本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標志物、試劑盒及應用，特別是涉及與抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應相關的尚未公開的SNP標志物及其組合、試劑盒以及它們的應用，屬于生物基因工程領域。
背景技術：
：結核病可謂是傳染病中的一個最大災難——全世界每年會有上百萬人因該病致死，是當前導致發(fā)展中國家居民(尤其是兒童)死亡的主要疾病之一。藥物化療是當前治療結核病的主要手段，常用的藥物為異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)。雖然藥物化療對于結核病的臨床治療效果較好，但是在治療過程中出現的藥物不良反應(adversedrugreactions，ADR)，影響了抗結核治療效果和患者健康。其中，抗結核藥物肝毒性反應(anti-tuberculosisdruginducedhepatotoxicity，ATDH)是最嚴重的常見抗結核ADR。既往研究認為年齡、體重、性別、合并用藥、營養(yǎng)狀況等因素會影響ATDH的發(fā)病。隨著遺傳領域中藥物基因組學的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)在揭示個體不同的表型性狀、以及對于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應的研究中受到人們的重視，有關SNP與ATDH個體差異的關系的研究越來越深入，且多聚焦于N-乙酰轉移酶2基因(N-acetyltrangerase2，NAT2)。NAT2是治療結核病的常用藥物異煙肼(isoniazid，INH)代謝過程中的主要代謝酶。遺傳學研究顯示，NAT2的乙?；x型(快、中、慢乙?；x型)主要由其編碼區(qū)功能多態(tài)性位點及其單體型(快、中、慢乙酰化代謝型)決定。功能學實驗證明，部分編碼區(qū)SNP突變等位基因相對其野生型等位基因所產生的氨基酸改變，減低了NAT2的表達量和/或其乙?；富钚?。目前已經公開的相關研究有：“N-乙酰基轉移酶2及谷胱甘肽S轉移酶M1基因多態(tài)性與抗結核藥物性肝損傷的關系研究”，安慧茹等，《中國防癆雜志》，2014年1月，第36卷第1期，第14－20頁)公開了NAT2的rs1805158、rs1801280、rs72554617、rs1799930、rs1799931多態(tài)性位點與抗結核藥致肝損傷相關，統(tǒng)計的患者為接受異煙肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺聯合治療后造成肝損傷的患者，所使用的方法為對每個SNP位點與肝損傷的相關性進行單獨分析，沒有公開將某些SNP組成一組時與藥物肝損傷的關聯是否更高；WO2015109608A1公開了NAT2的rs1041983、rs1495741SNP及其組合與抗結核藥異煙肼、利福平、吡嗪酰胺中任一種或其組合造成的肝損傷相關，并公開了一些包含NAT2rs1041983或rs1495741以及XO基因rs2295475或rs1884752SNP的組合與藥物肝損傷的相關性；CN106119363A公開了N-乙酰轉移酶2基因(N-acetyltrangerase2，NAT2)的7個SNP位點(rs1801279、rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208和rs1799931)的組合可以用于抗結核藥物肝損傷易感基因型檢測。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于提供尚未公開的、與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP標志物，以更加全面、準確地分子遺傳標記抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應，從而進行分子標記輔助選擇和用藥預測，實現個體化用藥，減少藥物不良反應。本發(fā)明的目的還在于提供上述SNP標志物在抗結核藥物肝毒性反應方面非診斷的應用。本發(fā)明還提供了一種評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于通過準確檢測上述與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP標志物，以更加全面、準確評估抗結核藥物肝毒性反應風險。為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：本發(fā)明提供了與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP標志物，所述的SNP標志物是包括FLT3基因SNP位點和NAT2基因SNP位點的組合，所述的FLT3基因SNP位點是rs9319408，所述NAT2基因SNP位點是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一個或多個。進一步地，上述SNP標志物組合與VAV2基因SNP位點rs679106、XO基因SNP位點rs1429372和IL6基因SNP位點rs2069852中一個或多個相組合，可以實現更準確地標記抗結核藥物引起藥物肝毒性反應的目的。更進一步地，以上所有情況還可以與其它的NAT2基因的與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP位點及其組合(如：NAT2基因的SNP位點rs1041983或rs1495741，或者兩者的組合)相組合，可以更準確地標記抗結核藥物引起藥物肝毒性反應。