本發(fā)明涉及環(huán)糊精的合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種通過(guò)雙酶復(fù)合水解制備葡萄糖基-α-環(huán)糊精的方法。

背景技術(shù)：

環(huán)糊精也稱作環(huán)麥芽寡糖，是由若干α-d吡喃葡萄糖單元通過(guò)α-1,4糖苷鍵鏈接而成的一類低聚糖的總稱。環(huán)糊精因其水溶性較差、具有較高的溶血性和腎毒性導(dǎo)致其應(yīng)用收到嚴(yán)重的限制，因此對(duì)環(huán)糊精的改性十分必要。

環(huán)糊精的改性方法有化學(xué)法或生物酶的方法來(lái)修飾環(huán)糊精，將某些特定的取代基接枝到環(huán)糊精上，這種在保留環(huán)糊精空腔結(jié)構(gòu)基本不變的情況下引入取代基團(tuán)而得到的改性產(chǎn)物，通常稱之為修飾環(huán)糊精，或改性環(huán)糊精，或環(huán)糊精衍生物。當(dāng)取代基為糖基時(shí)，通常將其稱之為分支環(huán)糊精，如葡萄糖基環(huán)糊精、麥芽糖基環(huán)糊精、半乳糖基環(huán)糊精和甘露糖環(huán)糊精等。多數(shù)的改性環(huán)糊精水溶性好、毒性低，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

葡萄糖基-α-環(huán)糊精的研究主要集中在1984年，kobayashi等研究了一種采用bme的限制反應(yīng)作用于蠟質(zhì)玉米淀粉得到分支寡糖的方法，然后在sds的存在下用bme作用于分支寡糖，在葡萄糖淀粉酶和taka-amylasea的聯(lián)合作用下得到了g1-α-cd。之后的報(bào)道幾乎沒(méi)有。

隨后，watanabe等設(shè)計(jì)了一種制備高產(chǎn)g1-α-cd的新方法。這種方法包括兩個(gè)步驟：普魯蘭酶將麥芽糖和α-cd縮合成g2-α-cd以及g2-α-cd在葡萄糖淀粉酶作用下水解，由于葡萄糖淀粉酶將g2-α-cd水解為g1-α-cd，普魯蘭酶縮合反應(yīng)的平衡偏向麥芽糖基α-cd的合成，其結(jié)果導(dǎo)致分支率的增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明申請(qǐng)人提供了一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法。本發(fā)明方法反應(yīng)條件溫和，同時(shí)利用cgtase微弱的耦合活力水解掉環(huán)狀糊精及未反應(yīng)的底物，從而得到高純度葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)將麥芽糊精溶于磷酸鹽緩沖液中，加入cgtase酶，在溫度為35-60℃，ph為4.0-6.5的條件下反應(yīng)12-24h；

(2)采用物理的方法使酶活降低至0.001-1.0u；

(3)向步驟(2)的反應(yīng)體系中加入糖化酶，在溫度為30-50℃，ph為4.0-6.5的條件下反應(yīng)12-24h，然后高溫滅酶，制得含有葡萄糖基-α-環(huán)糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法對(duì)步驟(3)所得到的混合物進(jìn)行分離純化，最終制得所述葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

步驟(1)中所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10-50mm，ph為4.0-6.5。

步驟(1)中所述麥芽糊精的質(zhì)量濃度為1％-5％。

步驟(1)中所述cgtase酶的添加量為0.1-0.5u。

步驟(2)中所述物理方法為80-100℃水浴加熱。

步驟(3)中所述的糖化酶采用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.5-1.0u/ml，其中磷酸鹽緩沖液濃度為10-50mm。

步驟(3)中所述糖化酶添加量為0.5-1.0u。

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明利用了cgtase的微弱的耦合活力打破副產(chǎn)物環(huán)狀糊精的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，然后在糖化酶的作用下將已經(jīng)開(kāi)環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行水解，環(huán)狀結(jié)構(gòu)在cgtase和糖化酶的共同作用下邊開(kāi)環(huán)，邊水解，最終將副產(chǎn)物環(huán)狀的環(huán)糊精水解為小分子的葡萄糖。從而實(shí)現(xiàn)葡萄糖基-α-環(huán)糊精的有效分離。

