本發(fā)明屬于醫(yī)藥合成
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種制備利那洛肽的方法。
背景技術(shù)：
：利那洛肽(Linaclotide)是一種口服的選擇性鳥苷酸環(huán)化酶C受體激動劑，主要作用于腸道，可誘導(dǎo)腸液分泌，用于治療以便秘為主的腸應(yīng)激綜合癥及長期便秘。其商品名為Linzess，由美國IronwoodPharma公司研發(fā)，2012年8月獲美國FDA批準上市。利那洛肽是鳥苷酸環(huán)化酶C(GC-C)激動劑的膠囊制劑，每日口服一次。血漿濃度檢測不到的利那洛肽與腸道GC-C結(jié)合后，導(dǎo)致細胞內(nèi)和細胞外環(huán)鳥苷酸(cGMP)濃度升高。細胞內(nèi)cGMP升高可以刺激腸液分泌，加快胃腸道移行，從而增加排便頻率。細胞外cGMP濃度升高可以降低痛覺神經(jīng)的靈敏度，而根據(jù)動物模型研究顯示，這可減低腸道疼痛。利那洛肽是首個具有此種作用機制的便秘治療藥物。利那洛肽是一個14-氨基酸多肽，含有三個二硫鍵，其序列結(jié)構(gòu)如下：結(jié)構(gòu)式(氨基酸序列)利那洛肽中三個二硫鍵的成環(huán)反應(yīng)是本產(chǎn)品合成的難點?，F(xiàn)有文獻報道的合成路線主要有三種：方法一：隨機氧化(randomoxidation)法通過常規(guī)固相多肽合成方法在樹脂上合成線性肽，酸解脫除保護基和樹脂載體得到利那洛肽線性粗肽，然后在液相緩沖溶液中，采用隨機氧化(randomoxidation)的方法一步形成三對二硫鍵(見反應(yīng)示意圖)。如專利CN201310556661.8、CN201510314459.3、CN201610739783.4、CN201610644791.0、CN201610328263.4、CN201210375246.8、CN201310223243.7、WO2014188011A2、WO2016038497A1等。固相偶聯(lián)-隨機氧化反應(yīng)示意圖如圖5所示。方法一中,合成只使用了一種Cys的保護基團，最后只需一步隨機氧化成環(huán)得到目標產(chǎn)物，操作簡單。但是，對于需要定位形成三對二硫鍵的肽來說，隨機氧化會得到許多二硫鍵錯配的異構(gòu)體，盡管可以通過一些緩沖溶液體系來使得氧化過程中盡可能大的轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕朔肿?，但是始終無法避免其他錯配異構(gòu)體的產(chǎn)生。這種操作容易使得目標肽粗肽純化困難，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。同時，采用該方法進行氧化，需要在高度稀釋的溶液中，對外界條件比如溫度等的依賴性也非常高，在不同的環(huán)境下，自然氧化所得到的產(chǎn)品收率相差也非常大，很難進行大規(guī)模生產(chǎn)。方法二：分步氧化法(StepOxidation)使用三對帶有不同側(cè)鏈保護基的Cys，通過固相合成在樹脂上合成線性肽，然后采用分步脫除氧化的方法形成三對二硫鍵。如專利CN201510391880.4，采用了Trt、Acm、tBu三對不同的保護基。固相偶聯(lián)-分步氧化反應(yīng)示意圖如圖6所示。專利CN201310617050.X采用了Trt、Acm、Hmq三對不同的保護基。分步氧化法，半胱氨酸采用三對不同的保護基，合成成本高；碘為強氧化劑，會破壞前面形成的兩對二硫鍵，形成錯配產(chǎn)物；使用不同側(cè)鏈保護基的半胱氨酸，生產(chǎn)成本高；分步氧化操作繁復(fù)，收率極低。方法三：通過固液結(jié)合、片段縮合，合成線性肽，然后通過隨機氧化或分步氧化合成利那洛肽。如專利CN201510467488.3、CN201410357720.3、WO2015022575A2、WO2012118972A2。這種方法操作繁復(fù)，效率低，成本高。綜上，隨機氧化法錯配幾率高，雜質(zhì)多且不易控制，氧化須在稀溶液中，盡量采用溫和的氧化體系，環(huán)化時間長，生產(chǎn)效率低；分步氧化法，半胱氨酸需要三對不同的保護基，合成操作步驟繁復(fù)，產(chǎn)率低，成本高。隨機氧化的氧化產(chǎn)物粗品純度一般在30～40％左右。分步氧化法制備，若每一步都用純品做，最后所得產(chǎn)物純度也僅可達到50～60％，同時其步驟繁瑣。因而需要尋找一條更為簡單、高效的合成路線，本發(fā)明方法較好地解決了這一問題，適合工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。鑒于上述和/或現(xiàn)有的技術(shù)空白，提出了本發(fā)明。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：包括，對含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體進行氧化反應(yīng)，得到利那洛肽；其中，所述含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體，其為存在第2、10位Cys的二硫鍵和第5、13位Cys的二硫鍵。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體，其為在第1、6位Cys上有保護基團。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體，其為對利那洛肽線性粗肽進行第2、10位Cys和第5、13位Cys進行氧化成環(huán)制得。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述利那洛肽線性粗肽，其為在第1、6位Cys上有保護基團。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述利那洛肽線性粗肽，其為利那洛肽樹脂裂解制得；其中，所述利那洛肽樹脂，其為1、6位Cys有共同的保護基團，2、10位和5、13位Cys上有Trt。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述氧化成環(huán)，pH為6.5～7.5，時間為10～14h。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述保護基團，其為tBu，Meb，Mob中的一種。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述保護基團，其為tBu。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述氧化反應(yīng)，包括，其針對tBu，具體為以TFA或5～20％DMSO中一種或多種為溶劑，溫度為15～30℃，時間為25～40min；其針對Meb，具體為以TFA或5～20％DMSO中一種或多種為溶劑，溫度為40～60℃，時間為3～4h；其針對Mob，具體為以體積比為94:5:1的TFA、DMSO、苯甲醚混合劑為溶劑，溫度為55～65℃，時間為30min～90min。作為本發(fā)明所述制備方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述裂解，其為以TFA、EDT、苯甲醚、苯甲硫醚和水為裂解液，其體積比為90:2.5:2.5:2.5:2.5；其利那洛肽樹脂同裂解液的體積比為1:8。本發(fā)明的有益效果：(1)該工藝反應(yīng)路線短，原料廉價易得，反應(yīng)條件溫和，減少了能耗，降低了生產(chǎn)成本。(2)相比于前人發(fā)表的路線，本路線的反應(yīng)選擇性與轉(zhuǎn)化率均更高，減少了原料的浪費，有較強的經(jīng)濟性。本發(fā)明提供的制備方法，最佳反應(yīng)時間為30min，所得產(chǎn)物純度可達85％。(3)減少了三廢的排放，綠色安全。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：圖1為所制備得的利那洛肽MS圖。