本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)，尤其涉及一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：泥鰍(misgurnusanguillicaudatus)，又名鰍、鰍魚(yú)，屬鯉形目鯉亞目，鰍科類的小型魚(yú)類，在我國(guó)各地的淡水中均有分布，自然產(chǎn)量大，分布廣，是常見(jiàn)的水產(chǎn)類大眾食品。泥鰍肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，并具有重要的藥用價(jià)值，《本草綱目》和《中藥大辭典》等中藥醫(yī)書(shū)中均有詳細(xì)記載，泥鰍全體或皮膚分泌的滑液均可入藥，具有補(bǔ)中氣、祛濕邪的功效，還能治消渴、水腫黃疸、清熱解毒、痔疾、陽(yáng)痿等，對(duì)慢性肝炎患者肝功能的改善也有很明顯的作用。因此，泥鰍是藥食兼用的滋補(bǔ)勝品，被喻為“水中人參”。泥鰍中的可食部分占總體的80％左右，高于一般的淡水魚(yú)類，可食部分含水79.18％，脂肪1.50％，灰分1.17％，蛋白質(zhì)17.88％，其中氨基酸總量(占鮮重)17.26％，8種必須氨基酸的總量為7.61％，呈味氨基酸6.85％，必需氨基酸的含量都非常接近于who/fao模式，氨基酸中的?；撬嵴?.5％以上，故泥鰍為高蛋白低脂肪的營(yíng)養(yǎng)品，既美味又滋補(bǔ)。泥鰍及其提取物中含豐富的k、na、fe、cu、ze、mg、mn、se等微量元素，對(duì)防治心腦血管疾病和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)有重要的意義。泥鰍具有脂肪含量低、膽固醇少的特點(diǎn)，泥鰍各組織中含十多種脂肪酸，不同組織中均含較高的單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸具有很強(qiáng)的生理活性，有助于降低膽固醇、降血脂、抗動(dòng)脈硬化等。從泥鰍中可分離出多種活性物質(zhì)，包括泥鰍多糖、多肽、凝集素、抗菌肽、超氧化物歧化酶和透明質(zhì)酸等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗癌等重要的營(yíng)養(yǎng)保健作用和臨床藥用價(jià)值。泥鰍本身藥用價(jià)值高，高蛋白、低脂肪，是一種潛在的動(dòng)物蛋白資源，經(jīng)常食用可防血管硬化，對(duì)高血壓、貧血等心血管疾病患者都有輔助治療作用。但是目前對(duì)泥鰍的研究主要集中在泥鰍多糖、微量元素等方面，而對(duì)泥鰍體內(nèi)豐富蛋白質(zhì)資源的研究卻報(bào)道尚少。因此利用現(xiàn)代食品生物技術(shù)對(duì)泥鰍蛋白進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)，制備出具有保健作用的功能食品，不僅可提高現(xiàn)有資源的利用率，為泥鰍的深度加工提供一條新的途徑，增加漁農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益；而且可增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品加工企業(yè)的科技含量和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，對(duì)提高我國(guó)水產(chǎn)品現(xiàn)代化綜合加工技術(shù)水平和發(fā)展保健食品工業(yè)具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。公開(kāi)于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成己為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽。通過(guò)改進(jìn)泥鰍魚(yú)蛋白多肽的酶解工藝與技術(shù)，采用超波輔助酶解技術(shù)，制備具有降壓活性的多肽，本發(fā)明制備的泥鰍魚(yú)降壓肽的肽得率高，純度高。本發(fā)明的目的之二在于一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽在復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒中的應(yīng)用。本發(fā)明的復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒以泥鰍魚(yú)蛋白多肽為主要添加的降壓成分，羅布麻葉為輔助添加的降壓成分，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用。