本發(fā)明涉及一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，屬于生物酶技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

脂肪酶(lipase)存在于大多數(shù)生物體內(nèi)，它能夠催化甘油酯類化合物水解，因而密切關(guān)系到生物體內(nèi)脂類的消化，運(yùn)輸和加工。此外脂肪酶還具有界面活性，能在油水界面催化疏水性底物的水解。當(dāng)前生物酶技術(shù)快速發(fā)展，脂肪酶的應(yīng)用范圍和實(shí)施方法不斷被拓寬，頻頻出現(xiàn)于食品、日用化工、油脂化工等領(lǐng)域。然而很多脂肪酶相關(guān)的生產(chǎn)過程是在高溫下進(jìn)行的，甚至在一些儲(chǔ)存和運(yùn)輸途中也難以保持低溫，但由于脂肪酶的熱穩(wěn)定性較差，經(jīng)歷高溫后其活性難以復(fù)原，這主要是因?yàn)橹久傅姆肿渔溤诟邷貢r(shí)展開，疏水位點(diǎn)暴露在外，導(dǎo)致了脂肪酶分子之間發(fā)生聚集。這種聚集體一旦產(chǎn)生，即使回到適宜溫度下仍難以解離。所以只要經(jīng)歷過高溫，脂肪酶分子就難以恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)，將會(huì)失去其催化活性。因此具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶有著重要的應(yīng)用價(jià)值和大量的實(shí)際需求。

目前，提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性的方法主要是將脂肪酶固定在各種載體(例如多孔硅，凝膠等)上。這種方法一般需要對載體進(jìn)行預(yù)處理，操作較復(fù)雜，而且固定化效率有限。微乳液凝膠的發(fā)現(xiàn)為酶固定化領(lǐng)域注入了新的活力。微乳液凝膠固定化酶是在油包水含酶微乳液的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，它既擁有含酶微乳液的優(yōu)點(diǎn)，也克服了含酶微乳液體系在酶促反應(yīng)過程之中所面臨的主要問題，即酶的重復(fù)利用和產(chǎn)物分離。因而更適用于規(guī)模較大的工業(yè)生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有提高脂肪酶熱穩(wěn)定性的方法存在的不足，提供一種具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶微乳液凝膠的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種具有良好熱穩(wěn)定性的脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)將脂肪酶與均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺溶解在磷酸鹽緩沖溶液中制得混合溶液作為水相；

2)將表面活性劑加入到不溶于水的非極性或弱極性有機(jī)溶劑中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液，控制水相與油相的體積比為1：10-1：100，且微乳液中w0值為10；

4)將明膠與水混合，明膠與水的質(zhì)量比為1：1-1：4，將混合物加熱并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預(yù)熱后的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態(tài)的脂肪酶微乳液凝膠。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述步驟1)中控制水相中脂肪酶與均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量之比為1：1-1：10,脂肪酶的濃度為0.1-10mg/ml。

進(jìn)一步，步驟1)中所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10mm，ph＝7.50。

進(jìn)一步，步驟2)中所述的表面活性劑為二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉、聚乙二醇對異辛基苯基醚,十六烷基三甲基溴化銨中的一種。

進(jìn)一步，步驟2)中所述的有機(jī)溶劑為正己烷，環(huán)己烷，異辛烷，甲苯，石油醚中的一種。

進(jìn)一步，步驟4)中混合物加熱的溫度為45-55℃。

進(jìn)一步，步驟5)中控制糊狀物與微乳液的質(zhì)量比為1：1-1：10。

進(jìn)一步，所述均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺的分子量為1000-8000da(道爾頓)。

