本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的工程菌株及其構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鼠李糖脂是由假單胞菌或伯克氏菌類產(chǎn)生的一種生物表面活性劑，也是研究時(shí)間最長(zhǎng)、應(yīng)用技術(shù)最為成熟的一種生物表面活性劑。它在土壤、水體和植物中都自然存在，屬于一種糖脂類的陰離子表面活性劑，不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在堿性水溶液中也表現(xiàn)出良好的溶解特性。它兼具良好的化學(xué)和生物特性，具有油、水兩親性，可以降低水表面張力，可以作為潤(rùn)濕劑、乳化劑和發(fā)泡劑使用，無(wú)毒、能生物降解，在溫度、PH值及鹽度處于極端狀況下也可使用。

目前，工業(yè)上主要采用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)發(fā)酵法生產(chǎn)鼠李糖脂，而銅綠假單胞菌被認(rèn)為是三種最強(qiáng)人類條件致病菌之一，故限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用?；诖?，人們期望選擇利用相對(duì)安全的工業(yè)微生物進(jìn)行鼠李糖脂的生產(chǎn)，以降低其在生產(chǎn)中的潛在危害，拓展相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。已報(bào)到的有利用伯克氏菌Burkholderia、綠針假單胞菌Pseudomonas chlororaphis等非條件致病菌生產(chǎn)鼠李糖脂，但由于這些微生物遺傳背景相對(duì)不清晰且缺乏簡(jiǎn)便的遺傳操技術(shù)，很難進(jìn)一步提高鼠李糖脂的產(chǎn)量，無(wú)法滿足生產(chǎn)要求。人們也嘗試選擇非致病微生物如大腸桿菌通過(guò)異源表達(dá)來(lái)生產(chǎn)鼠李糖脂，而大腸桿菌作為一種“一般認(rèn)為安全(GRAS)”的模式生物，雖具有清晰的遺傳背景、成熟的遺傳操作技術(shù)及廣泛的工業(yè)應(yīng)用，是異源合成鼠李糖脂合適的選擇，但是其產(chǎn)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索，有關(guān)通過(guò)敲除銅綠假單胞菌的芳香族氨基酸合成相關(guān)基因5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA實(shí)現(xiàn)減毒，且將該減毒菌鼠李糖脂合成相關(guān)基因自轉(zhuǎn)運(yùn)酯酶基因EstA和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物基因RhlAB構(gòu)建到一個(gè)以pBBRI為復(fù)制子的多拷貝質(zhì)粒上，增加鼠李糖脂合成相關(guān)基因的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)增加鼠李糖脂產(chǎn)量的文獻(xiàn)或?qū)＠€未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前鼠李糖脂工業(yè)化生產(chǎn)菌株的高毒性或者低產(chǎn)量，本發(fā)明的目的是提供一株減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的工程菌株——重組綠膿桿菌工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用。

本發(fā)明所述減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌，其特征在于：該工程菌是其基因組中已敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)且含有過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的銅綠假單胞菌(Pseudomas aeruginosa)，命名為PAO1aroA；其中，所述過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明所述減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌的構(gòu)建方法，步驟是：

利用假單胞菌噬菌體的重組酶構(gòu)建的同源重組系統(tǒng)，將一段50bp-100bp的攜帶短同源臂的抗性基因DNA片段整合到銅綠假單胞菌(Pseudomas aeruginosa)的染色體上，實(shí)現(xiàn)敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)，獲得減毒銅綠假單胞菌，再構(gòu)建包含鼠李糖脂合成的轉(zhuǎn)運(yùn)酯酶基因EstA和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物基因RhlAB，慶大霉素抗性基因，接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT和一個(gè)廣譜型復(fù)制子pBBRI的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta，并將該過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入獲得的減毒銅綠假單胞菌中，即得到通過(guò)多拷貝質(zhì)粒增加該菌鼠李糖脂合成相關(guān)基因的拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)的減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌。

本發(fā)明所述減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌在工業(yè)化生產(chǎn)鼠李糖脂中的應(yīng)用。

本發(fā)明構(gòu)建的鼠李糖脂減毒高產(chǎn)的銅綠假單胞菌菌株，它不僅可以提高鼠李糖脂產(chǎn)量，而且毒性減低。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：通過(guò)敲除銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomas aeruginosa PAO1)的芳香族氨基酸合成相關(guān)基因5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA后，突變株毒性檢測(cè)證明該菌已減毒。同時(shí)，本發(fā)明將該減毒菌鼠李糖脂合成相關(guān)基因自轉(zhuǎn)運(yùn)酯酶基因EstA和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物基因RhlAB構(gòu)建到一個(gè)以pBBRI為復(fù)制子的多拷貝質(zhì)粒上，從而增加鼠李糖脂合成相關(guān)基因的拷貝數(shù)，最終達(dá)到增加鼠李糖脂產(chǎn)量的目的。這種方法也適用于其它細(xì)菌次生代謝產(chǎn)量的提高，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明構(gòu)建的鼠李糖脂減毒高產(chǎn)的銅綠假單胞菌菌株可以直接應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)鼠李糖脂，其產(chǎn)量完全可以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1.高效同源重組系統(tǒng)介導(dǎo)的aroA基因敲除。

(A)aroA基因敲除示意圖；攜帶同源臂和位點(diǎn)特異重組酶識(shí)別位點(diǎn)(LoxM)的慶大霉素抗性基因?qū)roA基因替換后，再誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶cre酶將loxM位點(diǎn)之間的慶大霉素抗性基因敲除。