本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽，為分子量介于1000-1300da的泥鰍魚(yú)降壓肽，該泥鰍魚(yú)降壓肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：前處理的步驟：將鮮活泥鰍魚(yú)用清水靜養(yǎng)24h，撈取瀝干，去掉頭和內(nèi)臟后，用絞肉機(jī)絞成肉泥；蛋白質(zhì)改性的步驟：稱取泥鰍肉泥，按照固液比1:20加入純凈水，然后用鹽酸調(diào)ph值至3.0-5.0，在40-50℃下，微波處理20分鐘，之后保溫30-45min，ph值保持在5.0以下，得到改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液；一次酶解的步驟：以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，用鹽酸調(diào)ph值至3.0-5.0，按照底物質(zhì)量百分比為2-3％加入復(fù)合酶拌勻，然后在40-50℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在5.0以下；二次酶解的步驟：經(jīng)過(guò)第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3.0-5.0，以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，按照底物質(zhì)量百分比為2-3％加入木瓜蛋白酶拌勻，然后在40-50℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在5.0以下，酶解結(jié)束；滅酶的步驟：酶解結(jié)束后再次啟動(dòng)微波加溫至90℃,維持10min，得到滅酶水解液；分離純化的步驟：將滅酶活的水解液降至室溫，調(diào)ph值至5.0-6.0，采用sephadexg-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化滅酶活的水解液；高壓蒸汽滅菌的步驟：經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；濃縮干燥的步驟：將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得泥鰍魚(yú)降壓肽。進(jìn)一步地，在蛋白質(zhì)改性的步驟中，所述用鹽酸調(diào)ph值至3.5，在45℃下，微波處理。進(jìn)一步地，在一次酶解的步驟中，所述復(fù)合酶為由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶復(fù)合而成的復(fù)合酶，所述胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶的質(zhì)量比為1:(2-3):(3-4)。進(jìn)一步地，在一次酶解的步驟中，所述用鹽酸調(diào)ph值至4，在42℃下，微波處理。進(jìn)一步地，在二次酶解的步驟中，所述木瓜蛋白酶的活力為6×105u/g。進(jìn)一步地，在二次酶解的步驟中，所述用鹽酸調(diào)ph值至4.5，在48℃下，微波處理。進(jìn)一步地，在蛋白質(zhì)改性的步驟、一次酶解的步驟、二次酶解的步驟中所述微波的頻率為2500mhz，功率為15kw。進(jìn)一步地，所述分離純化的步驟具體如下：用ph值為7.0的濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖液平衡凝膠層析柱，柱子尺寸為1.6cm×70cm，填料為葡聚糖凝膠樹(shù)脂sephadexg-25，流速為1.0ml/min；將滅酶活的水解液溶于所述磷酸鹽緩沖液配置成20mg/ml的溶液，上柱，用ph值為7.0濃度為0.02mol/l磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2ml/min，并用分步收集器收集洗脫液，4ml/管，于256nm下檢測(cè)吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，然后進(jìn)行濃縮。本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒的制備方法，由上述的泥鰍魚(yú)蛋白多肽釀制而成，包括如下步驟：輔料中藥浸提液的步驟：將羅布麻葉粉碎后，加入4倍量濃度為65％的米酒浸提，在超聲波條件下輔助降壓功能成分的浸出，浸提液經(jīng)離心分離制得，羅布麻葉浸提液；勾兌的步驟：以濃度為30％米酒為基液，加入25-30％基酒重量的所述泥鰍魚(yú)蛋白多肽以及10-15％基酒重量的羅布麻葉浸提液，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存2個(gè)月；雙頻超波陳化的步驟：在兩種超波頻率條件下進(jìn)行輪流超波陳化處理，第一種超波條件：200w、20khz的超波20min；第二種超波條件：200w、28khz的超波20min；共超聲2h；調(diào)配檢驗(yàn)的步驟：調(diào)整酒精濃度和糖度，儲(chǔ)藏，確保酒體清亮透明；然后檢驗(yàn)合格后灌裝，即得復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：(1)通過(guò)改進(jìn)泥鰍魚(yú)蛋白多肽的酶解工藝與技術(shù)，采用超波輔助酶解技術(shù)，制備具有降壓活性的多肽，本發(fā)明制備的泥鰍魚(yú)降壓肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無(wú)疑對(duì)延長(zhǎng)泥鰍產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高泥鰍產(chǎn)業(yè)綜合效益，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對(duì)推動(dòng)一帶一路建設(shè)有重大意義。