本發(fā)明主要利用了cgtase的環(huán)化活力來(lái)制備葡萄糖基-α-環(huán)糊精，然后加入的糖化酶可以促進(jìn)cgtase酶反應(yīng)向著耦合活力的方向進(jìn)行，從而將副產(chǎn)物環(huán)狀糊精水解為葡萄糖，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖基-α-環(huán)糊精的有效分離。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例6中制得的葡萄糖基-α-環(huán)糊精高效液相圖譜；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例6中制得的葡萄糖基-α-環(huán)糊精的二級(jí)質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)取10mg的麥芽糊精2ml離心管中，加入1mlph5.5(20mm)的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.36u的cgtase，在60℃反應(yīng)條件下反應(yīng)12h；

(2)在100℃水浴條件下保溫15min；

(3)利用高效液相的方法對(duì)步驟(2)所得產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到0.19mg葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

實(shí)施例2

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)取10mg的麥芽糊精2ml離心管中，加入1mlph5.5(20mm)的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.36u的cgtase，在60℃反應(yīng)條件下反應(yīng)12h；

(2)向反應(yīng)體系中加入0.72u糖化酶，45℃的反應(yīng)條件下反應(yīng)12h，在100℃的條件下保溫15min；

(3)利用高效液相的方法對(duì)步驟(2)所得產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到0mg葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

實(shí)施例3

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)取10mg的麥芽糊精2ml離心管中，加入1mlph6.0(20mm)的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.1u的cgtase，在60℃反應(yīng)條件下反應(yīng)12h；

(2)80℃水浴加熱25min，使cgtase的酶活至0.001u；

(3)向反應(yīng)體系中加入0.5u糖化酶，45℃的反應(yīng)條件下反應(yīng)12h，在100℃的條件下保溫15min，制得含有葡萄糖基-α-環(huán)糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法對(duì)步驟(3)所得產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到0.23mg葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

實(shí)施例4

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)取10mg的麥芽糊精2ml離心管中，加入1mlph5.5(20mm)的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.5u的cgtase，在60℃反應(yīng)條件下反應(yīng)12h；

(2)90℃水浴加熱5min，使cgtase的酶活至0.01u；

(3)向反應(yīng)體系中加入1.0u糖化酶，45℃的反應(yīng)條件下反應(yīng)12h，在100℃的條件下保溫15min，制得含有葡萄糖基-α-環(huán)糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法對(duì)步驟(3)所得產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到0.32mg葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

實(shí)施例5

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)取50mg的麥芽糊精2ml離心管中，加入1mlph5.5(20mm)的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.36u的cgtase，在35℃反應(yīng)條件下反應(yīng)24h；

(2)100℃水浴加熱5min，使cgtase的酶活至0.003u；

(3)向反應(yīng)體系中加入0.72u糖化酶，50℃的反應(yīng)條件下反應(yīng)24h，在100℃的條件下保溫15min，制得含有葡萄糖基-α-環(huán)糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法對(duì)步驟(3)所得產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到0.16mg葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

實(shí)施例6

一種葡萄糖基-α-環(huán)糊精的制備方法，所述方法包括如下具體步驟：

(1)取10mg的麥芽糊精2ml離心管中，加入1mlph5.5(20mm)的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.36u的cgtase，在60℃反應(yīng)條件下反應(yīng)12h；

(2)80℃水浴加熱10min，使cgtase的酶活至0.003u；

(3)向反應(yīng)體系中加入0.72u糖化酶，45℃的反應(yīng)條件下反應(yīng)12h，在100℃的條件下保溫15min，制得含有葡萄糖基-α-環(huán)糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法對(duì)步驟(3)所得產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到0.44mg葡萄糖基-α-環(huán)糊精。將本發(fā)明實(shí)施例所得葡萄糖基-α-環(huán)糊精的高效液相圖譜和二級(jí)質(zhì)譜圖分別如圖1、2所示。

由圖1可以看出，副產(chǎn)物環(huán)狀糊精幾乎完全被cgtase和糖化酶水解為葡萄糖，本發(fā)明方法可以得到相對(duì)純度較高的葡萄糖基-α-環(huán)糊精。

由圖2為所得樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖，其中[m-h]^-的值為1133.6，與葡萄糖基-α-環(huán)糊精的相對(duì)分子質(zhì)量一致，可以確定此樣品為葡萄糖基-α-環(huán)糊精。