圖2為所制備得的利那洛肽HPLC圖。圖3為所制備得的含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體的MS圖。圖4為所制備得的含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體的HPLC圖。圖5為固相偶聯(lián)-隨機氧化反應(yīng)示意圖。圖6為固相偶聯(lián)-分步氧化反應(yīng)示意圖。具體實施方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。其次，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。實施例1：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(tBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得22.95g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys(tBu)-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys(tBu)-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(tBu)的線性粗肽0.82g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速:9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到15mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，加入TFA(3ml)，5％DMSO，在15℃下反應(yīng)30分鐘，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為85％。實施例2：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(tBu)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(tBu)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(tBu)-OH(5.10g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得21.12g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys(tBu)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(tBu)-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(tBu)的線性粗肽0.78g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速：9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到14mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，加入TFA(3ml)，15％DMSO，在30℃下反應(yīng)25分鐘，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為48％。實施例3：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得23.12g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys-Cys(tBu)-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(tBu)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(tBu)的線性粗肽0.84g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速：9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到15mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，加入TFA(3ml)，20％DMSO，在25℃下反應(yīng)40分鐘，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為34％。實施例4：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(Meb)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Meb)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得24.65g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys(Meb)-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys(Meb)-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(Meb)的線性粗肽0.96g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速：9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到16mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，加入TFA(3ml)，5％DMSO，在40℃下，反應(yīng)4h，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為68％。實施例5：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Meb)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)Thr(tBu)-Gly-Cys(Meb)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(Meb)OH(5.71g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得24.86g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys(Meb)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Meb)-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(Meb)的線性粗肽0.93g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速：9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到15mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，加入TFA(3ml)，15％DMSO，在60℃下，反應(yīng)3h，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為42％。