(2)本發(fā)明整個(gè)工藝流程短、時(shí)間短，能耗低、污染少、不使用有毒試劑、無(wú)污染物排放，達(dá)到清潔生產(chǎn)目標(biāo)。(3)在控制酶解過(guò)程中酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后產(chǎn)品的生理功能、原料利用率、反應(yīng)速度，而且也直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和物理化學(xué)特性。酶的選擇、酶解過(guò)程的控制是酶解法制備活性肽的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)篩選出復(fù)合酶和木瓜蛋白酶來(lái)水解泥鰍魚(yú)蛋白，并且篩選出最優(yōu)的用酶條件，對(duì)泥鰍魚(yú)蛋白的酶解效果最好。由于各種酶由于酶作用位點(diǎn)的特異性，對(duì)同一底物泥鰍蛋白具有不同的水解能力。胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶是一種含內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的復(fù)合蛋白酶，它的專一性較弱，能廣泛水解多個(gè)位點(diǎn)，如arg-，lys-，phe-，try-。木瓜蛋白酶是一種含疏基(-sh)肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，主要作用位點(diǎn)在arg-，lys-，phe-，x-。因此多位點(diǎn)的切割，使其水解產(chǎn)物的水解度和肽得率都較高。上述兩次酶解產(chǎn)物中富含必需氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸、蘇氨酸、賴氨酸。值得一提的是，兩次酶解產(chǎn)物的必需氨基酸含量均高于fao/who推薦的成人模式，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這是由于不同酶的酶切位點(diǎn)對(duì)其酶解產(chǎn)物中氨基酸的組成和數(shù)量有重要影響。泥鰍蛋白酶解產(chǎn)物中的必需氨基酸指數(shù)均高于原料泥鰍蛋白，即可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。(4)由本發(fā)明sephadexg-25凝膠層析過(guò)濾色譜分離純化得到的泥鰍魚(yú)蛋白多肽的分子量介于1000-1300da，該泥鰍魚(yú)蛋白多肽組分降壓作用強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)，并非肽分子量越小或越大其降壓活性越強(qiáng)，肽的活性也受其氨基酸的組成、排序或肽的空間結(jié)構(gòu)等因素的影響，由本發(fā)明純化得到的分子量介于1000-1300da泥鰍魚(yú)蛋白多肽其降壓活性最強(qiáng)。另外，本發(fā)明的分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。具體實(shí)施方式下面，結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，需要說(shuō)明的是，在不相沖突的前提下，以下描述的各實(shí)施例之間或各技術(shù)特征之間可以任意組合形成新的實(shí)施例。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽，為分子量介于1000-1300da的泥鰍魚(yú)降壓肽，該泥鰍魚(yú)降壓肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：前處理的步驟：將鮮活泥鰍魚(yú)用清水靜養(yǎng)24h，撈取瀝干，去掉頭和內(nèi)臟后，用絞肉機(jī)絞成肉泥；蛋白質(zhì)改性的步驟：稱取泥鰍肉泥，按照固液比1:20加入純凈水，然后用鹽酸調(diào)ph值至3.0-5.0，在40-50℃下，微波處理20分鐘，微波的頻率為2500mhz，功率為15kw；之后保溫30-45min，ph值保持在5.0以下，得到改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液；優(yōu)選地，用鹽酸調(diào)ph值至3.5，在45℃下，微波處理。