本發(fā)明涉及一種植物轉基因的方法。

背景技術：

白樺(Betula platyphylla)是樺木屬(Betula Linn)的一種落葉喬木。在亞洲東部廣布分布。喜光，耐嚴寒，生命力極強，是恢復植被、保護森林水分和土壤的優(yōu)良造林樹種，同時又是一個重要的藥用和纖維用優(yōu)良經(jīng)濟樹種。但白樺傳統(tǒng)育種周期長，遺傳改良進程緩慢，不能按照育種目標改造性狀來滿足日益增長的社會需要。而基因工程育種技術中，現(xiàn)有的白樺轉基因主要是對外植體直接進行轉化，由于白樺再生與轉化所用外植體具組織特異性、轉化周期漫長等常導致其轉化效率較低。此外，這些轉化技術通常因為農(nóng)桿菌的長期參與造成受體材料黃化嚴重，再生困難，這些成為制約白樺分子育種進程的“瓶頸”所在。所以尋找一種快速、穩(wěn)定、高效的遺傳轉化方法對白樺基因功能研究和遺傳改良至關重要。

本實驗的創(chuàng)新之處一是在白樺愈傷的基礎上進行的農(nóng)桿菌侵染轉化，這樣避免了直接使用外植體帶來的轉化時間長，轉化效率低的困擾。白樺外植體直接進行轉化途徑中從侵染的外植體到獲得抗性芽需要2-3個月，使用白樺愈傷進行轉化從外植體到獲得抗性芽需要1個月左右，大大縮短了轉化時間。二是增加了負壓(抽真空)處理的步驟，負壓處理能能提高白樺穩(wěn)定轉化效率。本發(fā)明創(chuàng)造性的使用白樺愈傷與首次在白樺中使用真空抽提技術相結合大大促進了白樺穩(wěn)定轉化的效率。故優(yōu)化后的白樺穩(wěn)定轉化體系能很大程度上提高轉基因效率，縮短轉基因時間。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有白樺穩(wěn)定轉化效率低和轉化周期太長的問題，為快速研究白樺基因功能、獲得目標性狀改良的轉基因植株提供平臺。白樺遺傳轉化是對原有的白樺轉化體系的完善。

本發(fā)明的一種快速高效的白樺轉基因方法，它是按照以下步驟進行的：

一、選取苗高為5～6cm的白樺組培苗，在超凈工作臺中將外植體葉片和莖段置于愈傷誘導培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)7～10天；

二、將步驟一在愈傷誘導培養(yǎng)基中生長的愈傷組織取出，轉移至含目的基因序列的根癌農(nóng)桿菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，黑暗處理48h；其中，侵染液OD₆₀₀為0.6～0.8，

三、將步驟二黑暗處理后的愈傷組織置于加入抑菌劑的轉基因抗性篩選培養(yǎng)基上于25℃光照條件下進行篩選培養(yǎng)40～50天，得到白樺抗性苗；

四、將步驟三的白樺抗性苗轉移到加選擇劑和抑菌劑的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)37-42天后，進行分子檢測驗證，檢測驗證正確后，即表明獲得轉基因白樺苗。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的方法通過選擇適宜生理狀態(tài)的白樺組培苗進行了誘導愈傷處理。這種處理方式避免了白樺外植體直接轉化的周期長及白樺外植體的選擇困難等問題。(注：選擇的白樺葉片過于幼嫩容易被農(nóng)桿菌侵染，需要每天或隔天對葉片進行除菌，這種過于幼嫩的葉片很容易被菌包裹而死，不易獲得轉化后的抗性苗。選擇的白樺葉片過于衰老雖不易被農(nóng)桿菌侵染，但是葉片分化愈傷組織能力差，也不易獲得轉化成功的抗性苗。白樺的莖段也存在類似葉片的問題，但莖段最主要的問題是莖段帶有芽點，會導致大量的假陽性苗產(chǎn)生，轉化效率低。在白樺愈傷組織的基礎上應用真空泵抽真空5-10min的處理。該處理能使含目的基因的侵染液和受體白樺的愈傷組織充分接觸，能大大提高轉化效率。在以上因素的共同作用下能提高白樺穩(wěn)定轉化效率。本發(fā)明在篩選和除菌的培養(yǎng)基上轉移5次，共獲得了19棵抗性芽，轉化率為9.5％，與侵染白樺葉片相比，平均轉化率提高了4.75倍；與直接侵染白樺外植體-莖段相比，平均轉化率提高了3.8倍，與侵染白樺愈傷相比，平均轉化率提高了2.71倍。且用愈傷組織侵染轉化周期比用葉片和莖為外植體轉化周期縮短1/3以上。