上述SNP標志物的特異性擴增引物的引物序列可以分別為：rs9319408的引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；rs679106的引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；rs1429372的引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；rs2069852的引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；rs4921914的引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；rs10103029的引物序列為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；rs7816847的引物序列為SEQIDNo.28和SEQIDNo.29；rs1041983的引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；rs1495741的引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35。進一步地，對應于上述SNP標志物的特異性擴增引物，其特異性延伸引物的引物序列可以分別為：rs9319408的引物序列為SEQIDNo.12；rs679106的引物序列為SEQIDNo.15；rs1429372的引物序列為SEQIDNo.18；rs2069852的引物序列為SEQIDNo.21；rs4921914的引物序列為SEQIDNo.24；rs10103029的引物序列為SEQIDNo.27；rs7816847的引物序列為SEQIDNo.30；rs1041983的引物序列為SEQIDNo.33；rs1495741的引物序列為SEQIDNo.36。本發(fā)明還提供上述SNP標志物在抗結核藥物肝毒性反應方面非診斷的應用，如應用于制備評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒。本發(fā)明還提供了一種評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于檢測與抗結核藥物肝毒性反應相關的至少如下的SNP標志物：所述的SNP標志物是包括FLT3基因SNP位點和NAT2基因SNP位點的組合，所述的FLT3基因SNP位點是rs9319408，所述NAT2基因SNP位點是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一個或多個?？蛇x地，該試劑盒含有如下特異性擴增引物序列：所述的SNP位點rs9319408的引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；所述的SNP位點s4921914的引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；所述的SNP位點rs10103029的引物序列為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；所述的SNP位點rs7816847的引物序列為SEQIDNo.28和SEQIDNo.29。更進一步地，與上述試劑盒所含特異性擴增引物序列相對應的特異性延伸引物序列為：所述的SNP位點rs9319408的引物序列為SEQIDNo.12；所述的SNP位點rs4921914的引物序列為SEQIDNo.24；所述的SNP位點rs10103029的引物序列為SEQIDNo.27；所述的SNP位點rs7816847的引物序列為SEQIDNo.30。進一步地，該評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒還用于檢測與抗結核藥物肝毒性反應相關的VAV2基因SNP位點rs679106、XO基因SNP位點rs1429372和IL6基因SNP位點rs2069852中的一個或多個。相應于此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴增引物序列：所述的SNP位點rs679106的引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；所述的SNP位點rs1429372的引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；所述的SNP位點rs2069852的引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20。相應于此檢測，進一步地，與上述試劑盒所含特異性擴增引物序列相對應的特異性延伸引物序列可以為：所述的SNP位點rs679106的引物序列為SEQIDNo.15；所述的SNP位點rs1429372的引物序列為SEQIDNo.18；所述的SNP位點rs2069852的引物序列為SEQIDNo.21。更進一步地，該評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒還用于檢測與抗結核藥物肝毒性反應相關的NAT2基因位點rs1495741和/或rs1041983。相應于此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴增引物序列：所述的SNP位點rs1041983的引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；所述的SNP位點rs1495741的引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35。相應于此檢測，進一步地，與上述試劑盒所含特異性擴增引物序列相對應的特異性延伸引物序列可以為：所述的SNP位點rs1041983的引物序列為SEQIDNo.33；所述的SNP位點rs1495741的引物序列為SEQIDNo.36。可選地，該試劑盒還可以包括相應PCR技術所需的常用試劑，如dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，這些常用試劑是本領域技術人員熟知的，另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。