一次酶解的步驟：以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，用鹽酸調(diào)ph值至3.0-5.0，按照底物質(zhì)量百分比為2-3％加入復(fù)合酶拌勻，然后在40-50℃下，微波處理20分鐘，微波的頻率為2500mhz，功率為15kw；ph值保持在5.0以下；復(fù)合酶為由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶復(fù)合而成的復(fù)合酶，胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶的質(zhì)量比為1:(2-3):(3-4)。優(yōu)選地，用鹽酸調(diào)ph值至4，在42℃下，微波處理。胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶均購(gòu)自杭州三葉生物化工廠。二次酶解的步驟：經(jīng)過(guò)第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3.0-5.0，以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，按照底物質(zhì)量百分比為2-3％加入木瓜蛋白酶拌勻，然后在40-50℃下，微波處理20分鐘，微波的頻率為2500mhz，功率為15kw；ph值保持在5.0以下，酶解結(jié)束；優(yōu)選地，木瓜蛋白酶的活力為6×105u/g。用鹽酸調(diào)ph值至4.5，在48℃下，微波處理。木瓜蛋白酶購(gòu)于江門拜奧生物科技有限公司。在控制酶解過(guò)程中酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后產(chǎn)品的生理功能、原料利用率、反應(yīng)速度，而且也直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和物理化學(xué)特性。酶的選擇、酶解過(guò)程的控制是酶解法制備活性肽的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)篩選出復(fù)合酶和木瓜蛋白酶來(lái)水解泥鰍蛋白，并且篩選出最優(yōu)的用酶條件，對(duì)泥鰍魚(yú)蛋白的酶解效果最好。由于各種酶由于酶作用位點(diǎn)的特異性，對(duì)同一底物泥鰍蛋白具有不同的水解能力。胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶是一種含內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的復(fù)合蛋白酶，它的專一性較弱，能廣泛水解多個(gè)位點(diǎn)，如arg-，lys-，phe-，try-。木瓜蛋白酶是一種含疏基(-sh)肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，主要作用位點(diǎn)在arg-，lys-，phe-，x-。因此多位點(diǎn)的切割，使其水解產(chǎn)物的水解度和肽得率都較高。上述兩次酶解產(chǎn)物中富含必需氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸、蘇氨酸、賴氨酸。值得一提的是，兩次酶解產(chǎn)物的必需氨基酸含量均高于fao/who推薦的成人模式，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這是由于不同酶的酶切位點(diǎn)對(duì)其酶解產(chǎn)物中氨基酸的組成和數(shù)量有重要影響。泥鰍蛋白酶解產(chǎn)物中的必需氨基酸指數(shù)均高于原料泥鰍蛋白，即可提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。滅酶的步驟：酶解結(jié)束后再次啟動(dòng)微波加溫至90℃,維持10min，得到滅酶水解液；分離純化的步驟：將滅酶活的水解液降至室溫，調(diào)ph值至5.0-6.0，采用sephadexg-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化滅酶活的水解液；分離純化的步驟具體如下：用ph值為7.0的濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖液平衡凝膠層析柱，柱子尺寸為1.6cm×70cm，填料為葡聚糖凝膠樹(shù)脂sephadexg-25，流速為1.0ml/min；將滅酶活的水解液溶于磷酸鹽緩沖液配置成20mg/ml的溶液，上柱，用ph值為7.0濃度為0.02mol/l磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2ml/min，并用分步收集器收集洗脫液，4ml/管，于256nm下檢測(cè)吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，然后進(jìn)行濃縮。凝膠過(guò)濾色譜是利用具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，據(jù)被分離物的分子量大小不同來(lái)進(jìn)行分離。