(B)菌落PCR檢測(cè)基因敲除后的重組子，M:DL5000marker；1，2：慶大霉素抗性基因替換aroA基因，擴(kuò)增的PCR片段，大小1073bp。引物是aroA-chk-5和aroA-chk-3。

(C)菌落PCR檢測(cè)cre位點(diǎn)特異性重組后的重組子，M：DL5000；1：野生型的PAO1作為模板擴(kuò)增大小675bp，2：慶大霉素基因替換了aroA之后的PAO1作為模板擴(kuò)增大小是1257bp，3：Cre酶敲除慶大霉素抗性基因之后的PAO1作為模板，擴(kuò)增大小438bp。所用的引物是aroA-chk-5和aroA-chk-3。

圖2.野生株和突變株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定和毒性檢測(cè)。

(A)PAO1野生株和PAO1突變株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定。在OD₆₀₀的條件下測(cè)定菌體的濃度。紅色線代表PAO1野生株，藍(lán)色線代表PAO1突變株。結(jié)果顯示野生型菌株在轉(zhuǎn)接后2小時(shí)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，但是突變型菌株需要在轉(zhuǎn)接后5小時(shí)才能進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。

(B)PAO1野生株和PAO1突變株毒性檢測(cè)：藍(lán)色線代表PAO1突變株，結(jié)果顯示小鼠的存活率是100％。紅色線代表的是野生型的PAO1，在注射了野生型PAO1之后第9個(gè)小時(shí)，小鼠的存活率為0，小鼠全部死亡。

圖3.鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。

(A)構(gòu)建pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM的示意圖。

(B)pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-lox質(zhì)粒PVUII酶切圖；M：DL5000；1-20為20個(gè)重組子。其中1，3，4，8，9，10，11，16，17，18，20是正確的克隆。

(C)pBBRI-EstA-RhlAB-loxM-genta-oriT質(zhì)粒圖。

(D)pBBRI-EstA-RhlAB-loxM-genta-oriT質(zhì)粒PVUII酶切圖；M:DL5000；1-10為10個(gè)重組子，其中1，2，3，6，7，9，10為正確的克隆。

圖4.鼠李糖脂產(chǎn)量的測(cè)定。

(A)不同時(shí)間點(diǎn)的鼠李糖脂產(chǎn)量測(cè)定。

(B)鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制不同濃度的鼠李糖溶液，在421nm下測(cè)定OD值，以鼠李糖濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，真實(shí)的鼠李糖脂的產(chǎn)量應(yīng)是鼠李糖產(chǎn)量的3倍。

(C)根據(jù)(B)中數(shù)據(jù)得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們將(A)中第二天四株菌的OD421的值代入得到的公式中，計(jì)算出了第二天四株菌中鼠李糖脂的產(chǎn)量。

圖5.鼠李糖脂乳化實(shí)驗(yàn)結(jié)果照片：相等體積的甲苯和菌體發(fā)酵液的上清混合在一個(gè)試管中，渦旋混勻，然后靜置2小時(shí)。

其中：(A)PAO1突變株(pBBR1-rhlAB-estA)；(B)PAO1突變株(pBBR1-genta-kan)；(C)PAO1野生株(pBBR1-rhlAB-genta-estA)；(D)PAO1野生株(pBBR1-genta-kan)。

圖6.pBBR1-rhlAB-genta-estA質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)：顯示連續(xù)六天在無(wú)抗性篩選的條件下培養(yǎng)，外源質(zhì)粒沒(méi)有丟失。

具體實(shí)施方式

以下為具體實(shí)例，以便更好地理解本發(fā)明。

一般性說(shuō)明：如下實(shí)例所涉及的2x PrimerSTAR Max，購(gòu)于TaKaRa寶生物有限公司；重組酶表達(dá)質(zhì)粒pBBRI-rha-redgam-BAS-kan購(gòu)于德國(guó)GeneBridges公司；Cre酶表達(dá)質(zhì)粒pCM157購(gòu)于addgene(保藏號(hào)：Plasmid 45863)；pR6K-TnpA-oriT-kan購(gòu)于德國(guó)GeneBridges公司；pRK2013-kan購(gòu)于德國(guó)DSMZ(保藏號(hào)：DSM 5599)。操作完全按照相應(yīng)說(shuō)明書進(jìn)行。質(zhì)粒構(gòu)建中基因測(cè)序由華大基因公司完成。出發(fā)菌銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomas aeruginosa PAO1)購(gòu)于德國(guó)DSMZ(保藏號(hào)：DSM 1707)；PAO1基因見(jiàn)NCBI中發(fā)表的基因組全序列；Alg44-genta是慶大霉素抗性基因替換了Alg44基因的銅綠假單胞菌PAO1；DH10B購(gòu)于德國(guó)GeneBridges公司；HB101購(gòu)于德國(guó)DSMZ(保藏號(hào)：DSM 6201)。其他質(zhì)粒均通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入受體菌中。其他試劑和耗材購(gòu)自國(guó)內(nèi)各試劑公司。實(shí)施例中的其他實(shí)驗(yàn)方法及試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。

實(shí)施例1：減毒銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomas aeruginosa PAO1)的構(gòu)建

1.敲除aroA基因構(gòu)建減毒菌株

aroA基因編碼的5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶可以催化芳香族氨基酸的合成。芳香族氨基酸生物合成途徑是革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌共有的途徑，而哺乳動(dòng)物不具備該合成途徑，因此敲除aroA基因后，PAO1突變株將不會(huì)感染哺乳動(dòng)物。利用高效的同源重組系統(tǒng)，對(duì)綠膿桿菌PAO1染色體進(jìn)行遺傳操作，其原理為：利用攜帶同源臂和LoxM位點(diǎn)的慶大霉素抗性基因DNA片段將aroA基因敲除，aroA基因敲除過(guò)程如圖1所示。

