本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其是涉及一種hcv2a亞型ns5b突變檢測的pcr擴增引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hcv)感染所致，主要由血液/體液傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球有1.7億人感染hcv。在我國健康人群抗hcv陽性率為0.7％～3.1％，約3800萬人。由于病毒生物學特點和宿主免疫功能等多方面因素，機體免疫往往難以有效清除病毒，致使約50％～80％hcv感染者發(fā)展為慢性肝炎，其中20％～30％將發(fā)展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％發(fā)展成為肝細胞癌癥。hcv病毒體呈球形，直徑小于80nm(在肝細胞中為36～40nm，在血液中為36～62nm)，為有包膜、單股正鏈rna病毒。單鏈hcvrna基因組是正極性的，包含一個約9600個核苷酸長的開放讀框(orf)，編碼約3010個氨基酸的線性多蛋白。在被感染的細胞中，該多蛋白被細胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多個位點切割，產(chǎn)生結構和非結構(ns)蛋白。結構蛋白(c、e1、e2和e2-p7)包括構成病毒顆粒的多肽。非結構蛋白(ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)編碼催化和調(diào)節(jié)hcvrna基因組復制的酶或輔助因子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種hcv2a亞型ns5b突變檢測的pcr擴增引物及試劑盒。一種hcv2a亞型ns5b突變檢測的pcr擴增引物，包括第一引物對和第二引物對，所述第一引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:1和seqidno:2所示，所述第二引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:3和seqidno:4所示。在其中一個實施例中，所述pcr擴增引物還包括第三引物對和第四引物對，所述第三引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:1和seqidno:5所示，所述第四引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:6和seqidno:4所示。在其中一個實施例中，所述pcr擴增引物還包括第五引物對和第六引物對，所述第五引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:7和seqidno:2所示，所述第四引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:3和seqidno:8所示。在其中一個實施例中，所述pcr擴增引物還包括第七引物對和第八引物對，所述第七引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:7和seqidno:5所示，所述第八引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:6和seqidno:8所示。一種hcv2a亞型ns5b突變檢測的試劑盒，含有引物試劑，所述引物試劑中的引物為上述任一實施例所述的pcr擴增引物。在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括rna提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、pcr擴增試劑及電泳鑒定試劑中的至少一種試劑。在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括含有hcv2a亞型的hcv陽性對照試劑。上述hcv2a亞型ns5b突變檢測的pcr擴增引物或試劑盒可用于hcvns5b突變檢測，在其中一實施例中，在突變檢測時，可按照如下方法進行：對含有hcv2a亞型rna的待測樣本進行逆轉(zhuǎn)錄處理，合成hcvcdna；對合成的hcvcdna使用第一引物對和第二引物對進行第一輪pcr擴增，其中，所述第一引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:1和seqidno:2所示，所述第二引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:3和seqidno:4所示；對所述第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行測序分析。