本發(fā)明的有益效果為：

1)本發(fā)明提供的脂肪酶微乳液凝膠熱穩(wěn)定性好，經(jīng)高溫加熱后，仍能保留很高的酶活性，相對脂肪酶微乳液來說，能保留更高的酶活性；

2)本發(fā)明的含酶微乳液凝膠在催化酶促反應(yīng)之后可方便地分離出來，并且可重復(fù)利用。

本發(fā)明的脂肪酶微乳液凝膠熱穩(wěn)定性好的作用機(jī)理如下：

在脂肪酶微乳液凝膠中，脂肪酶分子分散于納米級(jí)的水相液滴中，同時(shí)這些液滴又被固態(tài)的凝膠結(jié)構(gòu)彼此隔離，難以靠近。另外，溫敏性聚合物pnipaam也對提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性至關(guān)重要。溫敏性聚合物pnipaam高溫時(shí)疏水，低溫時(shí)親水。因而可隨環(huán)境溫度的升高，自發(fā)地與展開的脂肪酶分子鏈發(fā)生疏水相互作用，從而防止與其它脂肪酶分子發(fā)生聚集，并在高溫撤離后自動(dòng)釋放脂肪酶，幫助其恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)。這與微乳液中僅依靠液態(tài)的油相所產(chǎn)生的隔離效果相比，其阻斷脂肪酶分子間相互作用的效果要更勝一籌。這兩種途徑協(xié)同發(fā)揮作用，有效提高了脂肪酶的熱穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1、實(shí)施例2和對比例1所得的產(chǎn)品經(jīng)失活復(fù)性后相對酶活性的比較示意圖；

圖2為實(shí)施例1、3所得的微乳液與微乳液凝膠產(chǎn)品經(jīng)失活復(fù)性后相對酶活性的比較示意圖；

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明所使用的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺(pnipaam)是采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atrp)的方法合成的。

實(shí)施例1：

一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)以濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，配制2mg/ml的脂肪酶溶液和5mg/ml的分子量為1470da的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺溶液；

2)將1.2ml的脂肪酶溶液和2.4ml的聚n-異丙基丙烯酰胺溶液混合制得混合溶液作為水相，將8.9g的表面活性劑二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉加入到100ml的異辛烷中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液a1；

4)將23g明膠與30ml水混合，加熱至45℃并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預(yù)熱至45℃的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態(tài)的脂肪酶微乳液凝膠e1。

對比例1：

與實(shí)施例1的制備方法區(qū)別之處在于，微乳液的水相中以同體積的磷酸鹽緩沖溶液代替聚n-異丙基丙烯酰胺溶液，其余步驟完全相同，制得脂肪酶凝膠b1。

實(shí)施例2：

一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)以濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，配制0.4mg/ml的脂肪酶溶液和6.7mg/ml的分子量為4300da的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺溶液；

2)將1.8ml的脂肪酶溶液和5.4ml的聚n-異丙基丙烯酰胺溶液混合制得混合溶液作為水相，將25.8g的表面活性劑聚乙二醇對異辛基苯基醚(tritonx-100)加入到540ml的環(huán)己烷中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液a2；

4)將30g明膠與60ml水混合，加熱至55℃并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預(yù)熱至55℃的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態(tài)的脂肪酶微乳液凝膠e2。

實(shí)施例3：

一種脂肪酶微乳液凝膠的制備方法，包括如下步驟：

1)以濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，向7.2ml的磷酸鹽緩沖溶液中加入72mg的脂肪酶和72mg分子量為6800da的均聚物聚n-異丙基丙烯酰胺配制成混合溶液作為水相；

2)將14.6g的表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(ctab)加入到72ml的石油醚中，溶解后作為油相；

3)將水相在攪拌條件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液a3；

4)將10g明膠與40ml水混合，加熱至50℃并不斷攪拌，直至得到均勻的糊狀物；

5)將預(yù)熱至50℃的步驟3)中所得的微乳液加入到步驟4)所得的糊狀物中，攪拌均勻后停止加熱，冷卻，即得固態(tài)的脂肪酶微乳液凝膠e3。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明過程：

一、為了驗(yàn)證本發(fā)明的脂肪酶微乳液凝膠的熱穩(wěn)定性，我們將實(shí)施例1、實(shí)施例2和對比例1所得的微乳液凝膠e1、e2和b1進(jìn)行了熱穩(wěn)定性測試，具體測試方法如下：