當(dāng)混合肽溶液通過(guò)凝膠柱時(shí)，由于凝膠含有大量微孔，只允許緩沖液和相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽進(jìn)入其中，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的肽卻被排阻在凝膠顆粒外部，在填料間隙中流動(dòng)，比相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽更早地被洗脫下來(lái)，待分離的肽組分就按不同相對(duì)分子質(zhì)量被篩分開(kāi)來(lái)。由本發(fā)明sephadexg-25凝膠層析過(guò)濾色譜分離純化得到的泥鰍魚(yú)蛋白多肽的分子量介于1000-1300da，該泥鰍魚(yú)蛋白多肽組分降壓作用強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)，并非肽分子量越小或越大其降壓活性越強(qiáng)，肽的活性也受其氨基酸的組成、排序或肽的空間結(jié)構(gòu)等因素的影響，由本發(fā)明純化得到的分子量介于1000-1300da泥鰍魚(yú)蛋白多肽其降壓活性最強(qiáng)。另外，本發(fā)明的分離條件溫和、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。高壓蒸汽滅菌的步驟：經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；殺菌處理是肽類物質(zhì)在加工過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，恰當(dāng)?shù)臍⒕に嚥粌H能殺滅微生物、鈍化酶的活性，延長(zhǎng)肽類物質(zhì)的保質(zhì)時(shí)間，另外，還能生成一些特殊的活性物質(zhì)，對(duì)降壓作用有一定輔助作用。濃縮干燥的步驟：將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得泥鰍魚(yú)降壓肽。一種復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒的制備方法，由上述的泥鰍魚(yú)蛋白多肽釀制而成，包括如下步驟：輔料中藥浸提液的步驟：將羅布麻葉粉碎后，加入4倍量濃度為65％的米酒浸提，在超聲波條件下輔助降壓功能成分的浸出，浸提液經(jīng)離心分離制得，羅布麻葉浸提液；勾兌的步驟：以濃度為30％米酒為基液，加入25-30％基酒重量的泥鰍魚(yú)蛋白多肽以及10-15％基酒重量的羅布麻葉浸提液，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存2個(gè)月；雙頻超波陳化的步驟：在兩種超波頻率條件下進(jìn)行輪流超波陳化處理，第一種超波條件：200w、20khz的超波20min；第二種超波條件：200w、28khz的超波20min；共超聲2h；調(diào)配檢驗(yàn)的步驟：調(diào)整酒精濃度和糖度，儲(chǔ)藏，確保酒體清亮透明；然后檢驗(yàn)合格后灌裝，即得復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒。本發(fā)明的多肽酒的檢測(cè)指標(biāo)包括企標(biāo)感官與理化指標(biāo)，如表1-2：表1感官要求表2檢驗(yàn)理化指標(biāo)羅布麻葉，學(xué)名：a.venetuml.，別稱紅麻、茶葉花、紅柳子等，直立半灌木，高1.5-3米，一般高約2米，最高可達(dá)4米，生長(zhǎng)于河岸、山溝、山坡的砂質(zhì)地，在中國(guó)淮河、秦嶺、昆侖山以北各省(自治區(qū))都有羅布麻分布。其性味甘苦，涼。歸肝經(jīng)。有清火，降壓，強(qiáng)心，利尿。用于肝陽(yáng)眩暈，心悸失眠，浮腫尿少；高血壓病等病。泥鰍魚(yú)蛋白多肽與羅布麻葉均有降壓的作用，本發(fā)明以泥鰍魚(yú)蛋白多肽為主要添加的降壓成分，羅布麻葉為輔助添加的降壓成分，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用。另外，超波陳化采用雙頻條件下進(jìn)行陳化，由于雙頻率的超聲波使酒液內(nèi)部出現(xiàn)兩種波的加強(qiáng)點(diǎn)和減弱點(diǎn)，在兩種不同波的減弱點(diǎn)處，由于其相對(duì)壓力較小，因此容易形成不同微小的氣泡，而當(dāng)這些氣泡運(yùn)動(dòng)到兩種不同波的加強(qiáng)點(diǎn)時(shí)，由于壓力較大，而使這些氣泡破裂。在氣泡的生成和破裂過(guò)程中產(chǎn)生了兩種巨大的能量，加速了酒液中各成分分子健的斷裂和生成，提高了分子間的有效碰撞率，增強(qiáng)了極性分子間的親合力，不僅增強(qiáng)了酒精分子與水分子之間的締合度，而且可能形成更大且牢固的極性分子間的締合群，從而使酒液中醇類、醛類、酸類以及酯類獲得巨大的能量，加速發(fā)生聚合、醛化、酸化、酯化以及裂解等一系列復(fù)雜反應(yīng)，令體系中的酯類分子產(chǎn)生，某些酯類及酸類等成分也可能奉與這種締合群，加速酒液的熟化，使酒在香氣、口感上都能更加上乘。