在其中一個實施例中，還包括對第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行鑒定的步驟，若產(chǎn)物片段的長度滿足預設要求，則進行所述測序分析，否則使用第三引物對和第四引物對對第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行第二輪pcr擴增(為半巢式擴增)，再對第二輪pcr擴增的產(chǎn)物進行所述測序分析，其中，所述第三引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:1和seqidno:5所示，所述第四引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:6和seqidno:4所示。在其中一個實施例中，還包括對第二輪pcr擴增的產(chǎn)物進行鑒定的步驟，若產(chǎn)物片段的長度滿足預設要求，則進行所述測序分析，否則對合成hcvcdna使用第五引物對和第六引物對重新進行第一輪pcr擴增，其中，所述第五引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:7和seqidno:2所示，所述第六引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:3和seqidno:8所示；并對使用所述第五引物對和所述第六引物對進行第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行鑒定，若產(chǎn)物片段的長度滿足預設要求，則進行所述測序分析，否則使用第七引物對和第八引物對對該第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行第二輪pcr擴增(為半巢式擴增)，再對擴增的產(chǎn)物進行鑒定和分析，其中，所述第七引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:7和seqidno:5所示，所述第八引物對的兩條引物的序列分別如seqidno:6和seqidno:8所示。在進行鑒定的時候，主要是看pcr擴增的結果，如果pcr擴增的條帶清楚，則進行測序分析，如果條帶不清晰等，還會用上述的引物進行調(diào)整更換后再進行pcr擴增，直到擴出的條帶清楚。在其中一個實施例中，所述預設值為1×104iu/ml。在其中一個實施例中，所述鑒定是使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測所述產(chǎn)物片段的長度。在其中一個實施例中，所述產(chǎn)物片段的長度滿足預設要求是指產(chǎn)物片段的長度在1000bp左右(如1000bp±50bp)。整個hcv2a亞型的ns5b區(qū)片段較長(1782bp)，但全擴增出來不利于測序。本發(fā)明通過特別設計的pcr擴增引物，包括第一引物對和第二引物對，將較難擴增和測序的長片段的ns5b區(qū)分成兩個較小的片段進行獨立擴增，如果樣本本身較好，第一對引物擴增出來的產(chǎn)物應該有1027bp，第二對引物擴增出來1126bp，中間有重疊，再進行測序分析，可以很容易就發(fā)現(xiàn)ns5b區(qū)域的突變情況。進一步，對于使用第一引物對和第二引物對的第一輪pcr擴增的產(chǎn)物不太理想，如產(chǎn)物片段存在非特異性條帶或濃度不高，再使用第三引物對和第四引物對對第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行第二輪半巢式pcr擴增，如果第二輪pcr擴增的產(chǎn)物還不太理想，還可以繼續(xù)使用第五引物對和第六引物對再對cdna重新進行第一輪pcr擴增，之后再進行鑒定或測序分析，如果結果還不理想，還可以使用第七引物對和第八引物對對該第一輪pcr擴增產(chǎn)物進行第二輪半巢式pcr擴增，因而，可進一步保證測序結果的可靠性，進而可以提高突變檢測的準確性。本發(fā)明在測序分析時，主要使用一代測序技術，如abi3730或abi3500測序儀等，其中，abi3730只能讀大約800bp，讀到后面準確性受限，abi3500能讀大約500bp。因此，本發(fā)明采用多對引物進行pcr擴增。這樣擴增出來，中間是會有重疊的，因為一代測序只能單向測序，測序時，因為儀器本身的測序長度的限制，采用二對引物就能夠在保證前面的測序是準確的前提下，而后面的部分因為是有重疊部分，所以測出的也是準確的，因而，采用本發(fā)明的多對pcr擴增引物或試劑盒進行擴增，可以保證測序的精度，提高檢測結果的準確性。附圖說明圖1為各引物對應的位點示意圖。圖2為有效性驗證時第一輪pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中，圖2a使用lf1/lr1引物對；圖2b使用rf1/rr1引物對。圖3為有效性驗證時第二輪半巢式pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中，使用lf1/lr2、rf2/rr1引物對。圖4為有效性驗證時擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，使用lf2/lr1、rf1/rr2引物對對模板進行第一輪pcr擴增，再使用lf2/lr2、rf2/rr2引物對該第一輪pcr擴增產(chǎn)物對應進行第二輪半巢式pcr擴增。