綜上所述，本發(fā)明的技術方案提供了尚未被公開的與抗結核藥物肝毒性反應相關的基于FLT3和NAT2基因SNP標志物組合，從而更加全面、準確地分子遺傳標記抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應；此外，將上述未公開的SNP標志物組合應用于評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒中，從而更加全面、準確地進行檢測，以及分子標記輔助選擇和用藥預測，實現個體化用藥，減少藥物不良反應。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1研究對象說明：本發(fā)明的研究對象是：2005-2014年在首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院住院治療、年齡在0-16歲間的中國漢族結核病患兒(均是在患兒和家長知情同意的前提下)；并且，他們完全滿足以下3個標準：①臨床診斷為結核??；②以標準化療劑量及方案接受抗結核化療時間超過2周；③基礎肝腎功能正常。其中，結核病診斷標準是：根據美國胸科協(xié)會制定的《成人和兒童結核病診斷和分級標準》和中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案(試行)》進行結核病診斷。結核病臨床診斷標準具體為：①活動性結核病接觸史；②PPD試驗陽性；③抗結核治療有效；④排除其他疾?。粷M足①至④中的任意2項，并具有典型臨床癥狀和影像學證據，臨床診斷為結核病。ATDH判斷標準是：滿足以下4項中任意1項即可診斷為ATDH：①血清ALT含量>(2×ULN)；ALT代表丙氨酸氨基轉移酶；血清ALT相應的ULN＝40IU/L；②血清DBil含量>(2×ULN)；DBil代表直接膽紅素；血清DBil相應的ULN＝6.8μmol/L；③血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量均>(1×ULN)，且其中n1項>(2×ULN)，n1≥1；AST代表天門冬氨酸氨基轉移酶，ALP代表堿性磷酸酶，Tbil代表總膽紅素；血清AST相應的ULN＝40IU/L，血清ALP相應的ULN＝220IU/L，血清Tbil相應的ULN＝19.0μmol/L；④滿足標準a和標準b：標準a：血清ALT含量、血清DBil含量、血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量，上述5項中的n2項>(1×ULN)，n2≥1；標準b：具有如下肝毒性疑似癥狀之一：皮膚鞏膜黃染、肝區(qū)不適、惡心、嘔吐、厭食、發(fā)熱、皮疹、瘙癢等肝毒性疑似癥狀。ATDH入組標準：①ATDH發(fā)生在抗結核化療開始后；②排除外病毒感染、新生兒黃疸、肝腎基礎疾病及其他疾病引起的ATDH；③結核藥減量或停用后，ATDH癥狀減輕；④排除其他藥物致ATDH的可能性。滿足①至④四項者即可診斷為ATDH。對照組入組標準：抗結核化療后，肝功能仍正常者。本實施例1中，使用全基因組關聯分析(Gemone-wideassociationstudy，GWAS)對大樣本數據進行了篩選。其中，基于上述研究對象標準，將385例結核病患兒分成ATDH組和非ATDH對照組，ATDH組77例，對照組308例。1、關于GWAS全基因組芯片：GWAS全基因組芯片數據來自于前期的中國漢族人群結核病易感研究，通過質控分析，最終得到了691388個SNP位點的分型結果。芯片執(zhí)行情況如下：1)GWAS芯片類型：Illumina公司HumanOmniZhongHua-8BeadChip；2)GWAS芯片的數據分析方法：Plink軟件。芯片共得到900，015個SNP位點的分型結果，經過檢出率、Hardy-Weinberger平衡(HWE)、樣本親緣關系以及主成分分析等質控，最終得到691388個SNP位點用于后續(xù)分析。(1)檢出率標準設定和HWE分析：SNP分型數據需符合以下標準，才能納入后續(xù)分析：樣品檢出率＞99％、SNP位點檢出率＞95％、對照組HWE的P值＞0.0001和最小等位基因頻率＞0.01。除此之外，采用GenomeStudiov3.0(Illumina)軟件進行SNP位點散點圖的篩查，舍棄聚類不良的SNP位點。(2)樣本親緣關系分析：為明確個體間是否有血緣關系，采用血緣同源(IBD)等位基因的概率分布進行分析。在分析中發(fā)現，病例組和對照組分別有一對樣本IBD的PI-HAT＞0.05，因此，對具有血緣關系的病例和對照及其相對應的對照和病例樣本給予刪除。另外，我們隨機選擇15個樣本進行重現性的檢測，其基因分型吻合率為99.99％，證明：芯片檢測結果穩(wěn)定，SNP位點基因分型數據可靠。(3)主成分分析：整合千人基因組計劃中非洲人(YRI)、歐洲人(CEU)，日本人(JPT)、中國北方人(CHB)和中國南方人(CHS)的數據以及我們芯片數據，并對整合數據進行主成分分析，確保芯片檢測的病例和對照組樣本具有中國人群的遺傳特征，遺傳背景一致。(4)對于芯片的數據進行人群分層分析：為研究樣本的人群分層情況，進行膨脹系數(λGC)的分析。λGC為1.017，說明我們很好地削減了人群分層對于結果的影響。2、使用上述GWAS全基因組芯片對大樣本進行數據分析：對于芯片的數據進行相關性分析：對上述385例ATDH病例及對照樣本的SNP位點分型結果進行了數據調取。采用Plink軟件對385例ATDH和非ATDH對照兒童的691388個SNP位點進行基因型比較分析，采用年齡性別對數據進行矯正，并結合離散關聯決策算法對數據進行驗證，得到SNP位點與ATDH易感相關性的結果。