實(shí)施例1一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽，為分子量介于1000-1300da的泥鰍魚(yú)降壓肽，該泥鰍魚(yú)降壓肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：前處理的步驟：將鮮活泥鰍魚(yú)用清水靜養(yǎng)24h，撈取瀝干，去掉頭和內(nèi)臟后，用絞肉機(jī)絞成肉泥；蛋白質(zhì)改性的步驟：稱取泥鰍肉泥，按照固液比1:20加入純凈水，然后用鹽酸調(diào)ph值至3.5，在45℃下，微波處理20分鐘，微波的頻率為2500mhz，功率為15kw；之后保溫40min，ph值保持在5.0以下，得到改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液；一次酶解的步驟：以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，用鹽酸調(diào)ph值至4.0，按照底物質(zhì)量百分比為2-3％加入復(fù)合酶拌勻，然后在42℃下，微波處理20分鐘，微波的頻率為2500mhz，功率為15kw；ph值保持在5.0以下；復(fù)合酶為由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶復(fù)合而成的復(fù)合酶，胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶的質(zhì)量比為1:3:3。二次酶解的步驟：經(jīng)過(guò)第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至4.5，以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，按照底物質(zhì)量百分比為2.5％加入木瓜蛋白酶拌勻，然后在48℃下，微波處理20分鐘，微波的頻率為2500mhz，功率為15kw；ph值保持在5.0以下，酶解結(jié)束；滅酶的步驟：酶解結(jié)束后再次啟動(dòng)微波加溫至90℃,維持10min，得到滅酶水解液；分離純化的步驟：將滅酶活的水解液降至室溫，用ph值為7.0的濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖液平衡凝膠層析柱，柱子尺寸為1.6cm×70cm，填料為葡聚糖凝膠樹(shù)脂sephadexg-25，流速為1.0ml/min；將滅酶活的水解液溶于磷酸鹽緩沖液配置成20mg/ml的溶液，上柱，用ph值為7.0濃度為0.02mol/l磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2ml/min，并用分步收集器收集洗脫液，4ml/管，于256nm下檢測(cè)吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，然后進(jìn)行濃縮。高壓蒸汽滅菌的步驟：經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；濃縮干燥的步驟：將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得泥鰍魚(yú)降壓肽。實(shí)施例2一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽，為分子量介于1000-1300da的泥鰍魚(yú)降壓肽，該泥鰍魚(yú)降壓肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：前處理的步驟：將鮮活泥鰍魚(yú)用清水靜養(yǎng)24h，撈取瀝干，去掉頭和內(nèi)臟后，用絞肉機(jī)絞成肉泥；蛋白質(zhì)改性的步驟：稱取泥鰍肉泥，按照固液比1:20加入純凈水，然后用鹽酸調(diào)ph值至3.0，在40℃下，微波處理20分鐘，之后保溫30min，ph值保持在5.0以下，得到改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液；一次酶解的步驟：以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，用鹽酸調(diào)ph值至3.0，按照底物質(zhì)量百分比為2％加入復(fù)合酶拌勻，然后在40℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在5.0以下；二次酶解的步驟：經(jīng)過(guò)第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3.0，以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，按照底物質(zhì)量百分比為2％加入木瓜蛋白酶拌勻，然后在40℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在5.0以下，酶解結(jié)束；滅酶的步驟：酶解結(jié)束后再次啟動(dòng)微波加溫至90℃,維持10min，得到滅酶水解液；分離純化的步驟：將滅酶活的水解液降至室溫，調(diào)ph值至5.0，采用sephadexg-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化滅酶活的水解液；高壓蒸汽滅菌的步驟：經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；濃縮干燥的步驟：將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得泥鰍魚(yú)降壓肽。