圖5為重復性驗證時第一輪pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中，圖5a使用lf1/lr1引物對；圖5b使用rf1/rr1引物對。圖6為重復性驗證時第二輪pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，使用lf1/lr2、rf2/rr1引物對。圖7為最低下限驗證時第一輪pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中，圖7a為使用lf1/lr1引物對；圖7b使用rf1/rr1引物對。圖8為最低下限驗證時對第二輪pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，使用lf1/lr2、rf2/rr1引物對。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的
技術領域：
的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。以下為具體檢測實施例部分。一、樣本采集、穩(wěn)定性及處理1、樣本的采集1.1血清：用負壓采血管采集2ml靜脈血于不含有抗凝劑無菌管中，室溫放置不超過2小時，分離血清轉(zhuǎn)入無菌管中備用。1.2血漿：用負壓采血管采集2ml靜脈血于含有edta抗凝劑無菌管中，室溫放置不超過2小時，分離血漿轉(zhuǎn)入無菌管中備用。2、樣本的穩(wěn)定性2.1樣本的穩(wěn)定性：室溫：2小時；冷藏：3天；冷凍：3個月。2.2樣本的保存條件：原管冷藏(2℃～8℃)保存，分離后的血清或血漿冷凍(-15℃～-25℃)保存。3、樣本的處理3.1檢測完的樣本，原管冷藏(2℃～8℃)保存10天，分離后的血清或血漿冷凍(-15℃～-25℃)保存1個月。二、試劑1、貯存與穩(wěn)定性1.1rna提取試劑：除proteinasek保存于-20℃，magbindparticles保存于2℃～8℃外，其它試劑組份均貯存于常溫(15℃～25℃)，有效期均為1年。1.2核酸擴增試劑、引物及質(zhì)控品：均貯存于-20℃，有效期均為1年。1.3電泳試劑：除d2000marker儲存于4℃(經(jīng)常使用時)外，其它試劑均儲存于常溫(15℃～25℃)；除1×tae溶液和1.5％瓊脂糖凝膠現(xiàn)配現(xiàn)用外，其它試劑有效期均為1年。2、試劑盒組成2.1rna提取試劑(magpureviralnucleicacidkfkit，magen公司)：注意：上述試劑在thermokingfisherflex儀器上運行。2.2核酸擴增試劑2.2.1第一鏈cdna合成試劑為vazyme公司產(chǎn)品(hiscript1ststrandcdnasynthesiskit)：2.2.2pcr擴增試劑為vazyme產(chǎn)品(2×phantamaxmastermix)：2×phantamaxmastermix(1×1ml)2.3引物(lifetechnologies公司，在廣州合成)，見下表1。表1引物序列引物名稱seqidno:accgggcctctaatcactgc2a5b-lf1(對應圖2～8中f)1gggctgagaacgtggtgat2a5b-lr1(對應圖2～8中r3)2ctgctccacgtcatagtcat2a5b-lf2(對應圖2～8中f2)7tcgtctccggatatcagctt2a5b-lr2(對應圖2～8中r4)5cgtatcatacgcgatgatt2a5b-rf1(對應圖2～8中f3)3ctctagcgagcgtggagca2a5b-rr1(對應圖2～8中r2)4actgtggactccagatatc2a5b-rf2(對應圖2～8中f4)6tacgaatagtagcagtacgc2a5b-rr2(對應圖2～8中r)8注：1、引物結合位點以參考株ab047639為準，各引物序列的對應位置見圖1；人工序列2、由于整個ns5b區(qū)片段較長，不利于測序，因此引物設計為兩個較小的片段，可以先分別由2a5b-lf1/lr1、2a5b-rf1/rr1進行第一輪pcr擴增，達到測序要求者以同樣的引物進行測序分析，未達到要求者以2a5b-lf1/lr2、2a5b-rf2/rr1進行第二輪半巢式pcr擴增，達到測序要求者以同樣的引物進行測序分析，未達到要求者可以更換第一輪及第二輪的引物序列，如可以以整個ns5b模板先以2a5b-lf2/lr1、2a5b-rf1/rr2進行第一輪pcr擴增，達到測序要求者以同樣的引物進行測序分析，未達到要求者再以2a5b-lf2/lr2、2a5b-rf1/rr2進行第二輪半巢式pcr擴增，達到測序要求者以同樣的引物進行測序分析。2.4質(zhì)控品陰性對照：為不含hcvrna的臨床樣本。與實驗樣本平行操作，每批次1個。陽性對照：為hcv2a亞型的hcv陽性臨床樣本，與實驗樣本平行操作，每批次1個。2.5電泳鑒定試劑2.5.150×tae溶液：稱取242gtris、37.2gna2edta·2h2o于1l燒杯中，然后加入800ml去離子水，充分攪拌溶解；再加入57.1ml冰醋酸，充分混勻；最后加去離子水定容至1l，室溫保存。