本發(fā)明首先將重組酶表達(dá)質(zhì)粒pBBRI-rha-redgam-BAS-kan電轉(zhuǎn)進(jìn)入綠膿桿菌PAO1菌株中，對(duì)aroA基因進(jìn)行敲除(圖1A)。

電轉(zhuǎn)化步驟為：將PAO1在加有100μg/ml氨芐青霉素的LB中37℃培養(yǎng)過(guò)夜(OD600＝3～4)。將40μl過(guò)夜培養(yǎng)物(OD600＝3～4)轉(zhuǎn)接到加有合適抗生素的1.3ml LB中，置于Eppendorf thermomixer上37℃，950rpm培養(yǎng)2h(OD600＝0.35～0.4)。離心收集細(xì)胞，9,400g 30sec,2℃。棄上清，沉淀用1ml GH Buffer(10％蔗糖,2mM Hepes)懸浮。離心收集細(xì)胞，9,400g 30sec,2℃。棄上清，沉淀用1ml GH Buffer懸浮。重復(fù)離心、重懸、再離心，用20μl 1ml GH Buffer懸浮細(xì)胞。加入2μl pBBRI-rha-redgam-BAS-kan質(zhì)粒，將細(xì)胞和質(zhì)粒的混合液轉(zhuǎn)入1mm電激杯中，用Eppendorf electroporator 2510進(jìn)行電擊，電壓1350V,電容10μF,電阻600Ω。加1ml LB至電激杯中，洗滌細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至扎孔的1.5ml管中，置于Eppendorf thermomixer上37℃，950rpm培養(yǎng)1.5h。最后將適量的菌液涂布到加有合適抗生素(350μg/ml卡那霉素)的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

aroA基因敲除具體過(guò)程如下：

PCR擴(kuò)增攜帶同源臂(≈75bp)和位點(diǎn)特異性重組酶Cre識(shí)別位點(diǎn)LoxM位點(diǎn)的慶大霉素抗性基因。

所用引物為：

aroA-genta-loxM-3：

cacccgcggcgtagagcccggcgagcaacaggcaggacttcacctgggcgctggccatcggcatgtcgtaatgcaAGCTGAATTACATTCCCAA CCG；

aroA-genta-loxM-5：

caagtcgatttcccatcgctcgatcatgctcggctccctggccgaaggcaccaccgaagtggagggcttcctcgaCAACTTAAATGTGAAAGTGGGTC

(引物中小寫字母為同源臂，本次以及之后描述均如此)。

然后將PCR產(chǎn)物通過(guò)電轉(zhuǎn)進(jìn)入表達(dá)重組酶的PAO1中，在重組酶的介導(dǎo)下，攜帶同源臂的慶大霉素抗性基因與綠膿桿菌染色體上aroA基因發(fā)生同源重組，替換掉基因組上的aroA基因。然后根據(jù)同源臂外側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物aroA-chk-5：CCTGATTTATCTGGCCCAGC；aroA-chk-3：GCGCTCAACTTGTGCCCGG，對(duì)慶大霉素篩選出來(lái)的單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)(圖1B)。將Cre表達(dá)質(zhì)粒pCM157電轉(zhuǎn)進(jìn)入菌落PCR鑒定正確的克隆中，加入1μl IPTG(100mg/ml)誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組酶Cre后，在Cre的介導(dǎo)下，慶大霉素抗性基因從染色體中刪除，挑取無(wú)抗克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖1C)。菌落PCR具體做法如下：

PCR擴(kuò)增體系:體系50l

PCR程序：98℃預(yù)變性4min；94℃變性15s；52-60℃(根據(jù)引物Tm值設(shè)定)退火15s；72℃延伸(延伸時(shí)間根據(jù)所擴(kuò)增的長(zhǎng)度確定，1Kb/5s)；循環(huán)30次；最后72℃，10min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的引物是aroA-chk-5和aroA-chk-3。模板是搖起來(lái)的菌液，菌液能明顯看到渾濁，然后取出100μl用1000ml無(wú)菌水洗兩遍，洗凈培養(yǎng)基。然后用沸水煮15min。冷卻即可當(dāng)模板使用。

2.突變株毒性檢測(cè)

分別測(cè)定敲除aroA基因缺失突變的PAOI和野生株P(guān)AO1的生長(zhǎng)曲線：將上述菌株在1300μl LB培養(yǎng)基中37℃，950rpm中過(guò)夜培養(yǎng)，每株菌設(shè)三個(gè)平行組。第二天從過(guò)夜菌中取出100μl菌液，加900μl LB稀釋10倍測(cè)定菌體濃度。將兩種過(guò)夜菌統(tǒng)一稀釋成OD₆₀₀＝0.085，然后每隔兩個(gè)小時(shí)測(cè)定OD₆₀₀，一直測(cè)到菌體處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期。最終確定敲除aroA基因的和野生型綠膿桿菌PAO1的生長(zhǎng)曲線。

結(jié)果顯示野生型菌株在轉(zhuǎn)接后2小時(shí)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，但是突變型菌株需要在轉(zhuǎn)接后5小時(shí)才能進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期(圖2A)。