選取的ATDH關聯SNP位點OR值和P值如表1所示：表1：ATDH關聯SNP位點OR值和P值SNP位點基因OR值(95％CI)P值rs6696544CAMTA12.412(1.612-3.611)1.87E-05rs12272502KCNE32.228(1.494-3.324)8.63E-05rs2290714BLNK2.281(1.535-3.391)4.54E-05rs1031915PPP2R2B2.197(1.479-3.263)9.7E-05rs9319408FLT32.832(1.455-5.51)2.18E-03rs679106VAV22.938(1.779-4.852)2.56E-05rs1429372XO1.821(1.231-2.693)2.68E-03rs2069852IL61.540(1.053-2.254)2.62E-02rs4921914NAT23.544(2.289-5.489)1.42E-08rs10103029NAT23.589(2.296-5.611)2.09E-08rs7816847NAT23.408(2.188-5.307)5.82E-08rs1041983NAT23.434(2.236-5.273)1.73E-08rs1495741NAT23.522(2.277-5.446)1.52E-08從表1中可以看出，檢測結果共涉及9個基因的13個SNP位點。其中，CAMTA1基因SNP位點rs6696544、KCNE3基因SNP位點rs12272502、BLNK基因SNP位點rs2290714、PPP2R2B基因SNP位點rs1031915、FLT3基因SNP位點rs9319408、VAV2基因SNP位點rs679106、XO基因SNP位點rs1429372、IL6基因SNP位點rs2069852、以及NAT2基因SNP位點rs4921914、rs10103029和rs7816847，均為首次發(fā)現與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP位點。實施例2：研究對象說明詳見實施例1。本實施例2中，針對實施例1中所獲得的13個SNP位點，另外選取582例樣本(與上述實施例1中的385例無重合)(ATDH組122例，非ATDH對照組460例)，進行質譜驗證。1、實驗步驟：1)引物設計及合成：根據SNP位點序列信息，使用引物設計軟件Assaydesign3.1設計PCR反應和單堿基擴展引物，并交由生物公司合成。各SNP位點對應的引物見表2。其中，ForwardPrimer為上游引物，ReversePrimer為下游引物，ExtendedPrimer為延伸引物。表2：實施例1中所獲得的13個SNP位點所對應的引物：2)DNA提?。菏褂贸善坊噭┖?，提取血樣、組織、細胞、唾液中的DNA。使用NanoDrop2000儀器進行OD值檢測，1.25％瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質檢合格，轉移至96孔板，-20℃儲存?zhèn)溆谩?)系統(tǒng)基因分型步驟：①PCR擴增反應：聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction，PCR)用于擴增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)域。每個PCR循環(huán)，反應混合體系都在模板變性、引物退火和引物延伸三種不同溫度下依序溫育。該過程可使用一種可編程序的溫度熱循環(huán)儀而達到自動化。②產物堿性磷酸酶處理：在PCR反應結束后，將PCR產物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。③單堿基延伸反應：在堿性磷酸酶處理結束后，進行單堿基延伸反應，反應體系總體積9μl。④樹脂純化：⑤芯片點樣：采用MassARRAYNanodispenserRS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產物移至SpectroCHIPbioarray上。⑥質譜檢測及數據輸出：將點樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF質譜儀分析，檢測結果使用TYPER4.0軟件獲取原始數據及基因分型圖，檢查數據文件的完整性和正確性，將結果保存并進行分析。以上①至⑥均為本領域質譜檢測的常規(guī)方法，這里不再冗述。2、多位點聯合風險評估：采用以OR值作為權重的遺傳風險評分(oddsratioweightedgeneticriskscore，OR-GRS)方法對以上582例樣本進行多位點聯合風險評估計算。該方法大致可以分為兩步：a)所有SNP位點的OR值*突變基因數量，然后求和，即：公式中，G表示一組遺傳易感位點風險等位基因數的集合向量(Gi表示第i個遺傳易感位點的風險等位基因的數量)；b)對所有樣本的求和數值計算敏感性和特異性，繪制ROC曲線，并計算曲線下面積，即：AUC值。有關OR-GRS的原理和評分方法具體參見文獻“遺傳風險評分的原理與方法”(王鋮，戴俊程，孫義民，謝蘭，潘良斌，胡志斌，沈洪兵，2015，[J].中華流行病學雜志，36(10)：1062-1064)。相關SNP位點組合的AUC值的結果如下：1)根據上述方法計算出來的FLT3基因SNP位點rs9319408與NAT2基因SNP位點rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一個組合的AUC值，以及該組合與其它3個基因SNP位點中至少一個相組合的AUC值，如表3所示。其中，所述的其它3個基因SNP位點分別為VAV2基因位點(rs679106)、XO基因位點(rs1429372)和IL6基因位點(rs2069852)。表3中的方案分別為：方案1：FLT3基因SNP位點rs9319408與NAT2基因SNP位點rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一個組合；方案2：上述方案1中FLT3基因SNP位點與NAT2基因SNP位點的組合與其他3個SNP位點中的任意一個位點的組合；方案3：上述方案1中FLT3基因SNP位點與NAT2基因SNP位點的組合與其他3個SNP位點中的任意二個位點的組合；方案4：上述方案1中FLT3基因SNP位點與NAT2基因SNP位點的組合與其他3個SNP位點中的所有三個位點的組合；表3中示出的是針對每個組合方案所測的最大AUC值(表3中AUC值上帶有max下標的組合)、最小AUC值(表3中AUC值上帶有min下標的組合)，以及若干位于最大值和最小值之間的、隨機抽取的組合的AUC值。