2.5.21×tae溶液：量取20ml50×tae溶液于試劑瓶中，加入去離子水定容至1l，室溫保存。2.5.31％溴酚藍母液：稱取1g水溶性鈉型溴酚藍于100ml水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶解。2.5.40.05％溴酚藍上樣緩沖液：取0.75ml1％溴酚藍母液于15ml塑料管中，加水定容至15ml。2.5.51.5％瓊脂糖凝膠：稱取1.35g瓊脂粉于200ml錐形瓶中，加入90ml1×tae溶液，搖勻；置于微波爐中火加熱2分鐘，取出后冷卻至60℃，加入3μl核酸染料，并搖勻，注意不要有氣泡；將溶解的瓊脂糖倒入膠槽，然后插入梳子，室溫冷卻凝固。2.5.6核酸染料：吖啶橙(深圳亞能公司)；marker：d2000marker(天根生化公司)。三、儀器設備/耗材，見下表2表2四、操作步驟1、樣本處理(標本制備區(qū))1.1準備洗板和洗脫板按下表3把相應的洗滌液(buffermw1和buffermw2)和洗脫液(nucleasefreewater)加到96孔板中，并標記好名稱。把磁力外套放到洗板1中。表31.2準備樣品板，見下表4。表41.3上機運行(rna提取)a)打開thermokingfisherflex，選擇magpureviral-5412-kf程序。b)啟動程序，按儀器提示把裝好樣品和試劑的96孔板放到儀器中。c)程序開始運行，約30分鐘后程序結束。d)取出洗脫板貼上封口膜，保存于-20℃(非立即檢測時)。e)按照實驗室標準流程，丟去廢液和耗材。2、反轉(zhuǎn)錄試劑配制(試劑準備區(qū))2.1從試劑盒中取出hiscript1ststrandcdnasynthesiskit試劑，室溫融化后，2000rpm離心10秒。2.2在96孔pcr反應板分別加入1μlrandomhexamers(50ng/μl)，通過樣品傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。2.3設所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，另外由于分裝的消耗需增加n/15(如果n/15＜1按1計算)。每個測試反應體系配制如下表5，配好后通過樣品傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。表5試劑名稱用量/單個測試2×rtmix10μlhiscriptenzymemix2μl3、反轉(zhuǎn)錄pcr加樣(標本制備區(qū))3.1根據(jù)預先確定順序的96孔板加樣表，使用八通道移液器分別向96孔pcr板中加入rna模板、陰性對照及陽性對照各7μl，使用一次性封口膜密封。3.2使用酶標板式離心機3000rpm離心1分鐘，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。4、反轉(zhuǎn)錄pcr擴增(擴增區(qū)/樣品處理區(qū))4.1將96孔板放入pcr儀，并旋緊pcr蓋，選擇熱蓋模式。按下表6條件進行變性，完成后轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。表6變性階段溫度(℃)時間(time)循環(huán)(cycles)stage1655分鐘1stage242分鐘1注：反應體積8μl。4.2將配置好的反轉(zhuǎn)錄試劑加入到變性后的96孔板中(12μl/孔)，用移液器輕輕吹打混勻，使用一次性封口膜密封。4.3使用酶標板式離心機3000rpm離心1分鐘，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。4.4將96孔板放入pcr儀，并旋緊pcr蓋，選擇熱蓋模式。按下表7條件進行擴增，完成后轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。表7擴增階段溫度(℃)時間(time)循環(huán)(cycles)stage1255分鐘1stage25045分鐘1stage3855分鐘1注：反應體系20μl。5、第一輪pcr擴增試劑配制(試劑準備區(qū))5.1從試劑盒中取出2×phantamaxmastermix及引物，室溫融化后，2,000rpm離心10秒。5.2設所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，另外由于分裝的消耗需增加n/15(如果n/15＜1按1計算)。每個測試反應體系配制如下表8。表8試劑名稱用量/單個測試ddh205.8μl2×phantamaxmastermix15.0μl2a5b-lf1/2a5b-rf1(20μm)0.6μl2a5b-lr1/2a5b-rr1(20μm)0.6μl計算好各試劑的使用量，加入一適當體積試管中，充分混勻，向設定的n個pcr反應管中分別加入22μl，通過樣品傳遞窗轉(zhuǎn)移至產(chǎn)物分析區(qū)。6、第一輪pcr擴增加樣(試劑準備區(qū))6.1根據(jù)預先確定順序的96孔板加樣表，使用八通道移液器分別向96孔pcr板中加入反轉(zhuǎn)錄pcr產(chǎn)物、陰性對照及陽性對照各8μl，使用一次性封口膜密封。