附圖說明

圖1為實施例一中繼代培養(yǎng)的白樺組培苗照片；

圖2為實施例一中繼代培養(yǎng)40天的白樺組培苗照片；

圖3為實施例一中愈傷誘導培養(yǎng)基誘導后的愈傷組織照片；

圖4為實施例一中愈傷誘導培養(yǎng)基誘導后的愈傷組織照片；

圖5為實施例一中愈傷被目的基因侵染后篩選培養(yǎng)基上長出的白樺早期抗性不定芽照片；

圖6為實施例一中愈傷組織在被目的基因侵染后篩選培養(yǎng)基上長出的白樺抗性不定芽叢生苗照片；

圖7為實施例一中的加抗生素的生根培養(yǎng)基上的白樺抗性苗照片。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種快速高效的白樺轉基因方法，它是按照以下步驟進行的：

一、選取苗高為5～6cm的白樺組培苗，在超凈工作臺中將外植體葉片和莖段置于愈傷誘導培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)7～10天；

二、將步驟一在愈傷誘導培養(yǎng)基中生長的愈傷組織取出，轉移至含目的基因序列的根癌農(nóng)桿菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，黑暗處理48h；其中，侵染液OD₆₀₀為0.6～0.8，

三、將步驟二黑暗處理后的愈傷組織置于加入抑菌劑的轉基因抗性篩選培養(yǎng)基上于25℃光照條件下進行篩選培養(yǎng)40～50天，得到白樺抗性苗；

四、將步驟三的白樺抗性苗轉移到加選擇劑和抑菌劑的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)37-42天后，進行分子檢測驗證，檢測驗證正確后，即表明獲得轉基因白樺苗。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述的生根培養(yǎng)基含WPM(Woody Plant medium)、0.2mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L Phytagel(結冷膠)，pH＝5.8。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述的愈傷誘導培養(yǎng)基含WPM(Woody Plant medium)、0.8mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、0.5mg/L的GA₃(Gibberellic acid A3)、0.02mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel(結冷膠)，pH＝5.8。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟二中所述的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基含WPM(Woody Plant medium)、1.0mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel(結冷膠)，pH＝5.8。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟二中所述的侵染液含WPM(Woody Plant medium)、150μM的As(乙酰丁香酮，Acetosyringone)、30g/L的蔗糖，pH＝5.8。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三中所述的篩選培養(yǎng)基含WPM(Woody Plant medium)、1.0mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel(結冷膠)，選擇劑和抑制劑，pH＝5.8。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式六不同的是：選擇劑為30～50mg/L的卡那霉素，抑制劑為300～500mg/L的氨芐霉素。其它與具體實施方式六相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟四中所述的生根培養(yǎng)基含WPM(Woody Plant medium)、0.2mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid)、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel、選擇劑和抑制劑，pH＝5.8。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式八不同的是：選擇劑為30～50mg/L的卡那霉素，抑制劑為300～500mg/L的氨芐霉素。其它與具體實施方式八相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟四選擇的抗性苗株高為1.5～2.0cm。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式十一：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟四進行分子檢測驗證的苗株株高為5～6cm。其它與具體實施方式一相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實施方式的內(nèi)容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：

實施例1

本實施例的白樺穩(wěn)定轉化方法，按以下步驟進行：

一、選取苗高為5-6cm的白樺組培苗，在超凈工作臺中將外植體葉片和莖段置于愈傷誘導培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)7-10天。(注：選擇外置體-葉、莖時，應選擇幼嫩、肥厚的葉片和粗壯的莖段。)

