本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體是一種利用廉價(jià)原料生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法。
背景技術(shù)：
：四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)又名川芎嗪，是中藥川芎根莖的主要活性生物堿成分，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板黏附聚集和血栓形成等良好的藥理作用，在治療心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和腎小球疾病等方面具有一定療效，已作為常備藥品廣泛應(yīng)用于臨床。此外，四甲基吡嗪天然存在于乳制品、豆制品、可可、咖啡、花生、榛子、和白酒中，具有烘烤和堅(jiān)果的特殊香味。四甲基吡嗪也是是中國白酒中的重要香氣化合物，在中國傳統(tǒng)白酒中均檢測到一定量的四甲基吡嗪，其不僅對中國白酒風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，而且還賦予了中國白酒有益健康的功能。四甲基吡嗪香味閾值極低，國家標(biāo)準(zhǔn)gb2760-1996規(guī)定其為允許使用的食用香料，目前廣泛應(yīng)用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、卷煙等香精的調(diào)配。四甲基吡嗪的生產(chǎn)方法可分為植物提取法、化學(xué)法和生物合成法。利用萃取的方法可從中藥川芎根莖中提取四甲基吡嗪，但是川芎植物來源有限，而且川芎根莖中的四甲基吡嗪含量較低，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。化學(xué)法合成四甲基吡嗪的反應(yīng)條件一般較劇烈，對設(shè)備要求較高，普遍存在較嚴(yán)峻的環(huán)保問題，且產(chǎn)品不屬于“天然”或“生物合成”范疇，安全性和品質(zhì)問題正在受到不斷的質(zhì)疑。生物化工方法生產(chǎn)的四甲基吡嗪具有產(chǎn)品綠色天然、成本低、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，隨著人們對綠色產(chǎn)品需求的日益提高，該法受到越來越多的關(guān)注。然而，由于利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶因并將其轉(zhuǎn)化為四甲基吡嗪的相關(guān)研究起步較晚，通過生物技術(shù)途徑生產(chǎn)四甲基吡嗪的技術(shù)遠(yuǎn)未成熟。中國專利201010238685.5公開了一種生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法及其生產(chǎn)菌株，篩選的bacillussubtilisxz1124，bacilluslicheniformisbl-l1、mt-6和mt-15，利用葡萄糖為碳源、酵母膏為氮源時(shí)，在發(fā)酵罐中乙偶因積累量為30-44g/l，但周期長達(dá)72h，而且副產(chǎn)物的積累導(dǎo)致葡萄糖的轉(zhuǎn)化率太低。發(fā)酵液離心取上清加入2倍相應(yīng)乙偶姻摩爾濃度的磷酸氫二銨，在55-90℃水浴搖床(轉(zhuǎn)速150rpm)反應(yīng)20h，四甲基吡嗪的濃度為11-20g/l。該發(fā)明工藝較為簡單，但所使用的菌種為野生型菌株，發(fā)酵過程中會積累各種副產(chǎn)物，降低了原料的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而影響了四甲基吡嗪的得率。微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻時(shí)，糖酵解過程會產(chǎn)生的大量還原型輔酶nadh，而乙偶姻及四甲基吡嗪的產(chǎn)生并不能消耗nadh，因此微生物細(xì)胞會啟動(dòng)乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸等副產(chǎn)物的合成途徑來消耗過量的nadh，實(shí)現(xiàn)氧化型輔酶nad+的再生，這些副產(chǎn)物的積累不但降低了原料的轉(zhuǎn)化率和四甲基吡嗪產(chǎn)量，還會抑制微生物的生長和發(fā)酵。為了提高乙偶姻及四甲基吡嗪的收率，需要使用輔酶工程策略優(yōu)化胞內(nèi)nadh/nad+的比例，如表達(dá)nadh氧化酶直接催化nadh轉(zhuǎn)化為nad+，并同時(shí)使用代謝工程技術(shù)手段阻斷或削弱主要副產(chǎn)物的合成途徑。此外，該發(fā)明需要使用高價(jià)的酵母膏為氮源，而且碳源葡萄糖為高純糖，也存在成本較高的問題，進(jìn)一步降低了該法的經(jīng)濟(jì)可行性。微生物發(fā)酵的培養(yǎng)基成分對生產(chǎn)成本影響很大，高純糖(葡萄糖)的使用會增加原料成本。此外，酵母粉/酵母膏由于富含氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分，常被用作氮源來發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻和四甲基吡嗪，但其使用通常會大大增加生產(chǎn)成本，例如某些乳酸發(fā)酵中酵母粉成本可占總發(fā)酵成本的30％。因此，發(fā)酵工藝優(yōu)化時(shí)還需要開發(fā)利用廉價(jià)氮源(如棉籽粉)來代替酵母粉/酵母膏等高價(jià)氮源。