背景技術(shù)：

x-染色體連鎖的無丙種球蛋白血癥(xla)是一種遺傳免疫缺陷病，以b淋巴細胞分化障礙為病因，多數(shù)患者在出生后不久出現(xiàn)反復且又嚴重的細菌感染、低丙種球蛋白血癥、外周血b細胞的顯著減少和缺乏。1993年，vetrie等通過定位克隆的方法找到了xla的致病基因btk。

btk基因包含19個外顯子，其編碼的蛋白由659個氨基酸殘基構(gòu)成，包括c末端的一個激酶區(qū)(sh1)和n末端的4個功能區(qū)(ph、th、sh3、sh2)。研究表明，btk蛋白參與了b淋巴細胞的分化、肥大細胞的脫顆粒、血小板的聚集和脫顆粒，也參與調(diào)節(jié)細胞凋亡。當btk基因發(fā)生突變時，這種突變將影響其編碼蛋白的正常功能而導致不同程度的xla的發(fā)生。據(jù)目前研究表明btk突變遍布整個btk基因，而沒有一種突變的發(fā)生率超過3％，但其中ph區(qū)域為相對的突變多發(fā)區(qū)，故對btk基因進行ph區(qū)外顯子測序?qū)z測xla無疑有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供檢測btk基因突變的寡核苷酸，采用pcr技術(shù)，可用于快速檢測xla患者體內(nèi)的btk基因ph區(qū)外顯子突變情況。所述寡核苷酸包括至少一對擴增btk基因ph區(qū)外顯子的引物，所述至少一對擴增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，其堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

btk-2r：aacagctatgaccatgctttgactttccggctttagc；

btk-3f：tgtaaaacgacggccagtttcccccacatgacaggtc；

btk-3r：aacagctatgaccatgcaaatctgctgttccccatc；

btk-4f：tgtaaaacgacggccagtttctttggtgtatggtgtagca；

btk-4r：aacagctatgaccatgcagtctcatttcttggttcagc；

btk-5f：tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc；

btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg。

進一步地，所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，btk-1f：btk-1r、btk-2f：btk-2r、btk-3f：btk-3r、btk-4f：btk-4r、btk-5f：btk-5r和btk-6+f：btk-6+r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，btk-1f、btk-1r、btk-2f、btk-2r、btk-3f、btk-3r、btk-4f、btk-4r、btk-5f、btk-5r、btk-6+f和btk-6+r與m13f的比值均為3.125。

進一步地，所述寡核苷酸在輔助檢測無丙種球蛋白血癥中的應用。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測btk基因突變的方法，包括以下步驟：

(1)抽提樣本中的基因組dna；

(2)利用至少一對擴增引物對(1)中的dna進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物；

(3)利用一對測序引物m13f和m13r對(2)中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的堿基序列；

(4)將(3)中的堿基序列與btk基因ph區(qū)外顯子野生型參考序列進行比較，確定突變位點是否存在，其中，所述至少一對擴增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，所述至少一對擴增引物和所述一對測序引物的堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

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btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

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m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，btk-1f：btk-1r、btk-2f：btk-2r、btk-3f：btk-3r、btk-4f：btk-4r、btk-5f：btk-5r和btk-6+f：btk-6+r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，btk-1f、btk-1r、btk-2f、btk-2r、btk-3f、btk-3r、btk-4f、btk-4r、btk-5f、btk-5r、btk-6+f和btk-6+r與m13f的比值均為3.125。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測btk基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測體系pcr擴增反應液、測序體系反應液，其中，檢測體系pcr擴增反應液包括至少一對擴增引物，所述測序體系反應液包括一對測序引物m13f和m13r，其特征在于，所述至少一對擴增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，所述至少一對擴增引物和所述一對測序引物的堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

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btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg；

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，btk-1f：btk-1r、btk-2f：btk-2r、btk-3f：btk-3r、btk-4f：btk-4r、btk-5f：btk-5r和btk-6+f：btk-6+r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，btk-1f、btk-1r、btk-2f、btk-2r、btk-3f、btk-3r、btk-4f、btk-4r、btk-5f、btk-5r、btk-6+f和btk-6+r與m13f的比值均為3.125。

進一步地，所述檢測體系pcr擴增反應液還包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。

進一步地，所述測序體系反應液還包括測序純化液、牛小腸堿性磷酸酶、edta、無水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