在確定了兩株菌的生長(zhǎng)曲線之后，我們對(duì)野生株和突變株進(jìn)行了毒性檢測(cè)。

毒性實(shí)驗(yàn)BALB/c小鼠購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，6-8周齡、無(wú)菌條件飼養(yǎng)。用PBS對(duì)PAO1野生株和突變株進(jìn)行洗滌后，分別將兩種菌按照5×10⁸CFU的劑量注入小鼠腹腔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組20只小鼠。注射后前12個(gè)小時(shí)內(nèi)，每隔1個(gè)小時(shí)觀察一次小鼠的生存情況。

由實(shí)驗(yàn)圖2B可以看出，注射PAO1野生株的實(shí)驗(yàn)小鼠在第5個(gè)小時(shí)開(kāi)始有小鼠死亡，在注射后5-6小時(shí)內(nèi)死亡率最高。在第9個(gè)小時(shí)，注射PAO1野生株的小鼠全部死亡，而注射PAO1突變株的小鼠注射后240小時(shí)后仍全部存活。實(shí)驗(yàn)證明，敲除aroA基因的PAO1已經(jīng)減毒。

實(shí)施例2鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的構(gòu)建

1.鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的構(gòu)建

在實(shí)驗(yàn)證實(shí)突變株已經(jīng)成功減毒基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高構(gòu)建的突變株的鼠李糖脂產(chǎn)量。具體結(jié)合圖3對(duì)突變株的再構(gòu)建的過(guò)程進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

首先通過(guò)四重重組構(gòu)建了質(zhì)粒pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM(圖3A)：

將pR6K-TnpA-oriT-kan用NcoI和MscI雙酶切，酒精沉淀備用；

然后以RhlAB-5：ttaagacccactttcacatttaagttgcaattgTCAGGACGCAGCCTTCAGCCATCG和RhlAB-3：tcacgctgccgcaagcactcagggcgcaagggctgctaaaggaagcggaacctagGCCTTTTCCGCCAACCCCTCGCTG為引物，PAO1基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到RhlAB片段；以RABE-Genta-3：cgatggctgaaggctgcgtcctgacaattgCAACTTAAATGT GAAAGTGGGTCTTAA；RABE-Genta-5：ggtatagccgggaatcagtatctagAGCTGAATTACATTCCCAACCG為引物，模板為Alg44-genta(慶大霉素抗性基因替換了Alg44基因的綠膿桿菌PAO1)的基因組，擴(kuò)增得到RABE-Genta片段；以EstA-5：cgtaaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaactcgaggtaccGTTTCAGAAGTCCAGGCTCAG和EstA-3：cggttgggaatgtaattcagctctagaTACTGATTCCCGGCTATACC為引物，PAO1基因組為模板，擴(kuò)增得到EstA片段；最后將上面4步得到的4個(gè)產(chǎn)物共轉(zhuǎn)化進(jìn)入誘導(dǎo)后的GBdir-gyrA462-pir116細(xì)菌中，得到產(chǎn)物pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM(圖3B)。

將質(zhì)粒pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM構(gòu)建好之后進(jìn)行三親接合轉(zhuǎn)移：首先將供體菌DH10B(pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM),輔助菌HB101(pRK2013-kan)和受體菌(PAO1突變株)過(guò)夜培養(yǎng)后各取40μl接種到1.3ml LB抗性培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。然后每種培養(yǎng)物取1ml離心，棄上清，沉淀重懸于300μl新鮮LB培養(yǎng)基中。各取50μl細(xì)菌重懸物，在EP管中混勻后，滴在LB-plate中央，晾干，37℃孵育4h，然后轉(zhuǎn)移到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天用接種環(huán)刮取一環(huán)細(xì)菌涂布在PMM(慶大霉素30ug/ml)平板上37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，最后挑單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。但是沒(méi)有鑒定出正確的克隆，我們將質(zhì)粒重新?lián)Q了一個(gè)復(fù)制子：分別擴(kuò)增了pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM上的oriT還有pBBRI復(fù)制子，酶切得到EstA-RhlAB-Genta。三重重組構(gòu)建了質(zhì)粒pBBRI-EstA-RhlAB-loxM-genta-oriT(圖3C和3D)。具體做法：NheI和EcoRI酶切pR6K-TnpA-oriT-EstA-RhlAB-Genta-loxM得到EstA-RhlAB-Genta(酶切回收大片段，膠跑到底部再切膠，膠回收具體做法參照天根試劑盒說(shuō)明書)。oriT-ha-3：tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtg aatttacgtagcatgcCTTTTCCGCTGCATAACCCT和oriT-ha-5：ccccgaaaagtgccacctgggatgaCATATGCGGCCAG CCTCGCAGAGCAGGATTC為引物，pR6K-TnpA-oriT-loxM-Genta-ladA為模板，擴(kuò)增oriT。pBBRI-ha-5：gcggccggcggggaacagcgaggggttggcggaaaaggcctagggaattcCTACCGGCGCGGCAGCGTGA和pBBRI-ha-3:gaat cctgctctgcgaggctggccgcatatgTCATCCCAGGTGGCACTTTTCGGGG為引物，質(zhì)粒pBBRI-rha-redgam-BAS-kan為模板擴(kuò)增pBBRI。將前面得到的三個(gè)片段在GB05-dir(改造自GB2005，染色體上整合了阿拉伯糖誘導(dǎo)的recE、recT、redγ和recA基因)里邊做三重重組，慶大霉素抗性(4μg/ml)篩選，得到pBBRI-EstA-genta-RhlAB-oriT。

然后電轉(zhuǎn)進(jìn)PAO1突變株中，通過(guò)多拷貝質(zhì)粒增加PAO1突變株中的鼠李糖脂生物合成中相關(guān)基因的拷貝數(shù)，達(dá)到增加鼠李糖脂產(chǎn)量的目的。