綜上所述，利用輔酶工程優(yōu)化胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，利用代謝工程來阻斷主要副產(chǎn)物的合成途徑，以及開發(fā)能夠高效利用的廉價(jià)原料，對于實(shí)現(xiàn)四甲基吡嗪的工業(yè)化生產(chǎn)極為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對四甲基吡嗪生產(chǎn)存在的副產(chǎn)物積累過多、四甲基吡嗪得率低、生產(chǎn)周期太長或原料成本太高，難以工業(yè)化生產(chǎn)的不足，提供一種利用廉價(jià)原料生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法。本發(fā)明利用代謝工程和輔酶調(diào)控對關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行合理的遺傳改造，削弱主要副產(chǎn)物合成途徑來強(qiáng)化乙偶因合成途徑，并有效調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，提高前體物質(zhì)乙偶因的產(chǎn)量，達(dá)到高產(chǎn)四甲基吡嗪的目的。本發(fā)明還提供利用非糧木薯粉和廉價(jià)氮源作為發(fā)酵原料生產(chǎn)四甲基吡嗪，代替高純糖和高價(jià)氮源，可大幅降低原料成本。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種利用廉價(jià)原料生產(chǎn)四甲基吡嗪的方法，包括以下步驟：(1)將α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和nadh氧化酶基因的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化；(2)將經(jīng)密碼子優(yōu)化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和nadh氧化酶基因進(jìn)行拼接獲得包含該三個(gè)基因的基因簇；(3)將基因簇插入表達(dá)載體中，獲得多順反子重組質(zhì)粒；(4)將多順反子重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌e.coli，獲得生產(chǎn)乙偶姻的基因工程菌株；(5)對木薯粉、氮源原料進(jìn)行水解，得發(fā)酵培養(yǎng)基，將活化的生產(chǎn)乙偶姻的基因工程菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液；(6)取上述發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，取上清液，再加入磷酸氫二銨，乙偶姻與nh4+反應(yīng)合成四甲基吡嗪。進(jìn)一步地，所述α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脫羧酶基因和nadh氧化酶基因的密碼子優(yōu)化的具體步驟是在每個(gè)基因的前面添加含核糖體結(jié)合位點(diǎn)和間隔序列的核苷酸序列taaggaggatataca。在細(xì)胞內(nèi)，核糖體負(fù)責(zé)將mrna翻譯成蛋白質(zhì)，16srrna是核糖體的一個(gè)亞基，它可與核糖體結(jié)合位點(diǎn)通過堿基互補(bǔ)原則精確識別，在基因前面添加taaggaggatatac序列，可以增強(qiáng)核糖體與mrna的識別與結(jié)合能力，而適當(dāng)?shù)拈g隔序列也可以提高翻譯效率，在相同的轉(zhuǎn)錄水平下，提高了α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶和nadh氧化酶的活力，酶促反應(yīng)加快，最終提高乙偶姻的合成能力。進(jìn)一步地，所述宿主菌e.coli為多基因缺失的突變菌株，通過疊加敲除菌株中合成副產(chǎn)物的關(guān)鍵基因而獲得；所述副產(chǎn)物包括2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸；所述合成副產(chǎn)物的關(guān)鍵基因包括glda、frdabcd、ldha和pta。進(jìn)一步地，所述的α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脫羧酶基因的來源菌株選自enterobactercloacae、klebsiellapneumoniae、enterobacteraerogenes、klebsiellaoxytoca、serratiamarcescens和bacilluslicheniformis。進(jìn)一步地，所述的nadh氧化酶基因的來源菌株選自lactobacillusbrevis、lactococcuslactis、streptococcuspyogenes、clostridiumaminovalericum和bacillussubtilis。進(jìn)一步地，所述步驟(5)的具體操作步驟為：s1：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化鈣，在80-100℃下液化0.5-5h，靜置冷卻；當(dāng)溫度降低至55℃以下時(shí)，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20h，調(diào)節(jié)ph6.5-7.5，離心或過濾收集上清，稀釋上清液后在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；按1000ml水計(jì)，各組分的用量為：木薯粉100-200g，氮源原料40-80g，液化酶0.5-2ml，氯化鈣0.01-0.5g，糖化酶0.2-1ml，蛋白酶0.05～0.5g；所述木薯粉是將木薯去皮曬干后經(jīng)