實施例6：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(Trt)-Cys(Meb)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Meb)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得25.24g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys-Cys(Meb)-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(Meb)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(Meb)的線性粗肽0.98g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速：9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到15mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，加入TFA(3ml)，20％DMSO，在50℃下，反應(yīng)3.5h，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為19％。實施例7：利那洛肽樹脂的制備H-Cys(Mob)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制備稱取10g替代度為1.14mmol/g的Wang樹脂于固相反應(yīng)器中，用DCM溶脹Wang樹脂20分鐘，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室溫反應(yīng)15分鐘。將樹脂洗滌抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂，測得樹脂替代度為0.426mmol/g。向樹脂中加入封閉試劑70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反應(yīng)10h，封閉剩余的氨基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。加入20％PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護基，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，得H-Tyr(tBu)-Wang樹脂；繼續(xù)加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室溫反應(yīng)2h。偶聯(lián)完成度可以使用Kaiser測試檢測；檢測通過后，用20％PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護基5+15min，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌。以此方法，依照目標產(chǎn)物對應(yīng)所須氨基酸序列，依次偶聯(lián)剩余的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護多肽樹脂。將此側(cè)鏈全保護多肽樹脂用20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min，DMF洗滌一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)15min，抽干，分別用DCM(1次)、MeOH(1次)與DMF(3次)洗滌，抽干，稱重得25.34g肽樹脂。利那洛肽線性粗肽的制備H-Cys(Mob)-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys(Mob)-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制備配置裂解液，其各組分體積比為TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5；將裂解液加入固相反應(yīng)器中，與上述5g肽樹脂(V肽樹脂:V切割液＝1:8)在室溫下震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚(V反應(yīng)液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，離心后收集白色固體沉淀，真空干燥，即得Cys(Mob)的線性粗肽1.02g。兩對二硫鍵中間體的制備取50mg粗肽，加入2M鹽酸胍(50ml),0.1M磷酸三鈉調(diào)節(jié)PH至7，室溫反應(yīng)12h,得到含兩對二硫鍵中間體(IV)。使用依利特半制備型HPLC對上述反應(yīng)液進行純化。使用C18(20mm*250mm)制備柱；流速:9ml/min；流動相：A相為水(1‰TFA)，B相為乙腈；分析條件：乙腈：5-20-30-95％，時間：0-5-45-50min。收集制備液，冷凍干燥，得到15mg兩對二硫鍵中間體(IV)。利那洛肽(I)的制備取10mg上述兩對二硫鍵中間體(IV)純品，以體積比為94:5:1的TFA、DMSO、苯甲醚混合劑為溶劑，溫度為60℃，時間為600min，得到利那洛肽(I)，進行質(zhì)譜分析，同時與標準品比對，結(jié)果正確。其HPLC純度為23％。由上述實施例可見，以tBu為保護基團，先完成第2、10位和第5、13位的Cys氧化成環(huán)，制得含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體，再進一步氧化成目標產(chǎn)物利那洛肽，該合成路線，其制備時間，和制備產(chǎn)品純度最優(yōu)。實施例1～3為一組，4～6為一組作比較，可見，對于含有兩對二硫鍵的利那洛肽中間體，其二硫鍵存在于2、10和5、13位時，效果最為優(yōu)異。這是因為，不同成環(huán)策略的選擇，由于其空間位阻，基團共軛體系等多方面的影響，會對反應(yīng)最終的氧化成利那洛肽有著復(fù)雜影響。一方面，優(yōu)先成鍵的基團本身具有空間位阻效應(yīng)，對進一步成環(huán)有阻礙作用，另一方面，優(yōu)先成鍵的基團有提供了更為穩(wěn)定的共軛體系，對目標氧化反應(yīng)起到了促進和鞏固的作用。綜合兩方面的復(fù)雜作用，最終，本發(fā)明提供的先制備存在2、10和5、13位的二硫鍵的中間體，再進一步制備目標產(chǎn)物，更為高效、經(jīng)濟。實施例1、4、7為一組作比較，可見，作為保護基團，tBu為保護基團合成方法，效果更為優(yōu)異。這是因為，tBu作為保護基團，其能夠提供恰當(dāng)?shù)目臻g位阻。一方面，保護基團對Cys起到足夠的保護作用，但是另外一方面，保護基團由于空間位阻及共軛體系吸電子等作用，對其他鍵位的鍵和還有負面的影響，最重要的是，保護基團在最終中間體向目標產(chǎn)物轉(zhuǎn)化時，要能夠穩(wěn)定的脫除。綜合幾方面的考慮，最終，本發(fā)明所優(yōu)選的tBu能夠呈現(xiàn)最佳的效果。上述試劑名稱縮寫全稱對照如下表1：表1-試劑名稱列表簡稱全稱DMFN,N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷DMAP4-二甲氨基吡啶DMSO二甲基亞砜DICN,N’-二異丙基碳二亞胺TFA三氟乙酸NMMN-甲基嗎啉HOBt1-羥基苯并三唑HOAtN-羥基-7-氮雜苯并三氮唑HBTU苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯HATU2-7(偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷EDT1,2-乙二硫醇PIP哌啶GuHCl鹽酸胍TSP磷酸三納應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3