進一步地，所述測序純化液包括核酸外切酶i、牛小腸堿性磷酸酶。

進一步地，所述試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。

進一步地，所述試劑盒在輔助檢測無丙種球蛋白血癥中的應用。

進一步地，btk-1f/btk-1r是一對擴增btk基因ph區(qū)第1外顯子序列的引物，btk-2f/btk-2r是一對擴增btk基因ph區(qū)第2外顯子序列的引物，btk-3f/btk-3r是一對擴增btk基因ph區(qū)第3外顯子序列的引物，btk-4f/btk-4r是一對擴增btk基因ph區(qū)第4外顯子序列的引物，btk-5f/btk-5r是一對擴增btk基因ph區(qū)第5外顯子序列的引物，btk-6+f/btk-6+r除了能夠擴增btk基因ph區(qū)第6外顯子之外，還能夠擴增與btk基因ph區(qū)相鄰的一個區(qū)域上的一個外顯子。

有益效果：(1)本發(fā)明設(shè)計了擴增btk基因ph區(qū)全部6個外顯子序列的擴增引物，通過加接頭，使所有6對引物的pcr產(chǎn)物均可以用一對測序引物進行測序，而現(xiàn)有的測序技術(shù)要對每種擴增產(chǎn)物設(shè)計特異性的測序引物，這就需要設(shè)計6條測序引物(單向測序)或12條測序引物(雙向測序)，因此，本發(fā)明采用的引物在覆蓋突變多發(fā)區(qū)域的同時顯著地減少了引物的使用對數(shù)，同時也顯著降低引物使用成本；(2)本發(fā)明采用pcr技術(shù)，通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳；(3)常用的熒光定量pcr法要針對btk基因ph區(qū)的不同突變類型設(shè)計多個探針，因此，在ph區(qū)的6個外顯子中，如果每個外顯子存在5個突變位點，則要設(shè)計30個探針，檢測成本顯著增加，而本發(fā)明通過給設(shè)計的擴增引物添加接頭，僅需使用一對測序引物就可檢測這30個突變位點以及還未被發(fā)現(xiàn)的其他突變類型，從而使得檢測成本顯著降低。

附圖說明

圖1為btk基因在染色體上的定位圖。

圖2為btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r、btk-6+f/btk-6+r的電泳圖。

圖3、4、5、6、7、8分別為樣本1btk第1、2、3、4、5、6+號外顯子測序截圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實施例1

檢測btk基因突變的寡核苷酸，該寡核苷酸是針對btk基因ph區(qū)外顯子突變所設(shè)計的，包括至少一對擴增引物，所述至少一對擴增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，其堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

btk-2r：aacagctatgaccatgctttgactttccggctttagc；

btk-3f：tgtaaaacgacggccagtttcccccacatgacaggtc；

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btk-5f：tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc；

btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg。

所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

一種檢測btk基因突變的試劑盒，包括檢測體系pcr擴增反應液和測序體系反應液，其中，

測體系pcr擴增反應液包括：2×pcrbuffer(10.0μl)；dntps(2mm)；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；btk基因ph區(qū)各個外顯子的上、下游引物btk-1f(10μm)、btk-1r(10μm)、btk-2f(10μm)、btk-2r(10μm)、btk-3f(10μm)、btk-3r(10μm)、btk-4f(10μm)、btk-4r(10μm)、btk-5f(10μm)、btk-5r(10μm)、btk-6+f(10μm)、btk-6+r(10μm)。

測序體系反應液包括：測序純化液(核酸外切酶i:0.6u，牛小腸堿性磷酸酶:1.2u)；edta(125mm)；無水乙醇；75％乙醇；hidi(高度去離子甲酰胺)；一對測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)；bigdyeterminatorv3.1(購買自美國appliedbiosystems公司)。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括血液dna抽提試劑。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。陽性對照品為含有人btk基因ph區(qū)外顯子dna的溶液，嚴禁反復凍融。陰性對照品為ddh2o?？瞻讓φ掌窞?μl生理鹽水或不加任何物質(zhì)。

實施例2血液樣本dna抽提

血液樣本dna抽提(根據(jù)天根生物血液/細胞/組織基因dna提取試劑盒說明書)：抽提人血液樣本dna，具體抽提方法如下：

(1)抽取300μl血液加入900μl紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。12000rpm離心1min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200μl緩沖液ga，振蕩至徹底混勻；

(2)加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

(3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中；

(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液；

(9)將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

(10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2～5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

實施例3樣本dna擴增

按照實施例2抽提的血液樣本dna，然后利用實施例1中的擴增引物擴增btk基因ph區(qū)外顯子，進行擴增。擴增時在常規(guī)pcr儀上進行，可用儀器包括abiveriti(美國appliedbiosystems公司)等。詳情如下所示：