1)將微乳液凝膠樣品e1、e2、b1分別置于65℃、75℃和85℃的恒溫水浴中加熱30min，使其失活，后冷藏保存24h，使其復(fù)性；

2)室溫下將復(fù)性后的微乳液凝膠0.5g、濃度為25mm的4-硝基苯基棕櫚酸酯的異丙醇溶液100μl，以及濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液2ml快速混合后，立即通過紫外分光光度計(jì)檢測反應(yīng)液在400nm處的吸光度變化，將該吸光度與未經(jīng)加熱的微乳液凝膠在同樣的反應(yīng)條件下經(jīng)同樣的測試所得的吸光度進(jìn)行比較，得到相對酶活性，結(jié)果如圖1所示。

由圖1中的數(shù)據(jù)可知，在微乳液凝膠中無聚合物pnipaam與有聚合物pnipaam這兩種條件下，其中的脂肪酶殘余活性有較大差別，無聚合物的微乳液凝膠中其相對活性低于40％，而含有聚合物的微乳液凝膠比不含聚合物的微乳液凝膠的相對活性能至少提高一倍。這說明聚合物pnipaam的加入可以有效防止微凝膠中脂肪酶在高溫條件下的大量失活，使其仍保留較高的酶活性。

二、為了驗(yàn)證本發(fā)明提供的脂肪酶微乳液凝膠相對脂肪酶微乳液而言，其脂肪酶在高溫失活經(jīng)復(fù)性后的反應(yīng)活性，我們進(jìn)行了如下測試：

1)將實(shí)施例1、3所得的微乳液凝膠e1、e3與微乳液a1、a3經(jīng)75℃高溫加熱30min失活，后冷藏保存24h，使其復(fù)性；

2)室溫下將復(fù)性后的微乳液凝膠0.5g、濃度為25mm的4-硝基苯基棕櫚酸酯的異丙醇溶液100μl，以及濃度為10mm，ph＝7.50的磷酸鹽緩沖溶液2ml快速混合后，立即通過紫外分光光度計(jì)檢測反應(yīng)液在400nm處的吸光度變化，將該吸光度與未經(jīng)加熱的微乳液凝膠在同樣的反應(yīng)條件下經(jīng)同樣的測試所得的吸光度進(jìn)行比較，得到相對酶活性，結(jié)果如圖2所示。

3)室溫下將復(fù)性后的微乳液2ml與濃度為25mm的4-硝基苯基棕櫚酸酯的異丙醇溶液100μl快速混合后，立即通過紫外可見分光光度計(jì)檢測反應(yīng)液在333nm處的吸光度變化。將該吸光度與未加熱的微乳液在同樣的反應(yīng)條件下經(jīng)同樣的測試所得的吸光度進(jìn)行比較，得到其相對酶活性，結(jié)果如圖2所示。由圖2中的數(shù)據(jù)對比可知，脂肪酶的微乳液凝膠相對脂肪酶的微乳液形式來說，在高溫失活復(fù)性后能夠更好地保持脂肪酶的活性，提高脂肪酶的使用效率。

三、為了驗(yàn)證本發(fā)明提供的脂肪酶微乳液凝膠的可重復(fù)利用性，我們在利用本發(fā)明的實(shí)施例1、實(shí)施例2所得的脂肪酶微乳液凝膠催化4-硝基苯基棕櫚酸酯水解的反應(yīng)結(jié)束之后，將所用微乳液凝膠從反應(yīng)體系中分離回收，并投入到同等條件的另一組底物溶液中，以進(jìn)行下一次酶促反應(yīng)。測試每次反應(yīng)中的酶活性，分別將每組微乳液凝膠樣品的首次酶活性設(shè)為100％，比較回收且多次使用后的酶活性。結(jié)果如表1所示。

表1中的數(shù)據(jù)表明，隨著重復(fù)利用次數(shù)的增多，微乳液凝膠中的酶活性有所下降，但仍能保持較高的催化性能，重復(fù)使用的效率較高。

表1：重復(fù)使用不同次數(shù)后脂肪酶微乳液凝膠的相對酶活性

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。