6.2使用酶標板式離心機3000rpm離心1分鐘，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。7、第一輪pcr擴增(擴增區(qū))將pcr管放入pcr儀，并旋緊pcr蓋，選擇熱蓋模式。按下表9條件進行擴增：表9注：反應體積30μl。8、第一輪pcr擴增產(chǎn)物電泳鑒定(產(chǎn)物分析區(qū))8.1制備1.5％瓊脂糖凝膠，取2μl擴增產(chǎn)物加入3μl溴酚藍上樣緩沖液混勻，點樣，120v電壓電泳約20分鐘，然后于凝膠成像系統(tǒng)觀察。8.2首先觀察對照品是否符合(hcv陰性對照管無條帶，hcv陽性對照管條帶清晰，且條帶大小為1000bp左右)。8.3如果臨床樣本條帶清晰且單一，且條帶大小為1000bp左右，進入測序步驟。測序結果分析標準為：cutoff值設置為20％，僅判斷大于占比20％堿基信息。8.4如果臨床樣本條帶較暗或無條帶，無法滿足測序要求，進入第二輪pcr擴增步驟。9、第二輪pcr擴增試劑配制(試劑準備區(qū))9.1從試劑盒中取出2×phantamaxmastermix及引物，室溫融化后，2,000rpm離心10秒。9.2設所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，另外由于分裝的消耗需增加n/15(如果n/15＜1按1計算)。每個測試反應體系配制如下表10。表10試劑名稱用量/單個測試ddh2011.8μl2×phantamaxmastermix15.0μl2a5b-lf1/2a5b-rf2(20μm)0.6μl2a5b-lr2/2a5b-rr1(20μm)0.6μl計算好各試劑的使用量，加入一適當體積試管中，充分混勻，向設定的n個pcr反應管中分別加入28μl，通過樣品傳遞窗轉(zhuǎn)移至產(chǎn)物分析區(qū)。10、第二輪pcr擴增加樣(產(chǎn)物分析區(qū))在該區(qū)通風櫥內(nèi)，使用單通道移液器分別向pcr反應管中加入臨床樣本、陰性對照及陽性對照的第一輪pcr產(chǎn)物各2μl，蓋緊pcr管管蓋，短暫離心后轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。11、第二輪pcr擴增(擴增區(qū))將pcr管放入pcr儀，并旋緊pcr蓋，選擇熱蓋模式。按下表11條件進行擴增。表11注：反應體積30μl。12、第二輪pcr擴增產(chǎn)物電泳鑒定(產(chǎn)物分析區(qū))12.1制備1.5％瓊脂糖凝膠，取2μl擴增產(chǎn)物加入3μl溴酚藍上樣緩沖液混勻，點樣，120v電壓電泳約20分鐘，然后于凝膠成像系統(tǒng)觀察。12.2首先觀察對照品是否符合(hcv陰性對照管無條帶，hcv陽性對照管條帶清晰，且條帶大小為1000bp左右)。12.3如果臨床樣本條帶清晰，且條帶大小為1000bp左右，進入測序步驟。12.4如果臨床樣本無條帶，需進行hcvrna定量確認。如果hcvrna定量結果≥1×104iu/ml，則需重新進入rna提取及pcr擴增步驟；如果hcvrna定量結果<1×104iu/ml，該說明病毒含量低于檢測下限。此外，如果第二輪pcr擴增的條帶不清晰，還可以對第一輪pcr擴增的產(chǎn)物進行第三輪pcr擴增，第三輪pcr擴增的兩個引物對分別是2a5b-lf2/2a5b-lr1、2a5b-rr1/2a5b-rr2。擴增體系及擴增條件同第二輪pcr擴增。13、sanger測序13.1測序地點：廣州金域?qū)嶒炇摇?3.2測序試劑：terminatorv3.1cyclesequencingkit。13.3dna模版處理：a)exosap-it和h2o以2.0μl:3.0μl混合，震蕩混勻后，分裝5.0μl至新的8連管中；b)每孔加入pcr產(chǎn)物2.0μl，混勻微離心；c)在pcr儀中進行酶切反應，程序：37℃，15min→80℃，15min→4℃，保溫。13.4測序pcr體系配置：按照試劑盒要求進行體系配置。13.5測序pcr反應：a)向每管中加入經(jīng)exosap-it處理的dna測序模板1.0μl；b)蓋好上蓋后，振蕩混勻后，微離，使混合物沉入管底；c)在pcr儀中進行測序反應，反應程序：96℃，1min→(96℃，10sec→50℃，5sec→60℃，4min)，25個循環(huán)→4℃保溫。13.6測序pcr產(chǎn)物純化：a)每管加入1.0μl125mmedta到管底，每管加入1.0μl3mnaac到管底；b)每管加入35.0μl100％酒精，鋁箔或膠蓋封嚴密，震蕩混勻4次，室溫放置15min；c)3700rpm離心30min，馬上倒置96孔板，離心至850rpm停止離心；d)每管加入50.0μl的-20℃預冷70％酒精，3700rpm離心15min；馬上倒置96孔板，離心至850rpm停止離心；e)重復用預冷70％酒精洗滌1次；f)室溫揮發(fā)凈酒精，加入10.0μlhi-diformamide溶解dna；g)溶解后的樣品需要在95℃變性4min，迅速置冰中冷卻4min后(取出后置于-20℃冰箱)，上樣電泳。13.7結果分析方法：打開軟件sequencinganalysis5.2，載入測序結果，察看lor值、rawdata、bcstatus、ppstatus。