態(tài)細(xì)胞；

B、感受態(tài)細(xì)胞與PCR產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化

a．取40 μl含有hLZ BAC克隆的感受態(tài)細(xì)胞與5μl 的PCR產(chǎn)物混合，然后將混合物轉(zhuǎn)移至冰浴充分的0.2 cm電擊杯中，注意不能形成氣泡；

b．將電擊杯周?chē)乃粮?，置于電擊槽中，啟?dòng)細(xì)菌的電擊程序；

c．聽(tīng)見(jiàn)“噗”的一聲后，電擊轉(zhuǎn)化結(jié)束，向電擊杯中加入0.8ml SOC培養(yǎng)基，用槍吸出，置于1.5ml 離心管，32℃水浴振蕩恢復(fù)培養(yǎng)2小時(shí)；

d．涂布于含有相應(yīng)的抗生素的LB板上，32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；

e．PCR和Cracking法鑒定陽(yáng)性克?。?/p>

C、帶有同源臂的PCR長(zhǎng)片段引物設(shè)計(jì)

帶有同源臂的長(zhǎng)片段引物一般結(jié)構(gòu)為：在普通PCR引物的5’端各帶上大約50-60bp的同源序列，并可在同源臂和普通引物之間引入酶切位點(diǎn)等序列，修飾hLZ BAC克隆同源臂的設(shè)計(jì)如下：選取目標(biāo)序列的5’端緊鄰約50-60bp序列作為5’同源臂，加到一條普通引物的5’端；選取目標(biāo)序列的3’端緊鄰約50-60bp序列，取其反向互補(bǔ)序列加到另一條普通引物的5’端，作為3’同源臂；

D、陽(yáng)性克隆的PCR和測(cè)序法鑒定

使用P-Neo雜合引物（F：5’-CGC CAG AGA CAA CCT ACT GT-3’和R：5’- GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT -3’）鑒定重組后的陽(yáng)性克隆菌株，如果發(fā)生了重組則可擴(kuò)增出2.5 kb的條帶，未發(fā)生重組的菌株不能擴(kuò)增出條帶（圖1.B）；

PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序，和原序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，重組后產(chǎn)生的DNA置換位點(diǎn)和目標(biāo)設(shè)計(jì)完全一致（圖1.C）；人溶菌酶全身性表達(dá)載體pBAC-hLZ-Neo構(gòu)建完成。

檢測(cè)例1：轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(cè)

A、顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠

轉(zhuǎn)基因小鼠制備過(guò)程參見(jiàn)《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南》（納吉等著，2004，科學(xué)出版社），制備流程如下：

B、轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)

取2-3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴組織樣，提取基因組（常規(guī)動(dòng)物DNA提取方法）。以提取的基因組為模板，用P-hLZ-637引物（5’-TTA TAC ACA CGG CTT TAC-3’和5’-CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT-3’）在陽(yáng)性小鼠中可以擴(kuò)增出637bp的片段，以普通小鼠（非轉(zhuǎn)基因小鼠）基因組為模板的PCR反應(yīng)為陰性對(duì)照，以載體pBAC- hLZ-Neo為模板的反應(yīng)為陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增條件為94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，60sec；35個(gè)循環(huán)，1.0%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。

PCR結(jié)果顯示，共獲得4只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠，編號(hào)為：14，18，22，30（圖2.A，）。

C、轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern blotting 檢測(cè)

將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的F0代5只轉(zhuǎn)基因小鼠，絞尾部組織并提取基因組，取大約10μg用EcoRI內(nèi)切酶消化，以EcoRI酶切的野生型小鼠基因組為陰性對(duì)照，EcoRI酶切的pBAC- hLZ-Neo注射載體片段為陽(yáng)性對(duì)照，雜交探針是引物P-hLZ-637的PCR產(chǎn)物，長(zhǎng)度為637bp，由地高辛（DIG）標(biāo)記。將各種樣品低壓慢速電泳，采用堿轉(zhuǎn)移方法將DNA從瓊脂糖轉(zhuǎn)移至尼龍膜，將尼龍膜有DNA的一面朝內(nèi)，卷成筒狀放入雜交管中，加入預(yù)雜交液，于65℃預(yù)雜交不短于1小時(shí)，加入經(jīng)過(guò)加熱變性的DIG標(biāo)記的探針，65℃雜交12-16小時(shí)，洗膜后用保鮮膜包好，放進(jìn)暗盒中，暗室中壓上X光片，觀察結(jié)果。

Southern blotting結(jié)果顯示，陽(yáng)性信號(hào)呈現(xiàn)3.3kb的雜交帶（圖2.B）。Southern blotting 檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因小鼠。

檢測(cè)例2：重組人溶菌酶全身性表達(dá)檢測(cè)與分析

A、重組人溶菌酶全身性表達(dá)RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用將RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)重組人溶菌酶在小鼠各個(gè)臟器中的表達(dá)。檢測(cè)組織包括：心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉，以及泌乳時(shí)期的乳腺，使用融合引物以避免干擾，融合引物為Exon1-2-F（5’-ATC AGC CTA GCA AAC TGG AT-3’）和 Exon4-R（5’-CTC CAC AAC CTT GAA CAT AC-3’），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為322 bp，并以小鼠持家基因GAPDH（引物為F：5’-AGG CCG GTG CTG AGT ATG TC-3’和R：5’-TGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3’）為系統(tǒng)誤差對(duì)照（530 bp）。