表3：基于KCNE3和NAT2基因的SNP位點組合、以及該組合與其它3個基因SNP位點組合的AUC值：2)上述相關SNP位點組合的AUC值的結果1)中所有情況與NAT2基因位點rs1495741和/或rs1041983(表4中表示為NAT2*)組合的AUC值，如表4所示。表4中的方案分別為：方案1：上述結果1)中的方案1所涵蓋的所有組合與NAT2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合；方案2：上述結果1)中的方案2-4所涵蓋的所有組合與NAT2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合；表4中示出的是針對每個組合方案所測的最大AUC值(表4中AUC值上帶有“max”下標的組合)、最小AUC值(表4中AUC值上帶有“min”下標的組合)，以及若干位于最大值和最小值之間的、隨機抽取的組合的AUC值。表4：上述相關SNP位點組合的AUC值的結果1)中所有情況與NAT2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合的AUC值：3)比較例：比較例見表5。表5中示出的是本發(fā)明所檢測出的NAT2基因的5個與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP位點各自及其組合的AUC值，以及NAT2基因的SNP位點與XO基因和/或IL6基因的SNP位點的組合的AUC值。表5：作為比較例的AUC值：基于FLT3基因SNP位點rs9319408為首次發(fā)現與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP位點，且在表3和表4中的方案1與表5的AUC值的比較中可以看出，FLT3和NAT2基因的SNP位點組合具有與NAT2基因的5個與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP位點各自及其組合類似的較高的AUC值，由此可以得出結論：FLT3和NAT2基因的SNP位點組合為更全面、準確地評估抗結核藥物肝毒性反應風險提供了另外一種可能性。從表3中的方案2-4與表5的AUC值的比較中可以看出，進一步地，FLT3和NAT2基因的SNP位點組合與本發(fā)明中其它3個基因SNP位點中至少一個相組合的AUC值顯著高于比較例(表5)中的組合方案，其大部分的AUC值略高于比較例(表5)中的組合方案的AUC值，從而表明，這些方案可以實現更全面、準確地評估抗結核藥物肝毒性反應風險的目的。更進一步地，從表4中的方案2與表5的AUC值的比較中可以看出，在表3中方案2-4所涵蓋的所有組合的基礎上，再與NAT2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合(即表4中的方案2)而形成的組合中，部分組合可以達到更高的AUC值，以更準確地評估抗結核藥物引起藥物肝毒性反應風險。實施例3：本實施例3中，制作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點rs9319408和NAT2基因SNP位點rs4921914。該試劑盒含有所需檢測SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，SNP位點rs9319408的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；SNP位點rs4921914的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；該試劑盒還包括相應PCR技術所需的常用試劑：(如dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。例如：本實施例3中的試劑盒試劑包括：dNTPs(25mM)，MgCl2(25mM)，PrimerMix(500nM)，HotStarTaq(5U/μl)，雙蒸水。擴增反應體系包括：1.85μL雙蒸水，0.1μLdNTP(25mM)，0.325μLMgCl2(25mM)，1μLPrimerMix(500nM)，0.625μLPCRBuffer(1.25x)，0.1μLHotStarTaq(5U/μL)，加入1μL模板DNA進行PCR擴增反應。PCR擴增的反應條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環(huán)；72℃延伸3min。在PCR反應結束后，將PCR產物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。延伸反應體系：0.041μLiPLEX酶(1x)，0.94μLPrimerMix，0.619μL雙蒸水，0.2μLiPLEXTerminationmix(1x)，0.2μLiPLEXBufferPlus(0.222x)，7μLSAP處理后PCR產物。延伸反應條件：94℃變性30s；94℃5s；52℃5s，80℃5s，40個循環(huán)；72℃延伸3min。純化后產物使用SequenomMassArray系統(tǒng)進行基因分型。或者，PCR擴增的反應體系的組成如下(50μL):基因組DNA0.50ng、上游引物30pmol、下游引物30pmol、2×TaqPlantinumPCRMasterMix25μL和去離子水。2×TaqPlantinumPCRMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號KT204。PCR擴增的反應條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環(huán)；72℃延伸3min。將PCR擴增產物進行測序。上述PCR反應體系、反應條件和后續(xù)的基因分型及評估方法，可以根據本領域公知常識或者慣用技術手段進行變化或者替換。該試劑盒的價值在于：評估抗結核藥物肝毒性反應風險，從而進行分子標記輔助選擇和用藥預測，實現個體化用藥，減少藥物不良反應。