實(shí)施例3一種泥鰍魚(yú)蛋白多肽，為分子量介于1000-1300da的泥鰍魚(yú)降壓肽，該泥鰍魚(yú)降壓肽釆用微波輔助酶解技術(shù)制備而得，該制備方法包括如下步驟：前處理的步驟：將鮮活泥鰍魚(yú)用清水靜養(yǎng)24h，撈取瀝干，去掉頭和內(nèi)臟后，用絞肉機(jī)絞成肉泥；蛋白質(zhì)改性的步驟：稱取泥鰍肉泥，按照固液比1:20加入純凈水，然后用鹽酸調(diào)ph值至5.0，在50℃下，微波處理20分鐘，之后保溫45min，ph值保持在5.0以下，得到改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液；一次酶解的步驟：以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，用鹽酸調(diào)ph值至5.0，按照底物質(zhì)量百分比為3％加入復(fù)合酶拌勻，然后在50℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在5.0以下；二次酶解的步驟：經(jīng)過(guò)第一次酶解處理后，將第一次酶解液降至常溫，再次用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至5.0，以改性泥鰍魚(yú)蛋白溶液為底物，按照底物質(zhì)量百分比為3％加入木瓜蛋白酶拌勻，然后在50℃下，微波處理20分鐘，ph值保持在5.0以下，酶解結(jié)束；滅酶的步驟：酶解結(jié)束后再次啟動(dòng)微波加溫至90℃,維持10min，得到滅酶水解液；分離純化的步驟：將滅酶活的水解液降至室溫，調(diào)ph值至6.0，采用sephadexg-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化滅酶活的水解液；高壓蒸汽滅菌的步驟：經(jīng)分離純化的水解液在溫度為121℃，壓力為0.1mpa的條件下高壓蒸汽滅菌15min；濃縮干燥的步驟：將高壓蒸汽滅菌后的水解液調(diào)ph值至7.0，進(jìn)行濃縮低溫真空干燥，即得泥鰍魚(yú)降壓肽。對(duì)比例1與實(shí)施例1的區(qū)別在于在一次酶解中，復(fù)合酶中胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶的質(zhì)量比不在本發(fā)明限定的范圍內(nèi)，即為胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶的質(zhì)量比1:1:1。對(duì)比例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于去除分離純化的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。實(shí)施例4一種復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒，由如下步驟制成：輔料中藥浸提液的步驟：將羅布麻葉粉碎后，加入4倍量濃度為65％的米酒浸提，在超聲波條件下輔助降壓功能成分的浸出，浸提液經(jīng)離心分離制得，羅布麻葉浸提液；勾兌的步驟：以濃度為30％米酒為基液，加入25-30％基酒重量的泥鰍魚(yú)蛋白多肽以及10-15％基酒重量的羅布麻葉浸提液，攪拌均勻，并密封儲(chǔ)存2個(gè)月；雙頻超波陳化的步驟：在兩種超波頻率條件下進(jìn)行輪流超波陳化處理，第一種超波條件：200w、20khz的超波20min；第二種超波條件：200w、28khz的超波20min；共超聲2h；調(diào)配檢驗(yàn)的步驟：調(diào)整酒精濃度和糖度，儲(chǔ)藏，確保酒體清亮透明；然后檢驗(yàn)合格后灌裝，即得復(fù)方泥鰍魚(yú)蛋白多肽酒。對(duì)比例3與實(shí)施例4的區(qū)別在于去除輔料中藥浸提液的步驟，不添加羅布麻葉浸提液，其余步驟與參數(shù)相同。對(duì)比例4與實(shí)施例4的區(qū)別在于去除雙頻超波陳化的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。下面，對(duì)本發(fā)明制備的泥鰍魚(yú)降壓肽的肽得率、純度以及降壓作用進(jìn)行測(cè)定與驗(yàn)證。1、肽得率的測(cè)定采用三氯乙酸(tca)沉淀法與甲醛滴定法相結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。