本發(fā)明涉及一種蠶蛹小肽的制備方法，具體涉及一種從蠶蛹蛋白中仿生酶解制取蠶蛹小肽的工業(yè)生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：蠶蛹自古就是滋補(bǔ)強(qiáng)身，溫和脾腎，長肌肉的藥物和食品。蠶蛹具有極其豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，它含有豐富的蛋白質(zhì)和人體必需氨基酸、維生素及微量元素，是人類理想的動(dòng)物性食品。蠶蛹蛋白為蠶蛹經(jīng)脫水、除脂后粉碎處理得到的粉末狀固體。蠶蛹的蛋白質(zhì)含量在50％以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般食品，且蛋白質(zhì)中的必需氨基酸種類齊全，蠶蛹蛋白質(zhì)由18種氨基酸組成，其中人體必需的8種氨基酸含量很高，是豬肉的2倍，雞蛋的4倍，牛奶的10倍，8種人體必需的氨基酸營養(yǎng)均衡，比例適當(dāng)，符合fao/who(聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織)的要求；蠶蛹也含有鉀、納、鈣、鎂、鐵、銅、錳、鋅、磷、硒等微量元素，維生素a、e、b1、b2，胡蘿卜素等；蠶蛹中的不飽和脂肪酸的含量非常豐富，約占總脂肪的72.5％。但蠶蛹蛋白分子量較大，人體無法直接吸收，需在體內(nèi)二次分解為小分子的肽才能起到相應(yīng)的生物活性。仿生酶解為模擬口服蛋白類的胃腸道消化過程(胃為消化部位、吸收很少，腸道為消化、吸收部位)，創(chuàng)造性的將蛋白類酶解成小分子肽類的方法，即在適當(dāng)?shù)臈l件下以胃蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行連續(xù)酶解，再經(jīng)高速離心、超濾、電滲析或納濾得到以相對(duì)分子質(zhì)量小于3kd為主的小分子肽類。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，吸收入血的有效物質(zhì)群與直接口服蛋白相同，仿生酶解有效成分提取更充分，生物利用度高，不僅增強(qiáng)了療效，而且消除了服用異蛋白等引起的免疫原反應(yīng)，減小了不良反應(yīng)發(fā)生率，安全性高；與其他酶解方法相比，仿生酶解更符合人體的選擇機(jī)制，更安全。以仿生酶解方法從蠶蛹蛋白中制取蠶蛹小肽是發(fā)明人的獨(dú)創(chuàng)方法，經(jīng)放大化的工業(yè)生產(chǎn)驗(yàn)證，穩(wěn)定、可行，有廣闊的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種從蠶蛹蛋白中仿生酶解制取蠶蛹小肽的工業(yè)生產(chǎn)方法；第二目的在于提供通過所述的工業(yè)化生產(chǎn)方法得到的蠶蛹小肽；第三目的在于提取所述的蠶蛹小肽在食品、保健食品及藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種從蠶蛹蛋白中仿生酶解制取蠶蛹小肽的工業(yè)生產(chǎn)方法，采用以下步驟：(1)向仿生酶解罐中加純化水20-40升，啟動(dòng)攪拌漿，設(shè)置轉(zhuǎn)速30-60轉(zhuǎn)/分鐘，取蠶蛹蛋白粉2kg，緩慢加入，加入完畢后繼續(xù)攪拌潤脹30分鐘，夾層通蒸汽加熱至80-85℃滅菌15-30分鐘，夾層通冷卻水冷卻至罐內(nèi)溫度約50-55℃，啟動(dòng)夾層水與加熱器循環(huán)，加熱器加熱至50-55℃保溫；(2)啟動(dòng)ph檢測(cè)端子，向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值1.8-2.2，加入蠶蛹蛋白量的1-3％胃蛋白酶，保溫酶解1-3小時(shí)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)ph值，補(bǔ)充稀鹽酸保持ph值在1.8-2.2范圍內(nèi)；(3)向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入40％氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值7.8-8.2，加入1-3％胰蛋白酶，保溫酶解3-6小時(shí)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)ph值，補(bǔ)充40％氫氧化鈉保持ph值在7.8-8.2范圍內(nèi)；(4)向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值6.8-7.2，放掉夾層水，夾層通蒸汽煮沸加熱至80-85℃滅酶15-30分鐘，放液；(5)至管式高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000～12000轉(zhuǎn)/分鐘，上清液通過1812型超濾裝置超濾，超濾膜相對(duì)分子質(zhì)量為3kd，透過液經(jīng)電滲析除鹽，電壓30～90伏，除鹽液經(jīng)減壓濃縮至60℃相對(duì)密度為1.10～1.15的清膏，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為180-200℃，出風(fēng)溫度為90-100℃，得到蠶蛹小肽，復(fù)合膜袋包裝。