2.鼠李糖脂產(chǎn)量測(cè)定

首先將增加鼠李糖脂合成相關(guān)基因的減毒PAO1在LB培養(yǎng)基(low salt，1％Triptone；0.5％yeast extract；0.1％NaCl)中培養(yǎng)，得到種子液。然后1：20轉(zhuǎn)接進(jìn)MS發(fā)酵培養(yǎng)基(perL:15g NaNO₃；1.1g KCl；1.1g NaCl；0.00028g FeSO₄·7H₂O；3.4g KH₂PO₄；4.4g K₂HPO₄；0.5g MgSO₄·7H₂O；0.5g yeast extract和5mL of a trace element solution containing(per L):0.29g ZnSO₄·7H₂O；0.24g CaCl₂·4H₂O；0.25g CuSO₄·5H₂O and 0.17g MnSO₄·H₂O)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了三種芳香族氨基酸，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(各50μg/ml)。在無(wú)抗性篩選的情況下，設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)組是PAO1突變株(pBBR1-rhlAB-genta-estA)和PAO1野生株(pBBR1-rhlAB-genta-estA)，對(duì)照組是PAO1突變株(pBBRI-genta-kan)和PAO1野生株(pBBRI-genta-kan)。發(fā)酵6天，每天取出1ml發(fā)酵液來(lái)提取鼠李糖脂，確定鼠李糖脂產(chǎn)量最高的時(shí)間。發(fā)酵到第二天四株菌OD₄₂₁的值在六天中都是最高的，而且PAO1突變株(pBBRI-rhlAB-genta-estA)的鼠李糖脂產(chǎn)量最高(圖4A)。

根據(jù)鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鼠李糖的濃度，發(fā)酵液中鼠李糖脂的濃度換算為鼠李糖濃度的3倍。將第二天測(cè)的OD₄₂₁的值帶入所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4B)的公式中，計(jì)算出第二天PAO1突變株(pBBRI-rhlAB-genta-estA)、PAO1突變株(pBBRI-genta-kan)、PAO1野生株(pBBRI-rhlAB-genta-estA)、PAO1野生株(pBBRI-genta-kan)的鼠李糖脂的產(chǎn)量(圖4C)。

3.鼠李糖脂乳化實(shí)驗(yàn)

比較四株菌發(fā)酵六天的的鼠李糖脂產(chǎn)量之后，進(jìn)一步做了鼠李糖脂的甲苯乳化實(shí)驗(yàn)。

將37℃發(fā)酵了2天的PAO1突變株(pBBRI-rhlAB-genta-estA)、PAO1突變株(pBBRI-genta-kan)、PAO1野生株(pBBRI-rhlAB-genta-estA)和PAO1野生株(pBBRI-genta-kan)的四株菌各取出3ml發(fā)酵液，離心取上清，然后與相同體積的甲苯渦旋混勻，再靜置2小時(shí)觀察四株菌發(fā)酵液上清的乳化情況(圖5)。

由圖5可以進(jìn)一步確定aroA基因敲除的PAO1(pBBR1-rhlAB-genta-estA)鼠李糖脂的產(chǎn)量明顯的比野生型的綠膿桿菌PAO1增加了。

4.外源質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)

上述的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)PAO1突變株通過(guò)質(zhì)粒增加鼠李糖脂生物合成相關(guān)基因的拷貝數(shù)，可以顯著提高鼠李糖脂產(chǎn)量。我們?cè)跓o(wú)抗性篩選的情況下對(duì)含有外源質(zhì)粒的突變型菌株進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步確定外源質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

具體做法：每天取出0.1ml發(fā)酵菌液來(lái)稀釋涂LB和LB慶大霉素抗性(20 g/ml)的板，連續(xù)涂6天，確定發(fā)酵液培養(yǎng)六天后質(zhì)粒的丟失情況，結(jié)果顯示外源質(zhì)粒pBBR1-rhlAB-estA在突變型菌株可以中穩(wěn)定存在(圖5)。證實(shí)已經(jīng)成功構(gòu)建了一株高產(chǎn)鼠李糖脂的減毒的重組綠膿桿菌工程菌(Pseudomas aeruginosa)PAO1。該菌可以更好的在鼠李糖脂生產(chǎn)工業(yè)上普遍應(yīng)用。

序列表

<110> 山東大學(xué)

