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一種γ?L?谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法與流程

文檔序號(hào):12794065閱讀:344來源:國(guó)知局

本發(fā)明涉及γ-l-谷氨酰正丁胺的轉(zhuǎn)化方法,尤其涉及一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法。



背景技術(shù):

γ-l-谷氨酰正丁胺是一種重要的γ-谷氨酰烷基胺,γ-谷氨酰烷基胺都可以促進(jìn)t細(xì)胞的增加,從而增加免疫力。γ-l-谷氨酰正丁胺可用于醫(yī)藥領(lǐng)域,具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,ggt,ec2.3.2.2)是一種異源二聚體蛋白,由大、小2個(gè)亞基組成,催化反應(yīng)的受體是氨基酸(或肽)時(shí),形成γ-谷氨酰氨基酸或肽;γ-谷氨酰是供體又是受體時(shí),進(jìn)行自身轉(zhuǎn)肽反應(yīng);親核試劑是水時(shí),進(jìn)行水解反應(yīng)。

目前利用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成γ-d-谷氨酰-l-色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸、γ-谷氨酰-?;撬岬然衔锏膽?yīng)用及報(bào)道很多,卻尚未有利用該酶制備γ-l-谷氨酰正丁胺的報(bào)道。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供了一種反應(yīng)條件溫和、酶立體選擇性強(qiáng)、催化效率高、成本低、工藝流程簡(jiǎn)單的γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法,包括如下步驟:

(1)將具有γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵,發(fā)酵液離心后得到含γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濕菌體;

(2)將上述濕菌體中加入轉(zhuǎn)化液,所述轉(zhuǎn)換液包括:l-谷氨酸-γ-甲酯、正丁胺以及3-甲氧基丁基乙酸酯、乙酸丁酯、戊醇、正己醇中的一種;

(3)在35-50℃,ph6-11條件下進(jìn)行酶促反應(yīng),再采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述步驟(1)中具有γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性的菌株具體為大腸桿菌atcc15489、銅綠假單胞菌cgmccno:1.1129、施氏假單胞菌cgmccno:1.202、枯草芽孢桿菌cgmccno:1.1628中的一種。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述步驟(1)中培養(yǎng)基的配方為:碳源物質(zhì)、氮源物質(zhì)、2.0g/l檸檬酸、2.5g/l硫酸銨、5.0g/lk2hpo4、2.5g/lmgso4、0.07g/lcacl2、0.002g/lcocl2和0.0001g/lmnc4h6o4·4h2o。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述碳源物質(zhì)的總碳源質(zhì)量濃度為10-45g/l,且具體為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述氮源物質(zhì)的總氮源質(zhì)量濃度為5-40g/l,且具體為牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述步驟(2)中l(wèi)-谷氨酸-γ-甲酯、正丁胺的濃度分別為5-80g/l、10-120g/l。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述步驟(2)中3-甲氧基丁基乙酸酯、乙酸丁酯、戊醇、正己醇的濃度為0.001-5.0g/l。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述步驟(3)中采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺的具體方法為:

(1)將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液于3000-5000r/min環(huán)境下離心10-20min,去除菌體細(xì)胞;

(2)加熱轉(zhuǎn)化液,再進(jìn)行脫色、抽濾處理,并將脫色液進(jìn)一步地通過離子交換樹脂柱吸附,用2-4%氨水洗脫,收集洗脫液;

(3)調(diào)至ph3-4,靜置析出沉淀,真空抽濾,烘干得γ-l-谷氨酰正丁胺粗品;

(4)采用乙醇洗滌,真空抽濾,烘干得γ-l-谷氨酰正丁胺精品。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述脫色處理具體為活性碳脫色處理。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一,所述離子交換樹脂柱具體為732型陽(yáng)離子交換樹脂柱。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于:

(1)酶法合成γ-l-谷氨酰正丁胺具有反應(yīng)條件溫和,酶立體選擇性強(qiáng),催化效率高,成本低,工藝流程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),適合工業(yè)化生產(chǎn);

(2)采用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的特定菌株,在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可高效表達(dá)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,使酶法合成γ-l-谷氨酰正丁胺有較高的催化速率和轉(zhuǎn)化率,其中l(wèi)-谷氨酸-γ-甲酯摩爾轉(zhuǎn)化率更是達(dá)到95%以上。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1-4中的一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明,本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

如圖1所示,本實(shí)施例的一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法,包括如下步驟:

(1)將1000ml大腸桿菌atcc15489在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵,發(fā)酵液離心后得到12g含γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濕菌體;

上述培養(yǎng)基的配方為:20g/l碳源物質(zhì)(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種)、20g/l氮源物質(zhì)(牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種)、2.0g/l檸檬酸、2.5g/l硫酸銨、5.0g/lk2hpo4、2.5g/lmgso4、0.07g/lcacl2、0.002g/lcocl2和0.0001g/lmnc4h6o4·4h2o。

(2)將上述濕菌體中加入500ml轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)換液中含30gl-谷氨酸-γ-甲酯、50g正丁胺以及0.0025g3-甲氧基丁基乙酸酯;

(3)在45℃,ph9.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)12h,反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中γ-l-谷氨酰正丁胺為47.7g,對(duì)l-谷氨酸-γ-甲酯摩爾轉(zhuǎn)化率為95%;再采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺,其中,采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺的具體方法為:

①將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液于4000r/min環(huán)境下離心15min,去除菌體細(xì)胞;

②加熱轉(zhuǎn)化液,再進(jìn)行活性碳脫色、抽濾處理,并將脫色液進(jìn)一步地通過732型陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附,用3%氨水洗脫,收集洗脫液;