結(jié)果表明，重組人溶菌酶在心、肝、脾、肺、腎、腸、肌肉等組織中均有RNA水平的轉(zhuǎn)錄（圖2.C）。

、重組人溶菌酶全身性表達(dá)Western blotting 檢測(cè)

采集小鼠組織和血清，其中組織包括：心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、腸道等。提取小鼠組織總蛋白或直接上樣小鼠血清，使用15% 的SDS-PAGE凝膠電泳，再進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)，設(shè)置陽(yáng)性（顯示14.7kDa條帶）和陰性對(duì)照。

結(jié)果顯示：重組人溶菌酶在心、肝、脾、肺、腎、腸、肌肉等組織，以及血清均有蛋白質(zhì)水平的表達(dá)（圖3.A和B），這與RT-PCR結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了重組人溶菌酶的全身性表達(dá)模式。

、血清中重組人溶菌酶表達(dá)量的ELISA檢測(cè)

用ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的重組人溶菌酶含量，試劑盒為美國(guó)Biomedical Technologies公司“Human Lysozyme ELISA Kit”。每次測(cè)量濃度每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)，取兩個(gè)重復(fù)均值作為一次測(cè)量值，每個(gè)樣品至少測(cè)濃度三次，計(jì)算濃度均值和均值標(biāo)準(zhǔn)差。

結(jié)果顯示，F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因小鼠18、22、30號(hào)血清中重組人溶菌酶的表達(dá)量分別為：2.09 ± 0.68、2.28 ± 0.87、2.60 ± 0.86 mg/L（表1）。

實(shí)施例3：血清中重組人溶菌酶的生物活性檢測(cè)

A、瓊脂平板法

分別取100uL溶壁微球菌（M. Lysodeikticus）均勻涂布于1.5%瓊脂粉底肉湯培養(yǎng)平板上，在培養(yǎng)基上分別放入加有10uL血清的濾紙片，普通小鼠的血清為陰性對(duì)照（NC），陽(yáng)性對(duì)照為人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品，PC為1ug人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品。設(shè)置4次重復(fù)，28℃培養(yǎng)36小時(shí)，觀察抑菌圈的直徑，可直觀判斷重組人溶菌酶的表達(dá)量及活性（圖3.C）。

結(jié)果顯示，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因小鼠1-7號(hào)的血清樣品均能產(chǎn)生明顯的抑菌圈，表明重組人溶菌酶具有生物活性。

、比濁度法

將溶壁微球菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后以5000rpm離心菌液，收集菌體。用66mM磷酸鉀緩沖液沖洗菌液2次，5000rpm離心。用66mM磷酸鉀緩沖液溶解菌體至OD450為0.8左右。將紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)打開(kāi)預(yù)熱，調(diào)制OD450。用蛋清溶菌酶制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各濃度為1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 and 8000 U/mL。取1uL乳汁樣品，加99uL緩沖液。在光程為1cm的石英比色杯中加入2.5mL混好的菌懸液，迅速加入100uL配置好的樣品。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算抑菌活性均值和均值標(biāo)準(zhǔn)差。

結(jié)果顯示，F(xiàn)1代轉(zhuǎn)基因小鼠18、22、30號(hào)血清中重組人溶菌酶的抑菌活性分別為：685.77 ± 171.43、521.49 ± 165.57、632.87 ± 47.14 U/mL（表1）

檢測(cè)例4：重組人溶菌酶在腸道中表達(dá)對(duì)菌群的影響

為檢測(cè)重組人溶菌酶在腸道中表達(dá)是否會(huì)影響菌群結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因小鼠和普通小鼠各11只，出生后于21天處死，取腸道內(nèi)容物進(jìn)行8種類(lèi)型的菌群培養(yǎng)檢測(cè)，8種菌群為：總厭氧菌、總好氧菌，雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌2種，梭菌、腸球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌等有害菌6種。

結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠腸道中的雙歧桿菌數(shù)量極顯著升高（P<0.001），沙門(mén)氏菌數(shù)量極顯著降低（P<0.001），其它6種類(lèi)型的菌群數(shù)量無(wú)顯著性差異（表2）。這表明，重組人溶菌酶在腸道中表達(dá)增高了有益菌雙歧桿菌的數(shù)量，同時(shí)降低了有害菌沙門(mén)氏菌的數(shù)量，這將有利于轉(zhuǎn)基因小鼠的腸道健康。

表1 人溶菌酶轉(zhuǎn)基因小鼠整體情況

表2 重組人溶菌酶在腸道中表達(dá)對(duì)8種菌群的影響 (單位：logCFU/g)

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SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院

劉, 燊

<120> 一種動(dòng)物全身性表達(dá)重組人溶菌酶的方法

<130> 2017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

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ccgcctccat ccagtctatt 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ttatctgtgg ctccaaaagt caaaggactt gttgcaaatg agcccgcacc tcagtcgcct 60

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<212> DNA

<213> 人工引物

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<212> DNA

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