粉碎過50-200目篩制備而得，所述氮源原料為棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉中的一種或多種組合；s2：在無菌條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-100μg/ml氨芐青霉素，然后移至發(fā)酵罐中，將經(jīng)活化的生產(chǎn)乙偶姻的工程菌菌液以體積比為1-10％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度35-42℃、攪拌轉(zhuǎn)速200-800rpm、通氣量0.5-1.5vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)20-72h，當(dāng)檢測發(fā)酵液中乙偶姻的濃度不再增加時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液。進(jìn)一步地，所述活化的生產(chǎn)乙偶姻的工程菌菌液的制備方法，包括以下步驟：將生產(chǎn)乙偶姻基因工程菌株劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂和含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，在37℃培養(yǎng)10-15h；在無菌的條件下，挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體種子培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)10-15h；所述lb培養(yǎng)基的配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。進(jìn)一步地，在步驟s2的發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵液中葡萄糖的濃度，當(dāng)葡萄糖濃度降至10-30g/l時(shí)，補(bǔ)加木薯還原糖母液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度為40-80g/l；所述木薯還原糖母液的葡萄糖濃度為500-800g/l。進(jìn)一步地，所述步驟(6)的具體操作步驟為：將含有乙偶姻的發(fā)酵液高速離心，去除沉淀，取上清液測定乙偶姻的含量，然后加入乙偶姻1-2.5倍摩爾濃度的磷酸氫二銨，溶解后，調(diào)節(jié)ph至7.5，在65-95℃水浴搖床中反應(yīng)6-20h，即得四甲基吡嗪。進(jìn)一步地，水浴搖床反應(yīng)過程中加入乙偶姻0.1-2倍摩爾濃度的過氧化氫。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果為：1、本發(fā)明提供的菌株能有效利用來源廣泛、成本低廉的原料生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻，氧化型輔酶nad+能夠有效再生，可提高乙偶姻產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，從而有效降低四甲基吡嗪的生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。2、本發(fā)明菌株的構(gòu)建方法具有操作簡便、生產(chǎn)效率高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。3、本發(fā)明利用代謝工程技術(shù)敲除宿主菌中合成主要副產(chǎn)物的關(guān)鍵基因，并表達(dá)nadh氧化酶有效調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，提高前體物質(zhì)乙偶因的產(chǎn)量，最終提高四甲基吡嗪的得率。4、本發(fā)明利用非糧木薯粉為碳源，棉籽蛋白粉、豆粕粉或豆餅粉為氮源，替代已有報(bào)道使用的高純糖(如葡萄糖)、酵母粉用于發(fā)酵生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻及四甲基吡嗪，不僅可以提高這些廉價(jià)原料的綜合利用價(jià)值，還為四甲基吡嗪的生產(chǎn)提供了更加廉價(jià)的原料，可大幅降低原料成本。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不限于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中所涉及的材料：液化酶、糖化酶、蛋白酶為商業(yè)化產(chǎn)品，可購于諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司等公司；棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉為商業(yè)化產(chǎn)品，可購于青島科瑞培養(yǎng)基有限公司等公司。下述實(shí)施例在生產(chǎn)四甲基吡嗪過程中，采用sba-40c分析儀檢測發(fā)酵液中葡萄糖濃度，利用液相色譜測定主要副產(chǎn)物的濃度，利用氣相色譜測定乙偶姻、四甲基吡嗪的濃度。一、生產(chǎn)乙偶姻基因工程菌株的構(gòu)建實(shí)施例1生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp1的構(gòu)建：將來源于enterobactercloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budb、α-乙酰乳酸脫羧酶基因buda和來源于lactobacillusbrevis的nadh氧化酶基因noxe的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在每個(gè)基因前面添加含核糖體結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列taaggaggatataca，然后利用人工合成的方法獲得基因簇budb-buda-noxe，其核苷酸序列長度為3849個(gè)堿基，核苷酸序列如seqidno.1所述。