原則上應該盡量使質(zhì)控品的結果達到最佳，詳細的軟件操作說明參考《appliedbiosystemsdnasequencinganalysissoftwarev5.1》。14、結果分析14.1以aj238799序列為參考，使用sequencher軟件標記出各個分析位點并建立2a-ns5b.spf工程文件。14.2將測序結果與工程文件同時導入sequencher軟件，通過assembleautomatically功能進行裝配；14.3打開裝配好的文件，以工程文件中的標記為參考對樣本中各個位點進行分析。15、結果判斷(judgmentofresults)15.1根據(jù)目標位點的序列判定，若為野生型，報告為“野生型(野生型氨基酸+位置)”，如“野生型(l159)”；若為突變型，報告為“突變型(野生型氨基酸+位置+突變型氨基酸)”，如“突變型(l159f)”；當目標位點確定為突變型與野生型共存時(兩者占比均在20％以上)，報告為野生型與突變型共存(野生型氨基酸+位置+野生型氨基酸/突變型氨基酸)，如野生型與突變型共存(l159l/f)。下表12為hcv2a亞型ns5b區(qū)域目標分析位點主要突變類型。表12注：*代表a/t/c/g任一個核苷酸；若遇特殊少見情況，根據(jù)氨基酸密碼子表及文獻報道推斷。五、實驗結果及驗證1.有效性(validity)有效性在本次驗證實驗中是指該反應體系對陽性樣本的檢測成功率。本次驗證共對94例hcv分型結果為2a亞型的樣本進行檢測，對結果進行統(tǒng)計分析顯示，有3例樣本(t691、t280、t53)兩個片段都未擴增出，結果見圖2、圖3、圖4和下表13。表13通過對電泳結果分析可以看出，對于全部96例樣本，有3例樣本(t691、t280、t53)兩個片段都未擴增出，對原始樣本定量后病毒載量均在1000iu/ml左右，相對較低；另有一例樣本(t763)有一個片段未擴增出，可能是引物結合不良的原因。整體擴增成功率為95.7％(90/94)。2.測序驗證結果對90例樣本進行了測序驗證，其中1例測序失敗，其余89例測序結果分析如下表14。表14注：數(shù)據(jù)以ab047639.1(jfh-1)基因序列為參考序列進行分析。3.再現(xiàn)重復性(reproducibility)再現(xiàn)重復性是指對相同樣本在不同時間、不同人員或不同儀器條件下進行重復檢測時得到相同結果的能力。在本次驗證過程中主要研究不同pcr儀及測序儀對實驗的影響。對47例hcv2a亞型樣本進行重復擴增并進行電泳檢測，通過對電泳圖5和圖6分析可以看出，該檢測的重復性為100％(48/48)；但由于引物結合性的問題造成第二片段有兩例樣本未擴增出來，后續(xù)會考慮更換其它引物對這兩例樣本進行擴增。4.最低檢測下限(limitofdetection)最低檢測下限是指該項目可以成功檢測的樣本的最低病毒載量。本次驗證實驗共對14例樣本進行梯度稀釋后進行檢測，結果見圖7、圖8和表15。表15通過上表15可以看出，對于第一片段，病毒載量在1.00e+03iu/ml以上的樣本都能擴增成功，部分低于1.00e+03iu/ml的樣本也可以擴增成功；對于第二片段，病毒載量在1.00e+04iu/ml以上的樣本基本可以擴增成功，部分低于1.00e+04iu/ml的樣本也可以擴增成功。在病毒載量達到1.00e+04iu/ml以上的樣本，兩個片段基本都可以擴增成功，對于載量低于1.00e+04iu/ml的樣本受限于第二片段擴增效率而使部分樣本無法成功擴增完整片段而造成實驗失敗，因此目前暫定該項目的檢測下限為1.00e+04iu/ml。以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。sequencelisting<110>貴州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司<120>hcv2a亞型ns5b突變檢測的pcr擴增引物、試劑盒及檢測方法<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1accgggcctctaatcactgc20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2gggctgagaacgtggtgat19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cgtatcatacgcgatgatt19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4ctctagcgagcgtggagca19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tcgtctccggatatcagctt20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6actgtggactccagatatc19<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ctgctccacgtcatagtcat20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tacgaatagtagcagtacgc20當前第1頁12