③調(diào)至ph3.5,靜置析出沉淀,真空抽濾,烘干得41.5gγ-l-谷氨酰正丁胺粗品;

④采用質(zhì)量濃度95%乙醇洗滌,真空抽濾,烘干得37.6gγ-l-谷氨酰正丁胺精品,純度為99.9%。

實(shí)施例2

如圖1所示,本實(shí)施例的一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法,包括如下步驟:

(1)將1000ml銅綠假單胞菌cgmccno:1.1129在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵,發(fā)酵液離心后得到15g含γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濕菌體;

上述培養(yǎng)基的配方為:15g/l碳源物質(zhì)(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種)、15g/l氮源物質(zhì)(牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種)、2.0g/l檸檬酸、2.5g/l硫酸銨、5.0g/lk2hpo4、2.5g/lmgso4、0.07g/lcacl2、0.002g/lcocl2和0.0001g/lmnc4h6o4·4h2o。

(2)將上述濕菌體中加入500ml轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)換液中含20gl-谷氨酸-γ-甲酯、30g正丁胺以及0.005g乙酸丁酯;

(3)在40℃,ph8.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)12h,反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中γ-l-谷氨酰正丁胺為24.5g,對(duì)l-谷氨酸-γ-甲酯摩爾轉(zhuǎn)化率為98%;再采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺,其中,采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺的具體方法為:

①將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液于3500r/min環(huán)境下離心14min,去除菌體細(xì)胞;

②加熱轉(zhuǎn)化液,再進(jìn)行活性碳脫色、抽濾處理,并將脫色液進(jìn)一步地通過732型陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附,用3%氨水洗脫,收集洗脫液;

③調(diào)至ph3,靜置析出沉淀,真空抽濾,烘干得20.5gγ-l-谷氨酰正丁胺粗品;

④采用質(zhì)量濃度95%乙醇洗滌,真空抽濾,烘干得18.6gγ-l-谷氨酰正丁胺精品,純度為99.8%。

實(shí)施例3

如圖1所示,本實(shí)施例的一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法,包括如下步驟:

(1)將1000ml施氏假單胞菌cgmccno:1.202在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵,發(fā)酵液離心后得到20g含γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濕菌體;

上述培養(yǎng)基的配方為:10g/l碳源物質(zhì)(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種)、5g/l氮源物質(zhì)(牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種)、2.0g/l檸檬酸、2.5g/l硫酸銨、5.0g/lk2hpo4、2.5g/lmgso4、0.07g/lcacl2、0.002g/lcocl2和0.0001g/lmnc4h6o4·4h2o。

(2)將上述濕菌體中加入500ml轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)換液中含2.5gl-谷氨酸-γ-甲酯、5g正丁胺以及0.0005g戊醇;

(3)在35℃,ph6條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)12h,反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中γ-l-谷氨酰正丁胺為46.7g,對(duì)l-谷氨酸-γ-甲酯摩爾轉(zhuǎn)化率為93%;再采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺,其中,采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺的具體方法為:

①將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液于3000r/min環(huán)境下離心10min,去除菌體細(xì)胞;

②加熱轉(zhuǎn)化液,再進(jìn)行活性碳脫色、抽濾處理,并將脫色液進(jìn)一步地通過732型陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附,用2%氨水洗脫,收集洗脫液;

③調(diào)至ph3,靜置析出沉淀,真空抽濾,烘干得40.6gγ-l-谷氨酰正丁胺粗品;

④采用質(zhì)量濃度95%乙醇洗滌,真空抽濾,烘干得35.6gγ-l-谷氨酰正丁胺精品,純度為99.8%。

實(shí)施例4

如圖1所示,本實(shí)施例的一種γ-l-谷氨酰正丁胺的酶法轉(zhuǎn)化制備方法,包括如下步驟:

(1)將1000ml枯草芽孢桿菌cgmccno:1.1628在培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵,發(fā)酵液離心后得到12g含γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濕菌體;

上述培養(yǎng)基的配方為:45g/l碳源物質(zhì)(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖中的一種或多種)、40g/l氮源物質(zhì)(牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液中的一種或多種)、2.0g/l檸檬酸、2.5g/l硫酸銨、5.0g/lk2hpo4、2.5g/lmgso4、0.07g/lcacl2、0.002g/lcocl2和0.0001g/lmnc4h6o4·4h2o。

(2)將上述濕菌體中加入500ml轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)換液中含40gl-谷氨酸-γ-甲酯、60g正丁胺以及2.5g正己醇;

(3)在50℃,ph11條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)12h,反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中γ-l-谷氨酰正丁胺為24.3g,對(duì)l-谷氨酸-γ-甲酯摩爾轉(zhuǎn)化率為97%;再采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺,其中,采用等電點(diǎn)結(jié)晶法分離得到γ-l-谷氨酰正丁胺的具體方法為:

①將酶促反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液于5000r/min環(huán)境下離心20min,去除菌體細(xì)胞;

②加熱轉(zhuǎn)化液,再進(jìn)行活性碳脫色、抽濾處理,并將脫色液進(jìn)一步地通過732型陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附,用4%氨水洗脫,收集洗脫液;

③調(diào)至ph4,靜置析出沉淀,真空抽濾,烘干得19.5gγ-l-谷氨酰正丁胺粗品;

④采用質(zhì)量濃度95%乙醇洗滌,真空抽濾,烘干得18.1gγ-l-谷氨酰正丁胺精品,純度為99.8%。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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