<120>一株減毒高產(chǎn)鼠李糖脂的工程菌株及其構(gòu)建與應(yīng)用

<141> 2017-3-10

<160> 1

<210> 1

<211> 8781

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta

<222>（1）…（8781）

<400>1

ctaccggcgc ggcagcgtga cccgtgtcgg cggctccaac ggctcgccat cgtccagaaa 60

acacggctca tcgggcatcg gcaggcgctg ctgcccgcgc cgttcccatt cctccgtttc 120

ggtcaaggct ggcaggtctg gttccatgcc cggaatgccg ggctggctgg gcggctcctc 180

gccggggccg gtcggtagtt gctgctcgcc cggatacagg gtcgggatgc ggcgcaggtc 240

gccatgcccc aacagcgatt cgtcctggtc gtcgtgatca accaccacgg cggcactgaa 300

caccgacagg cgcaactggt cgcggggctg gccccacgcc acgcggtcat tgaccacgta 360

ggccgacacg gtgccggggc cgttgagctt cacgacggag atccagcgct cggccaccaa 420

gtccttgact gcgtattgga ccgtccgcaa agaacgtccg atgagcttgg aaagtgtctt 480

ctggctgacc accacggcgt tctggtggcc catctgcgcc acgaggtgat gcagcagcat 540

tgccgccgtg ggtttcctcg caataagccc ggcccacgcc tcatgcgctt tgcgttccgt 600

ttgcacccag tgaccgggct tgttcttggc ttgaatgccg atttctctgg actgcgtggc 660

catgcttatc tccatgcggt agggtgccgc acggttgcgg caccatgcgc aatcagctgc 720

aacttttcgg cagcgcgaca acaattatgc gttgcgtaaa agtggcagtc aattacagat 780

tttctttaac ctacgcaatg agctattgcg gggggtgccg caatgagctg ttgcgtaccc 840

ccctttttta agttgttgat ttttaagtct ttcgcatttc gccctatatc tagttctttg 900

gtgcccaaag aagggcaccc ctgcggggtt cccccacgcc ttcggcgcgg ctccccctcc 960

ggcaaaaagt ggcccctccg gggcttgttg atcgactgcg cggccttcgg ccttgcccaa 1020

ggtggcgctg cccccttgga acccccgcac tcgccgccgt gaggctcggg gggcaggcgg 1080

gcgggcttcg ccttcgactg cccccactcg cataggcttg ggtcgttcca ggcgcgtcaa 1140

ggccaagccg ctgcgcggtc gctgcgcgag ccttgacccg ccttccactt ggtgtccaac 1200

cggcaagcga agcgcgcagg ccgcaggccg gaggcttttc cccagagaaa attaaaaaaa 1260

ttgatggggc aaggccgcag gccgcgcagt tggagccggt gggtatgtgg tcgaaggctg 1320

ggtagccggt gggcaatccc tgtggtcaag ctcgtgggca ggcgcagcct gtccatcagc 1380

ttgtccagca gggttgtcca cgggccgagc gaagcgagcc agccggtggc cgctcgcggc 1440

catcgtccac atatccacgg gctggcaagg gagcgcagcg accgcgcagg gcgaagcccg 1500

gagagcaagc ccgtagggcg ccgcagccgc cgtaggcggt cacgactttg cgaagcaaag 1560

tctagtgagt atactcaagc attgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc 1620

gtcgagccgg ttggacacca aaagggaggg gcaggcatgg cggcatacgc gatcatgcga 1680

tgcaagaagc tggcgaaaat gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag 1740

cgcgagacgc ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc 1800

agcaccgatg aagcgatggg ccgactgcgc gagttgctgc cagagaagcg gcgcaaggac 1860

gctgtgttgg cggtcgagta cgtcatgacg gccagcccgg aatggtggaa gtcggccagc 1920

caagaacagc aggcggcgtt cttcgagaag gcgcacaagt ggctggcgga caagtacggg 1980

gcggatcgca tcgtgacggc cagcatccac cgtgacgaaa ccagcccgca catgaccgcg 2040

ttcgtggtgc cgctgacgca ggacggcagg ctgtcggcca aggagttcat cggcaacaaa 2100

gcgcagatga cccgcgacca gaccacgttt gcggccgctg tggccgatct agggctgcaa 2160

cggggcatcg agggcagcaa ggcacgtcac acgcgcattc aggcgttcta cgaggccctg 2220

gagcggccac cagtgggcca cgtcaccatc agcccgcaag cggtcgagcc acgcgcctat 2280

gcaccgcagg gattggccga aaagctggga atctcaaagc gcgttgagac gccggaagcc 2340

gtggccgacc ggctgacaaa agcggttcgg caggggtatg agcctgccct acaggccgcc 2400

gcaggagcgc gtgagatgcg caagaaggcc gatcaagccc aagagacggc ccgagacctt 2460

cgggagcgcc tgaagcccgt tctggacgcc ctggggccgt tgaatcggga tatgcaggcc 2520

aaggccgccg cgatcatcaa ggccgtgggc gaaaagctgc tgacggaaca gcgggaagtc 2580

cagcgccaga aacaggccca gcgccagcag gaacgcgggc gcgcacattt ccccgaaaag 2640

tgccacctgg gatgacatat gcggccagcc tcgcagagca ggattcccgt tgagcaccgc 2700

caggtgcgaa taagggacag tgaagaagga acacccgctc gcgggtgggc ctacttcacc 2760

tatcctgccc gggtcgacgc cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc 2820

aaaatcctgt atatcgtgcg aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc 2880