二、將步驟一中愈傷誘導培養(yǎng)基中生長的愈傷組織取出迅速轉移至加有含BpGRP基因過表達載體pROKII-BpGRP1的根癌農(nóng)桿菌侵染液中(侵染液農(nóng)桿菌的OD₆₀₀為0.6-0.8)。置于真空泵中負壓-0.1mpa抽真空5-10min，隨后置于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，28℃，黑暗處理48h。(注：侵染后的愈傷組織不需要無菌水洗滌，直接轉到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。)其中侵染液的制備方法為，取50uL含pROKII-BpGRP1的根癌農(nóng)桿菌加到10mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm培養(yǎng)過夜，至OD600約0.6～0.8，然后從10mL菌液中取100uL菌液重新加入至50mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6～0.8后，置于常溫離心機3000G離心，去上清，加入等體積的重懸液(注：重懸液含WPM，30g/L蔗糖)重懸菌體。

三、將步驟二中黑暗處理后的愈傷組織移至含選擇劑和抑菌劑的篩選培養(yǎng)基上置于28℃/25℃(白天/黑夜)，14h-光照/10h-黑暗，光強接近500mmol m^-2s^-1的溫室中進行篩選培養(yǎng)(黑暗處理后的愈傷組織如有大量農(nóng)桿菌滋生，需要用無菌水洗滌2-3次后用抑菌劑比如濃度為500mg/L Carbenicillin或者濃度為500mg/L Timentin水再次洗滌一遍，用無菌濾紙吸干水分轉至篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。如無大量農(nóng)桿菌滋生則直接轉入含選擇劑(30mg/L Kanamycin)和抑菌劑(500mg/L Carbenicillin)的篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。)，20天左右長出抗性不定芽，20-30天后抗性不定芽長到株高1.5-2.0cm抗性苗。

四、將步驟三中的株高1.5～2.0cm白樺抗性苗轉移至加選擇劑(50mg/L Kanamycin)和抑菌劑(300mg/L Carbenicillin)的生根培養(yǎng)基中，大約一個星期后產(chǎn)生不定根，30～35天后株高達5～6cm時進行分子檢測驗證。檢測驗證正確后即表明獲得轉基因白樺苗。

本實施例中繼代培養(yǎng)的白樺組培苗如圖1和2所示。圖1為剛剛繼代的白樺組培小苗，此時的白樺組培小苗還不能用于白樺的穩(wěn)定轉化；圖2為繼代40-45天后的白樺組培苗，此時的白樺組培苗可用于白樺的遺傳轉化；圖3和圖4為白樺的外植體-莖段和葉片在愈傷誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后的狀態(tài)；圖5為白樺愈傷組織在被含BpGRP基因的過表達載體pROKII-BpGRP1桿菌侵染液侵染后，篩選培養(yǎng)基上生長15天的愈傷狀態(tài)，此時開始有早期的抗性不定芽產(chǎn)生；圖6為白樺愈傷組織在被含BpGRP基因的過表達載體pROKII-BpGRP1的侵染液侵染后，篩選培養(yǎng)基上生長20-30天后的狀態(tài)，此時抗性不定芽已長至1-1.5cm；圖7為將抗性叢生苗移植到含有選擇劑和抑菌劑的生根培養(yǎng)基長大成苗。

實施例2

本實施例方案采用的是選取高度為5-6cm的白樺組培苗取第2或第3片健壯葉片用于農(nóng)桿菌的侵染，再置于篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。其它與實施例1相同。

本實施例為對照例。

實施例3

本實施例方案采用的是選取長勢好，高度為5-6cm的白樺組培苗切成1-1.5cm長莖段用于農(nóng)桿菌的侵染，再置于篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。其它與實施例1相同。

本實施例為對照例。

實施例4

本實施例方案采用的是選取狀態(tài)好的愈傷組織迅速轉移至加有含BpGRP基因過表達載體pROKII-BpGRP1的根癌農(nóng)桿菌侵染液中(侵染液OD₆₀₀為0.6-0.8)進行侵染。侵染完畢后置于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，黑暗處理36h。其它與實施例1相同。

本實施例為對照例。

通過實施例1與實施例2、3和4的對照例相比可知，實施例1在篩選和除菌的培養(yǎng)基上轉移5次，共獲得了19棵抗性芽，轉化率為9.5％，與實施例2相比，平均轉化率提高了4.75倍；與實施例3相比，平均轉化率提高了3.8倍；與實施例4相比，平均轉化率提高了2.71倍。且用愈傷組織侵染轉化周期比用葉片和莖為外植體轉化周期縮短1/3以上。