本發(fā)明涉及固定化啤酒酵母發(fā)酵方法，具體而言，涉及保藏編號為cgmccno.13500的啤酒酵母的固定化發(fā)酵方法，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

谷胱甘肽(glutathione,r-glutamylcysteingl+glycine,gsh)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。存在于幾乎身體的每一個細(xì)胞。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)（故常簡寫為g-sh），易與某些藥物（如撲熱息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子氣，鉛、汞、砷等重金屬）等結(jié)合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有廣譜解毒作用，不僅可用于藥物，更可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用。

谷胱甘肽（glutathione，gsh）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巰基為谷胱甘肽活性基團(tuán)（故谷胱甘肽常簡寫為g-sh），易與某些藥物（如撲熱息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子氣，鉛、汞、砷等重金屬）等結(jié)合，而具有整合解毒作用。故谷胱甘肽（尤其是肝細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽）能參與生物轉(zhuǎn)化作用，從而把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，排泄出體外。谷胱甘肽還能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能。

谷胱甘肽有還原型（g-sh）和氧化型（g-s-s-g）兩種形式，在生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù)。谷胱甘肽還原酶催化兩型間的互變。該酶的輔酶為磷酸戊糖旁路代謝提供的nadph。

gsh的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、溶劑萃取法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。其中，發(fā)酵法是利用廉價的糖類、蛋白質(zhì)類原料，通過微生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑來進(jìn)行g(shù)sh合成的方法。該法具有菌種易于培養(yǎng)、原料來源方便廉價、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)速率快等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前生產(chǎn)gsh的主要方法。國外早在20世紀(jì)80年代就已實現(xiàn)了gsh的工業(yè)化生產(chǎn)，我國由于起步較晚目前gsh的工業(yè)化生產(chǎn)仍未取得實質(zhì)性突破。

在本申請發(fā)明人的在先申請cn201710041517.9中公開了一株釀酒酵母，所述釀酒酵母于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13500，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。在本申請發(fā)明人的在先研究中，該研究內(nèi)容已經(jīng)申請了發(fā)明專利，專利名稱為“啤酒酵母在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用”，在本發(fā)明人的后續(xù)研究中，出人意料的發(fā)現(xiàn)，采用固定化發(fā)酵方法，還可以進(jìn)一步提高谷胱甘肽的生物合成效率，進(jìn)而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種谷胱甘肽生物合成方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面涉及啤酒酵母在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用，所述啤酒酵母于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13500，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

在本發(fā)明中所使用的啤酒酵母記載于在先申請cn201710041517.9中，該在先申請的全文被并入到本發(fā)明說明書中并作為說明書的一部分存在，申請人保留基于該在先申請修改本發(fā)明的權(quán)利。

啤酒酵母在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用，所述啤酒酵母于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13500，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，經(jīng)過發(fā)酵之后胞內(nèi)谷胱甘肽含量為95-100mg/g。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，用于生物合成的培養(yǎng)基包括發(fā)酵培養(yǎng)基、混合維生素溶液以及前體氨基酸溶液，優(yōu)選的，所述的前體氨基酸溶液包括谷氨酸鈉、l-半胱氨酸鹽酸鹽和甘氨酸。

本發(fā)明擴(kuò)展了啤酒酵母的應(yīng)用范圍，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價值。

微生物保藏信息

釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，所述釀酒酵母于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13500，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)描述，為了便于與現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行比較，本發(fā)明參考中國專利申請cn105505801a所公開的方法測定了本發(fā)明所涉及啤酒酵母在生物合成谷胱甘肽的能力。

實施例1：

(1)菌種

啤酒酵母于2016年12月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13500。

(2)培養(yǎng)基

固定化培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，ph4.5，瓊脂20，121℃滅菌20min，在培養(yǎng)瓶底部加入聚丙烯酸凝膠作為固定化培養(yǎng)載體；

種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，nacl5，ph4.5～6.0，121℃滅菌20min；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖50，酵母膏10，尿素4，(nh4)2so44，(nh4)2hpo410，kh2po42.5，na2hpo40.5，mgso4﹒7h2o1，cacl21，ph4.5～6.0，121℃滅菌20min；

混合維生素溶液(g/l)：維生素b11，維生素b21，維生素b31，維生素b41，維生素b63，泛酸鈣1；

前體氨基酸溶液(g/l)：谷氨酸鈉40，l-半胱氨酸鹽酸鹽40，甘氨酸10。

(3)菌種活化

固定化培養(yǎng)基滅菌備用，將菌種轉(zhuǎn)接于試管固定化培養(yǎng)，28～32℃培養(yǎng)36～48h。

(4)種子液制備

種子培養(yǎng)基分裝(100ml/500ml搖瓶)滅菌備用，取固定化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中。28～32℃、200～220rpm搖床培養(yǎng)18～20h。

(5)接種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基分裝(100ml/500ml搖瓶)滅菌備用，取5ml混合維生素溶液及10ml種子液(接種量8～10％)加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28～32℃、200～220rpm搖床培養(yǎng)。在搖床培養(yǎng)12h，24h時分別補(bǔ)加30％葡萄糖溶液15ml，在搖床培養(yǎng)24h時補(bǔ)加15ml前體氨基酸溶液，搖床培養(yǎng)36～42h后結(jié)束發(fā)酵。

(6)酵母細(xì)胞破壁釋放谷胱甘肽

取一定體積的菌液于離心管中，5000～8000rpm離心5～10min收集菌體，生理鹽水洗滌菌體細(xì)胞2～3次后，用蒸餾水懸浮，搖勻后放入-80℃冰箱迅速冰凍，將冰凍的菌體在沸水浴條件下迅速融化，反復(fù)凍融2次后5000～8000rpm離心5～10min，取上清液作為測試樣品。

(7)細(xì)胞干重的測定

取一定體積的菌液于離心管中，5000～8000rpm離心5～10min收集菌體，生理鹽水洗滌菌體細(xì)胞2～3次后，得到的濕菌體在105℃條件下烘干至恒重。

(8)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的測定

采用碘量法測定上清液中谷胱甘肽含量，再結(jié)合破壁率及細(xì)胞干重計算出胞內(nèi)谷胱甘肽的含量。

(9)結(jié)果

發(fā)酵時間：36-42小時；細(xì)胞干重：10-15g/l；胞內(nèi)谷胱甘肽含量：200-220mg/g，這一結(jié)果相對于本發(fā)明的在先申請，胞內(nèi)谷胱甘肽含量提高了近一倍。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。對一般領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)精神的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，都將構(gòu)成對本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。