cgaagcaggg ttatgcagcg gaaaaggcat gctacgtaaa ttcactggcc gtcgttttac 2940

aacgtcgtga ctgggaaact cgaggtaccg tttcagaagt ccaggctcag cgccaggctg 3000

acgctctgct gggtatcgtc ctcgcccttg cgccagttgt agccgccgcg cagcgacagc 3060

tccggcgcca gcttctggct gaagccgagt gagacgcggt tgagatggtc ctgcggggtg 3120

tagccttcga gggtgaagcg attgcccggc aggctgttga gggacatggt caggtcctgg 3180

gtgtcgtcct cgtactcacg ttcgtgggcg tactcggcga acagctgggt atcgctgccg 3240

aacgcgtact tgccttgcag gccggcgccc aggcgcttcg agctgcgctt ctggtcgtcg 3300

tagtcgagcg cggtggcgct ggcgcccttc tcggaatagc cgtcgacctc gacccgtgca 3360

tagtcggcgc tgacgaacgg cgacaggtgc cagggactgt cggcctgctg ggcgatgtcg 3420

tagcccaggc gcgcgctgaa cgcccacagg tggccgttgg tgtcgccttt ctcgctgcgc 3480

tcgccgccgc ccagggcgaa cttgcgcttc aggtcgtcgt agtcgaggta gccgccggtc 3540

aacgccgcgt cggcccacca gcggttttcc tggtactgca cgaaggcgct ggccatgtag 3600

ctgttcatcc ggtagtcgga atccttggcg ccggcttcca gcttctgccg gtagaaaccg 3660

gcggcgaccc cggcgcgcca ggcctcgtcg atgcggtagc tgccaccaag ggtcaggttg 3720

tagccgttgc cgtcgccgct ggcggcgctg tcctgggagt cgaagtccag gcgctggcca 3780

ccgccgccga cgaagccgcg ccactggccg acgttctgcc agttctccca gtccgcctgc 3840

cactggctgc gcagttcgtc ctggtaggca cgcagggtgc cgtgggccat ttccggcagc 3900

agggtcagct cccagggcgc cgacagcagc gaataggtgt agtcggcgat caggcgctgg 3960

ccggtgatgg tcgggtgcac gctgtcgttg aacagcaatt tgctcgggtc gggcgtgctg 4020

ccgttgatcc cgtaggtcgg gttcatggtg cagccgttgc cgctgaaaca ggtgccgatc 4080

aggttctggt cggcggccag gccgaaggaa gccgggttgg ccatgccttc cttgagcagc 4140

agcgggatgt tcaacggaat gacgttggcg ccggcctggc tcaactgggc ggtcagctcg 4200

gcgttgaacg tgccgctgag ttggctggcg aaaggctgca agggaccacc gaaggtagcc 4260

ggggtcaggc ccaggtcggg caacagccag accacgatgt agcgcgcgcc ggcctgctgc 4320

agggcctgca cgctatccac caggcgaccg gcggcctgtt gggcctggac gtcgttgagg 4380

atgcgcccct ggagaaagtc gttgccgccg ccggtgatgt agtacaacgc gttcgggtcg 4440

gcacccaggc cctggcgggc acggtccacc aggtagccat cgcggctgcg caggagggta 4500

ttgtcgcgct cgatcagcga gccgttggcc gcggtgatcg agtcgtagat ctgatcggtc 4560

cggtagccgc ccaccgccca gttgttgccg tcggcgatgc cctgctgggc gttgaccggc 4620

gaggtcgagg cagccaggtc acccggggcg atgccgagct gattgccgag cagcatgggc 4680

gcggtcggtc cgaagatctc gccgctgccg ttctggtagg tcgggccgac ccggttggtg 4740

aaacgcgagg tgcttccggc ggggccggca ggatcgggga actgcccggc atcgctgagg 4800

ctgtcgccga acaccaccag cgtcgaatag ggcgaaggag cagcctgcgg ggcggtggac 4860

agcgaagcca gcaggcaggc cgctaccagt ggcttgagcg ccattctgat cattctctta 4920

ctccatgatt tgtttttatt gtcgggccgc cgcgtcgtcg gcatgcgccc cggggcccgt 4980

cgtaaagcct cctcagccga acagcatagc gcggaaccgg ctcatggctt gttcggcgag 5040

gaacgcagca ggctcattgc cattattacc agcagagcga cccccagcag aagtaccgcc 5100

cacaggccga tcttcttcca gtcgctaccc ggtgccggcg ccgcgaccgc catggccacc 5160

tccagcggtt cgcccaggct ggcgctaccc agggtggcgc gcttgctctc ggtatagccg 5220

ggaatcagta tctagagctg aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa ctggcgggct 5280

accgttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgaaggca cgaacccagt tgacataagc 5340

ctgttcggtt cgtaaactgt aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact ggtccagaac 5400

cttgaccgaa cgcagcggtg gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt gttatgactg 5460

tttttttgta cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa gcgcgttacg ccgtgggtcg 5520