步驟(1)中所述的蠶蛹蛋白中蛋白含量在90％以上，水分小于10％；步驟(2)中所述的胃蛋白酶酶活力為3000u/g；步驟(3)中所述的胰蛋白酶酶活力為100000u/g；步驟(5)中所述的蠶蛹小肽中總蛋白含量在90％以上，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量在85％以上，游離氨基酸含量小于5％，水分小于7％。對(duì)本發(fā)明中蠶蛹小肽進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，對(duì)小肽肽鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，小肽質(zhì)譜(esi-ms)測(cè)定方法及結(jié)果如下:esi-ms參數(shù)霧化氣為氮?dú)?，碰撞氣體為氬氣；源溫80℃，錐孔電壓50v；tof加速電壓9.1kv；mcp檢測(cè)器電壓為2150v；毛細(xì)管電壓800v。首先進(jìn)行分析，質(zhì)量掃描范圍為100～1000d。根據(jù)本品的測(cè)定結(jié)果顯示，大部分肽段二重質(zhì)子化(即帶兩個(gè)單位正電荷)，通過選擇信號(hào)強(qiáng)的母離子進(jìn)入ms/ms分析，得到8種肽的ms/ms圖譜，對(duì)得到的ms/ms碎片信息進(jìn)行分析，獲得的它們的氨基酸序列組成結(jié)果見表1。表1蠶蛹小肽相對(duì)分子質(zhì)量及氨基酸序列組成表注：表中序列字母代表不同氨基酸的簡寫，丙氨酸a，精氨酸r，天冬氨酸d，半胱氨酸c，谷氨酰胺q，谷氨酸e，組氨酸h，異亮氨酸i，甘氨酸g，天冬酰胺n，亮氨酸l，賴氨酸k，甲硫氨酸m，苯丙氨酸f，脯氨酸p，絲氨酸s，蘇氨酸t(yī)，色氨酸w，酪氨酸y，纈氨酸v。應(yīng)用仿生酶解法制備蠶蛹小肽，不僅增強(qiáng)了療效，而且消除了服用動(dòng)物原粉及其他常規(guī)提取方法引入異蛋白引起的免疫原反應(yīng)，減小了不良反應(yīng)發(fā)生率，安全性高。由于不同的酶水解的部位不一樣，得到的酶解產(chǎn)物也大不相同，如胃蛋白酶主要酶解的部位為苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸組成的肽鍵，胰蛋白酶主要酶解的部位為精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸組成的肽鍵。本研究以同一批次的蠶蛹藥材，以總肽量為指標(biāo)，考察了蠶蛹采用不同蛋白酶酶解工藝的提取液的活性，即考察了蠶蛹胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解及仿生酶解法所得的酶解液的含量。取蠶蛹藥材，粉碎成細(xì)粉，稱取四份，每份20g，加10倍量水煮沸15分鐘，待冷至40℃，一份以稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值1.5～2.0，加入2％量的胃蛋白酶，40℃保溫酶解2小時(shí)；一份以20％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值8.0～8.5，加入2％量的胰蛋白酶，40℃保溫酶解4小時(shí)；一份以20％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值6.0～7.0加入2％量的木瓜蛋白酶，40℃保溫酶解4小時(shí)；最后一份以稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值1.5～2.0，加入1％量的胃蛋白酶，40℃保溫酶解2小時(shí)，20％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值8.0～8.5，加入1％量的胰蛋白酶，40℃保溫酶解4小時(shí)；以上酶解液均加熱煮沸使酶滅活，離心(5000r/min)，上清液減壓濃縮(70～80℃，-0.07～-0.08mpa)并調(diào)整總量至100ml，即得蠶蛹不同酶提取液。分別測(cè)定各提取液的總肽量，測(cè)定結(jié)果見表2。