實施例4：本實施例4中，制作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點rs9319408，NAT2基因SNP位點rs4921914、VAV2基因SNP位點rs679106、XO基因SNP位點rs1429372和IL6基因SNP位點rs2069852。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs4921914的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；rs679106的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.15；rs1429372的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs2069852的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.21。相應的PCR反應體系和反應條件與實施例3基本相同。實施例5：本實施例5中，制作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點rs9319408，NAT2基因SNP位點rs4921914、VAV2基因SNP位點rs679106、XO基因SNP位點rs1429372、IL6基因SNP位點rs2069852和NAT2基因SNP位點rs1495741。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs4921914的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；rs679106的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.15；rs1429372的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs2069852的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.21；rs1495741的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.36。相應的PCR反應體系和反應條件與實施例3基本相同。實施例6：本實施例6中，制作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點rs9319408、NAT2基因SNP位點rs4921914、XO基因SNP位點rs1429372、以及NAT2基因SNP位點rs1041983和rs1495741。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs4921914的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.22和SEQIDNo.23；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.24；rs1429372的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs1041983的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.33；rs1495741的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.36。相應的PCR反應體系和反應條件與實施例3基本相同。實施例7：本實施例7中，制作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用于檢測FLT3基因SNP位點rs9319408、NAT2基因SNP位點rs10103029、XO基因SNP位點rs1429372、以及NAT2基因SNP位點rs1041983和rs1495741。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因SNP位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs9319408的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.12；rs10103029的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.27；rs1429372的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.16和SEQIDNo.17；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.18；rs1041983的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.33；rs1495741的特異性擴增引物序列為SEQIDNo.34和SEQIDNo.35；其特異性延伸引物序列為SEQIDNo.36。相應的PCR反應體系和反應條件與實施例3基本相同。以上所述實施例僅為本發(fā)明各技術特征的任意組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。