atgtttgatg ttatggagca gcaacgatgt tacgcagcag caacgatgtt acgcagcagg 5580

gcagtcgccc taaaacaaag ttaggtggct caagtatggg catcattcgc acatgtaggc 5640

tcggccctga ccaagtcaaa tccatgcggg ctgctcttga tcttttcggt cgtgagttcg 5700

gagacgtagc cacctactcc caacatcagc cggactccga ttacctcggg aacttgctcc 5760

gtagtaagac attcatcgcg cttgctgcct tcgaccaaga agcggttgtt ggcgctctcg 5820

cggcttacgt tctgcccagg tttgagcagc cgcgtagtga gatctatatc tatgatctcg 5880

cagtctccgg cgagcaccgg aggcagggca ttgccaccgc gctcatcaat ctcctcaagc 5940

atgaggccaa cgcgcttggt gcttatgtga tctacgtgca agcagattac ggtgacgatc 6000

ccgcagtggc tctctataca aagttgggca tacgggaaga agtgatgcac tttgatatcg 6060

acccaagtac cgccacctaa caattcgttc aagccgaata acttcgtata atgtatgcta 6120

tacgaacggt attaagaccc actttcacat ttaagttgca attgtcagga cgcagccttc 6180

agccatcgag catccccctc cctatgacaa cgttcgacca cctgggccgc tttaccgcaa 6240

gcgatactgt gcggttgtga caattccatg aaacgccgac aggccgccgc catggccggg 6300

tcctcgagca agcgccacag cgccccgcgc aactcctgct cgcgcaacgg cacgcccagg 6360

cgcatcccgc agccgagccg gaccagccgt tcggcattgt cgaactggtc gtgggcacag 6420

ggcagcagca cctgcggcac ccccgccgcc aaggctaggc tcatggcgcc gataccgccc 6480

ggatggacca gcccggcgca cgatggcagc aaggctccca gtggcgcgta ggcgcgctgc 6540

agcacgtggt tcggcaagcc gcgcagcggt tcctggccgg cgccggtgag gaagatccca 6600

cgcgcgccga ggcgttccag cgcgcgcagg gccatggcgt agaagtcgcc ctgcaggtgt 6660

tcggtcgagc cctgggtgaa caccagcggc cggctgccct gatcgagaaa gcgttgcagt 6720

tcgtcgtcga gcggggtccc cgggatactg ccgtcgaaca gcgggaagcc ggtcatgtgc 6780

aggggttgcg gccaatcctg ctggggcggc gcgaaccagg ccgggaacag gcagaccacg 6840

ccctgcggcg aatgcatcca ttgggtgaag atgcgcttca ccggcgtttc caggccgacc 6900

ttgcggcgca ccgcgttgat ctccggcgcg caggtgcgat ccagcttgaa gcgctcgatg 6960

cagcgccaga gcagcttgcg catcgccagc ggcatctgct cgggcacgtt gaacttgggg 7020

tgtaccggcg gcaggtgcgc cgacaacagg gtcgatggcg agacctgcgc ggacaggtag 7080

ggaatcccgt acttctcgtg agcgatgcgt gcgcccagcg cccatagcga gccgaccacc 7140

acgatgtcgt catggcgctg cgccgagacg tactcgtaga ccggctcgat catcccggcg 7200

atggcttgcc agagcacgcc gaaggacgtc ttggggtccc acaggcgcgg atcgcccatg 7260

gtccggcggt aggtcagttc gtcgctcagc gggacgaacg cgatgccgtg ctgctccacc 7320

gcgtcgcgaa acaccgggat ggtgcagagg ctcacgcggt gcccgcgcag tttcagggtc 7380

cgggccaggc cgatgaaggg aaatacgtcg ccggccgagc cgatggcgat gaggatggcg 7440

tgcatggggc tactccgtgc gttatgcaac cgcaaagccc ggccaggccg ggtcttcgca 7500

ggtcaagggt tcaggcgtag ccgatggcca tctcgtggaa tcccgccgcg cgttccgccc 7560

gctgcggctc cggttgcttc agcaggtgct cgagcagggc gcggtgcacg cgtaccgctg 7620

ccagcttgga ctccaggtcg aggaaatgcc cggtgccctc cacccgcgag aaactgcagt 7680

gcggcaggta gtcgcggaac tggcgggcgt cctcggcggt ggtgtattcg tcccagctgc 7740

cgttgatgaa atgcacgtgg ctctggatcc gctccaggca agccaagtag ccccgatcgt 7800

tgagcgccag cacctggtcg atgtgaaagc gcgcctgctc gtattcgccg gtggccagcg 7860

aagccatgtg ctgatggttg ctggctttca ggcgctgcgg caggtatttg ccgacggtct 7920

cgttgagcag atggccgatc gccgacttgt cgtccagctc gatcagcgcc tgcgcccgcc 7980

cgacgtagtc gagcatcgcc tggttcagtc caggggcgaa tgccatcacc accgagctgc 8040

ggatgccgcg cggattgcgc gacagcgcca gcagcgtgga gataccgccc caggacgcgg 8100

agaccaggtg attgacctcg aagcgctcga tcagcgccag gaggatttcc acctcgtcgt 8160

ccttggtgat caacccgcgc tgcgggttgt gctgacgcga ctgcccggcg aagggcaggt 8220

cgaacagcac cacgttgaaa tgttcggcca ggcacttgca ggtccgggcg aacgaggcgg 8280

tggtcgccat cgcgccgttg accagcatca ccgtgctgcg cccgggatcc tgcccaacgc 8340

gctcgacatg tacccgcagg cccttgcaaa ccgataccaa cagactttcg cgccgcattt 8400

cacacctccc aaaaattttc gaacaggcaa acagctatcg ctgccacggg tatcccggca 8460

ttacgtagag ttcgttctta ttgttcgaac ggcagacaag taactcagcg gccatccgcg 8520

cggaccagcc acggcggatg cgtacccctt caggcgaggg gcttgtgtgg gtcttgcaga 8580

tcggcctgcg caaacgattg gcgtccgtgt tcacgcgtag ccgatgaaca ctttttagcc 8640

aattcgaaag ctaacggtaa ctgccagatt tcacaggacg ggcggccgcc tgcgcataag 8700

cccctgcccg cccgcgataa ggcgtgccag agcggccggc ggggaacagc gaggggttgg 8760

cggaaaaggc ctagggaatt c 8781

<210> 2

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>引物 aroA-genta-loxM-3

<222>（1）…（97）

<400> 2

cacccgcggc gtagagcccg gcgagcaaca ggcaggactt cacctgggcg ctggccatcg 60

gcatgtcgta atgcaagctg aattacattc ccaaccg 97

<210> 3

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物aroA-genta-loxM-5

<222>（1）…（98）

<400> 3

caagtcgatt tcccatcgct cgatcatgct cggctccctg gccgaaggca ccaccgaagt 60

ggagggcttc ctcgacaact taaatgtgaa agtgggtc 98

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>引物 RhlAB-5

<222>（1）…（57）

<400> 4

ttaagaccca ctttcacatt taagttgcaa ttgtcaggac gcagccttca gccatcg 57

<210> 5

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 引物RhlAB-3

<222>（1）…（79）

<400> 5

tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag ggctgctaaa ggaagcggaa cctaggcctt 60

ttccgccaac ccctcgctg 79