取10ml酶解液加10ml20％(g/g)tca，攪勻靜置半小時(shí)后在4800r/min下離心10min，所得的上清液記作上清液tca，分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測(cè)定上清液中的總氮含量和氨態(tài)氮含量，則肽氮量和肽得率按下式進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表3：上清液總肽氮量＝上清液tca總氮量－上清液tca總氨態(tài)氮量，肽得率＝上清液總肽氮含量/原料總蛋白氮含量×100％。2、純度的測(cè)定以牛血清白蛋白(bsa)為標(biāo)準(zhǔn)品，制成不同濃度的bsa溶液。向7支試管中分別加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色溶液染色5min。以第1支試管中的溶液為空白對(duì)照，測(cè)定其余6支試管中溶液在595nm處的吸光度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g·l-1)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。得到的線性回歸方程為y＝6.6154x+0.01(r＝0.999)，線性范圍為0-100μg。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，可以用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。分別吸取實(shí)施例1-3所得的泥鰍魚(yú)蛋白多肽作為供試品，在595nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/％，結(jié)果如表3。3、降壓作用的驗(yàn)證降血壓肽通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)的活性而起到降壓作用，以ace抑制率為指標(biāo)，觀察本發(fā)明降血壓肽對(duì)ace抑制率的影響，結(jié)果如表3。使用n-(3-(2-呋喃)丙烯醇酰)-2-苯丙氨酰甘氨酸(fapgg)作為底物，將10μl的ace溶液(0.25u/ml)和10μl蛋白水解液加入微孔板的微孔中但不混合，然后加入150μl經(jīng)過(guò)預(yù)熱的底物(用含0.3mol/lnacl的50mmol/ltris-hcl，ph7.5配制fapgg，使其終濃度為1.0mmol/l)使其開(kāi)始反應(yīng)。迅速將微孔板放入酶標(biāo)儀中并加熱到37℃，每1min記錄1次在340nm波長(zhǎng)處的吸光度，共記錄20min?？瞻讓?duì)照使用10μl的緩沖液(50mmol/l的tris-hcl，ph7.5，包含0.3mol/lnacl)代替蛋白水解液。以吸光度(δa340nm)對(duì)時(shí)間做出曲線，計(jì)算出斜率，通常取10～20min的斜率來(lái)計(jì)算。ic50為抑制50％ace活性時(shí)所需酶解樣品的質(zhì)量濃度。ace抑制率/％＝(1-δa抑制劑/δa空白)×100％表3泥鰍魚(yú)降壓肽的肽得率、純度以及降壓效果肽得率(％)純度(％)ace抑制率(％)實(shí)施例176.8973.878.63實(shí)施例275.4172.175.25實(shí)施例374.3270.676.85對(duì)比例151.1223.657.31對(duì)比例235.6221.855.66實(shí)施例4--83.29對(duì)比例3--65.17對(duì)比例4--59.36本發(fā)明實(shí)施例1-3制備的泥鰍魚(yú)降壓肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無(wú)疑對(duì)延長(zhǎng)泥鰍產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高泥鰍產(chǎn)業(yè)綜合效益，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對(duì)推動(dòng)一帶一路建設(shè)有重大意義。而對(duì)比例1-2制備的泥鰍魚(yú)降壓肽的肽得率與本發(fā)明相比具有較大差異，說(shuō)明本發(fā)明的復(fù)合酶中胰凝乳蛋白酶、羧肽酶a和胰蛋白酶的質(zhì)量比及分離純化的步驟對(duì)整個(gè)肽得率高，純度高影響較大。實(shí)施例4與5的數(shù)據(jù)說(shuō)明，本發(fā)明泥鰍魚(yú)蛋白多肽與羅布麻葉兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用。不添加羅布麻葉，其ace抑制率會(huì)下降將近20％，也就是說(shuō)其降壓效果也會(huì)下降；另外，實(shí)施例4與6的數(shù)據(jù)說(shuō)明，本泥鰍魚(yú)蛋白多肽與羅布麻葉兩者的協(xié)同增效作用跟雙頻超波陳化的步驟有關(guān)，去除雙頻超波陳化的步驟，其降壓效果也會(huì)下降。上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12