SEQUENCELISTING<110>北京光大隆泰科技有限責任公司<120>基于FLT3和NAT2基因的與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP標志物、試劑盒及應用<160>36<170>PatentInversion3.5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>1acgttggatgccaaagcaagcagtcttttc30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>2acgttggatggacatagggagactgtctca30<210>3<211>19<212>DNA<213>人工引物序列<400>3ggtgactgagtgatgtgag19<210>4<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>4acgttggatgcgacctgcacaaacatatac30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>5acgttggatgtatttctgagcctgccagag30<210>6<211>17<212>DNA<213>人工引物序列<400>6tacactactcagtcccc17<210>7<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>7acgttggatgctccttgagttgagcattac30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>8acgttggatggcacacctacatttaaagtc30<210>9<211>19<212>DNA<213>人工引物序列<400>9ccatgttacagacaaatgc19<210>10<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>10acgttggatgctcatcaacagtgcataacg30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>11acgttggatggaaataccaccttacacctg30<210>12<211>26<212>DNA<213>人工引物序列<400>12ggtttctgtcatctttttataatagc26<210>13<211>29<212>DNA<213>人工引物序列<400>13acgttggatgtatctgtccgcggcgcact29<210>14<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>14acgttggatgtcttcctcactgtgccattc30<210>15<211>15<212>DNA<213>人工引物序列<400>15cagggcgcagggagt15<210>16<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>16acgttggatgtcatacacctgagcatacgg30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>17acgttggatgatgtctcattctggcccaag30<210>18<211>21<212>DNA<213>人工引物序列<400>18cccaggggcagttctcacatc21<210>19<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>19acgttggatgcttccagctgggtgacttag30<210>20<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>20acgttggatgacgtcatttaaccccagcac30<210>21<211>25<212>DNA<213>人工引物序列<400>21ctataaattacttagtcttccacaa25<210>22<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>22acgttggatgcccagacttcagtgtgcaag30<210>23<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>23acgttggatgcagtgcccgcttgctttttc30<210>24<211>20<212>DNA<213>人工引物序列<400>24agtcagtgtgcaagaataca20<210>25<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>25acgttggatgactgtcccatttaagtccag30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>26acgttggatgagtgtttgtccgagacgatg30<210>27<211>23<212>DNA<213>人工引物序列<400>27cctccgtccagaatttgttagcc23<210>28<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>28acgttggatggaatacagttcagccaagtc30<210>29<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>29acgttggatgtaaaggtgcttctggcaagg30<210>30<211>18<212>DNA<213>人工引物序列<400>30gaagccaagtcttttgcc18<210>31<211>28<212>DNA<213>人工引物序列<400>31acgttggatggtggtgtctccaggtcaa28<210>32<211>28<212>DNA<213>人工引物序列<400>32acgttggatggttcgaggttcaagcgta28<210>33<211>25<212>DNA<213>人工引物序列<400>33ggtgttacaatcctcccataaaaat25<210>34<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>34acgttggatgggccctgaagctactgtgaa30<210>35<211>30<212>DNA<213>人工引物序列<400>35acgttggatgaggagcctctctcaggaaag30<210>36<211>19<212>DNA<213>人工引物序列<400>36aagctactgtgaatgccca19當前第1頁1 2 3