表2蠶蛹不同蛋白酶酶解提取方法各部分的成分含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用單一的胃蛋白酶、胰蛋白酶來酶解，均不能使蠶蛹中的蛋白被有效的利用，酶解產(chǎn)物的活性和總肽含量不高，顯示藥材未充分利用，造成了一定的藥材浪費(fèi)；雙酶連續(xù)酶解與木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物活性和總肽含量均較高，且雙酶連續(xù)酶解高于木瓜蛋白酶，但由于木瓜蛋白酶酶解在體外強(qiáng)制酶解，與人體自身酶解所得的活性物質(zhì)不盡相同，必會(huì)引起人體的排異反應(yīng)。一種蠶蛹小肽，是通過上述工業(yè)化生產(chǎn)方法得到的。利用本方法得到的蠶蛹小肽，其主要相對(duì)分子質(zhì)量為3kd以下，具有極強(qiáng)的水溶性，其總蛋白含量在90％以上，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量在85％以上，游離氨基酸含量小于5％，水分小于7％。上述仿生酶解罐及酶解系統(tǒng)指的是cn205874433u、cn205590709u中涉及的設(shè)備，隨著設(shè)備容積的增大，本發(fā)明方法中各物料的用量可隨之增大。在其他具有同類功能的設(shè)備上，本方法同樣適應(yīng)。本發(fā)明中的原料蠶蛹蛋白粉，可以是購自市場(chǎng)上的成品原料，也可以是先從蠶蛹中水解得到蠶蛹蛋白粉或含蠶蛹蛋白的液體產(chǎn)品?？傊?，無論以何種原料投料生產(chǎn)(蠶蛹、蠶蛹蛋白粉、蠶蛹蛋白液等)，只要生產(chǎn)工藝中涉及到了本發(fā)明保護(hù)的內(nèi)容，即視為采用了本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。按上述工業(yè)生產(chǎn)方法得到的蠶蛹小肽在食品、保健食品及藥品中的應(yīng)用，包括但不限于下述應(yīng)用：根據(jù)所生產(chǎn)的蠶蛹小肽的營養(yǎng)特性、功能特性和加工特性，以蠶蛹小肽作為基本素材，可以開發(fā)出許多優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)、健康的食品。利用其促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抗疲勞的特性，可以開發(fā)增強(qiáng)肌肉和消除疲勞的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品和保健食品；利用其促進(jìn)脂肪代謝的特性，可以開發(fā)促進(jìn)脂肪代謝的減肥功能食品；利用其促進(jìn)細(xì)胞生長的特性，可以開發(fā)用作促進(jìn)微生物生長、代謝的發(fā)酵促進(jìn)劑等。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明從蠶蛹蛋白中仿生酶解制取蠶蛹小肽的工業(yè)生產(chǎn)方法，符合人體選擇機(jī)制，制備工藝簡便、可行，成本低，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保；所得的蠶蛹小肽總蛋白含量在90％以上，小分子肽類含量在85％以上，相對(duì)分子質(zhì)量主要在3kd以下，無毒副作用，達(dá)到綠色食品純天然的要求，能獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。具體實(shí)施方式下面列舉實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，各實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明：實(shí)施例1本實(shí)施例包括如下步驟：(1)向仿生酶解罐中加純化水20升，啟動(dòng)攪拌漿，設(shè)置轉(zhuǎn)速60轉(zhuǎn)/分鐘，取蠶蛹蛋白粉(蠶蛹分離蛋白，蛋白含量在90％以上，水分小于10％)2kg，緩慢加入，加入完畢后繼續(xù)攪拌潤脹30分鐘，夾層通蒸汽加熱至80-85℃滅菌15分鐘，夾層通冷卻水冷卻至罐內(nèi)溫度約55℃，啟動(dòng)夾層水與加熱器循環(huán)，加熱器加熱至55℃保溫；(2)啟動(dòng)ph檢測(cè)端子，向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值2.0，加入蠶蛹蛋白量的1％胃蛋白酶(酶活力為3000u/g)，保溫酶解1小時(shí)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)ph值，補(bǔ)充稀鹽酸保持ph值在1.8-2.2范圍內(nèi)；(3)向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入40％氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