(i)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)＝待測樣本數(shù)+陰性對照1個+陽性對照1個+空白對照1個)取測體系pcr擴增反應液，每管19μl分裝于反應管中；

(ii)將上述處理好的待測樣本和陰性對照品、陽性對照品各取1μl分別加入反應管中，混勻，低速離心數(shù)秒，進行pcr擴增，獲得擴增產(chǎn)物。測體系pcr擴增反應液配制方法如表1所示。pcr擴增擴增反應條件如表2所示。每對擴增引物的詳細信息如表3所示。

表1.測體系pcr擴增反應液配制

注：表中的primerf和primerr選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r。

表2.pcr擴增擴增反應條件

表3.每對擴增引物信息

注：表中的“6+”的含義是一對引物btk-6+f/btk-6+r，除了能夠擴增btk基因ph區(qū)第6外顯子之外，還能夠擴增與btk基因ph區(qū)相鄰的一個區(qū)域上的一個外顯子。

實施例4sanger測序

取9μl實施例3中的擴增產(chǎn)物和2μl實施例1中的測序純化液按照表4中所述的程序進行純化，從而獲得純化產(chǎn)物。

表4純化程序

將1μl所獲得的純化產(chǎn)物分別與實施例1中的測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)按照表5中的體系進行混合，然后按照表6中的測序反應程序進行測序。

表5

表6.測序反應程序

沉淀環(huán)節(jié)：

向完成測序反應的產(chǎn)物中加入2μl125mm的edta，靜置5min；加入15l無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50l70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μlhidi后進行變性試驗。變性試驗步驟如表7所示。

表7變性試驗步驟

變性程序結(jié)束后，上測序儀(abi3730)測序。

(7)結(jié)果判斷：分別將測序結(jié)果與btk基因野生型參考序列(genbankaccn：nc_000005.10)進行比對，根據(jù)實際突變情況對結(jié)果進行報告。

實施例5臨床樣本檢測

取3例臨床血液樣本(樣本編號為1～3)先后按照實施例1、實施例2、實施例3和實施例4，配制試劑、抽提樣本dna、擴增(獲得擴增產(chǎn)物)和測序。

利用所獲得的擴增產(chǎn)物，開展dna電泳，電泳條件為1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110v，25min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2為這3例血液樣本以btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r、btk-6+f/btk-6+r等6對擴增引物擴增后所得擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，m為markerdl2000，1～3為送檢的血液樣本編號1～3號。這6對引物擴增的片段長度分別為443bp、408bp、266bp、537bp、368bp、820bp，通過電泳圖的分析表明這6對引物擴增有效，且條帶單一。

在這3例樣品中，以樣本1為例進行詳細說明。樣本1的測序結(jié)果如圖3-8所示。

圖3顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)1號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的1號外顯子未發(fā)生突變。

圖4顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)2號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的2號外顯子未發(fā)生突變。

圖5顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)3號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的3號外顯子未發(fā)生突變。

圖6顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)4號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的4號外顯子未發(fā)生突變。

圖7顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)5號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的5號外顯子未發(fā)生突變。

圖8顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)6+號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的6+號外顯子未發(fā)生突變，其中“6+”的含義是一對引物btk-6+f/btk-6+r，除了能夠擴增btk基因ph區(qū)第6外顯子之外，還能夠擴增與btk基因ph區(qū)相鄰的一個區(qū)域上的一個外顯子。

從檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明已經(jīng)把btk基因ph區(qū)外顯子序列包括在內(nèi)了，能夠擴增出btk基因ph區(qū)全部外顯子，以及與btk基因ph區(qū)相鄰的一個區(qū)域上的一個外顯子，并且測序結(jié)果完全準確。由檢測結(jié)果可知，樣本1的btk基因ph區(qū)的6個外顯子和相鄰一個區(qū)域上的一個外顯子均為野生型。另外，對btk基因ph區(qū)突變陽性樣本的檢測也表明本發(fā)明的寡核苷酸、方法和試劑盒能夠檢測出btk基因ph區(qū)外顯子及其相鄰一個區(qū)域上的一個外顯子的突變情況。

sequencelisting

<110>杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司

<120>檢測btk基因突變的方法、寡核苷酸及其應用

<130>

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag38

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat39

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

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<210>5

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc40

<210>10

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct38

<210>11

<211>39

<212>dna

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<400>11

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<210>12

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<400>12

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<210>13

<211>18

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<400>13

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<210>14

<211>16

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<400>14

aacagctatgaccatg16