值8.0，加入1％胰蛋白酶(酶活力為100000u/g)，保溫酶解3小時(shí)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)ph值，補(bǔ)充40％氫氧化鈉保持ph值在7.8-8.2范圍內(nèi)；(4)向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值6.8，放掉夾層水，夾層通蒸汽煮沸加熱至80-85℃滅酶30分鐘，放液；(5)至管式高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000～12000轉(zhuǎn)/分鐘，上清液通過1812型超濾裝置超濾，超濾膜相對(duì)分子質(zhì)量為3kd，透過液經(jīng)電滲析除鹽，電壓30伏，除鹽液經(jīng)減壓濃縮至60℃相對(duì)密度為1.10～1.15的清膏，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為180-200℃，出風(fēng)溫度為90-100℃，得到蠶蛹小肽，復(fù)合膜袋包裝。實(shí)施例2本實(shí)施例包括如下步驟：(1)向仿生酶解罐中加純化水40升，啟動(dòng)攪拌漿，設(shè)置轉(zhuǎn)速30轉(zhuǎn)/分鐘，取蠶蛹蛋白粉2kg，緩慢加入，加入完畢后繼續(xù)攪拌潤脹30分鐘，夾層通蒸汽加熱至80-85℃滅菌15分鐘，夾層通冷卻水冷卻至罐內(nèi)溫度約50℃，啟動(dòng)夾層水與加熱器循環(huán)，加熱器加熱至50℃保溫；(2)啟動(dòng)ph檢測(cè)端子，向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值1.8，加入蠶蛹蛋白量的3％胃蛋白酶，保溫酶解3小時(shí)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)ph值，補(bǔ)充稀鹽酸保持ph值在1.8-2.2范圍內(nèi)；(3)向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入40％氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值8.2，加入3％胰蛋白酶，保溫酶解6小時(shí)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)ph值，補(bǔ)充40％氫氧化鈉保持ph值在7.8-8.2范圍內(nèi)；(4)向仿生酶解罐中以蠕動(dòng)泵加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值7.2，放掉夾層水，夾層通蒸汽煮沸加熱至80-85℃滅酶15分鐘，放液；(5)至管式高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000～12000轉(zhuǎn)/分鐘，上清液通過1812型超濾裝置超濾，超濾膜相對(duì)分子質(zhì)量為3kd，透過液經(jīng)電滲析除鹽，電壓90伏，除鹽液經(jīng)減壓濃縮至60℃相對(duì)密度為1.10～1.15的清膏，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為180-200℃，出風(fēng)溫度為90-100℃，得到蠶蛹小肽，復(fù)合膜袋包裝。實(shí)施例3蠶蛹小肽：取實(shí)施例1所述的工業(yè)化生產(chǎn)方法得到的蠶蛹小肽，經(jīng)檢測(cè)：其總蛋白含量為91％，三氯乙酸可溶解的小分子肽含量為92％，游離氨基酸含量為2.1％，水分含量為4.3％，相對(duì)分子量分布為：相對(duì)分子量范圍峰面積百分比＞3000d3.1％3000-2000d25.2％2000-1000d36.8％1000-300d27.5％＜300d7.4％實(shí)施例4蠶蛹小肽制備的產(chǎn)品：取實(shí)施例1方法所得的蠶蛹小肽400g，按蠶蛹小肽:玉米油:蜂蠟:卵磷脂比例為10:36:3:1混合物料，經(jīng)膠體磨研磨30分鐘，以明膠、甘油、純化水、氧化鐵黑按100：40：100：1比例制作軟膠囊囊皮膠液，控制膠盒溫度55±5℃，保溫罐40±5℃，噴體溫度36±5℃，以壓丸機(jī)壓制軟膠囊，每粒內(nèi)容物重0.50g，18℃～26℃冷風(fēng)干燥4h(相對(duì)濕度為30％～40％)定型，洗丸、干燥、選丸、包裝，制備成軟膠囊成品。實(shí)施例5蠶蛹小肽制備的產(chǎn)品：取實(shí)施例1方法所得的蠶蛹小肽100g，加入玉米低聚肽粉10g、小麥低聚肽10g、大豆肽粉10g，加三氯蔗糖適量，混合物料，分裝，10g/袋，制成固體飲料。當(dāng)前第1頁12