利用雙酶切與連接的方法，將基因簇budb-buda-noxe插入質(zhì)粒ptrc99a的啟動(dòng)子后面，獲得多順反子重組質(zhì)粒ptrc99a-budb-buda-noxe，再將重組質(zhì)粒ptrc99a-budb-buda-noxe導(dǎo)入宿主菌e.colimg1655，獲得產(chǎn)乙偶姻的基因工程菌株ectmp1。實(shí)施例2生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp2的構(gòu)建：通過分析發(fā)現(xiàn)工程菌株ectmp1發(fā)酵的主要副產(chǎn)物為2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸，其合成途徑的關(guān)鍵基因是glda、frdabcd、ldha和pta。利用大腸桿菌噬菌體來源的red重組系統(tǒng)可在細(xì)菌內(nèi)高效介導(dǎo)同源重組事件的原理，先用兩側(cè)帶有frt位點(diǎn)的抗生素抗性基因取代上述目標(biāo)基因，再通過誘導(dǎo)外源性溫敏質(zhì)粒表達(dá)flp重組酶刪除抗生素抗性基因達(dá)到敲除目標(biāo)基因的目的，具體步驟如下：將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；利用引物進(jìn)行pcr構(gòu)建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并將其直接轉(zhuǎn)化入含pkd46的宿主細(xì)胞；氯霉素平板篩選發(fā)生同源重組的克?。焕脺y序技術(shù)驗(yàn)證、挑選目標(biāo)基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pcp20質(zhì)粒刪除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因刪除的克隆連續(xù)劃線傳代三次，制備甘油管-20℃保存。通過疊加敲除，可獲得多基因缺失的突變株e.colimg1655/δgldaδfrdabcdδldhaδpta，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將實(shí)施例1構(gòu)建的多順反子重組質(zhì)粒ptrc99a-budb-buda-noxe電轉(zhuǎn)導(dǎo)入多基因缺失突變株，獲得工程菌株ectmp2。表1各引物的核苷酸序列表實(shí)施例3生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp3的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脫羧酶基因的來源菌株為klebsiellapneumoniae，nadh氧化酶基因的來源菌株為lactococcuslactis。實(shí)施例4生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp4的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例2的不同之處是：將實(shí)施例3構(gòu)建的多順反子重組質(zhì)粒導(dǎo)入多基因缺失突變株，獲得工程菌株ectmp4。實(shí)施例5生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp5的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脫羧酶基因的來源菌株為serratiamarcescens，nadh氧化酶基因的來源菌株為streptococcuspyogenes。實(shí)施例6生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp6的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例2的不同之處是：將實(shí)施例5構(gòu)建的多順反子重組質(zhì)粒導(dǎo)入多基因缺失突變株，獲得工程菌株ectmp6。實(shí)施例7生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp7的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脫羧酶基因的來源菌株為enterobacteraerogenes，nadh氧化酶基因的來源菌株為bacillussubtilis，宿主菌為e.colibw25113。實(shí)施例8生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp8的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脫羧酶基因的來源菌株為klebsiellaoxytoca，nadh氧化酶基因的來源菌株為lactobacillusrhamnosus，宿主菌為e.colibw25113。實(shí)施例9生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻基因工程菌株ectmp9的構(gòu)建：本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處是：α-乙酰乳酸合成酶基因和α-乙酰乳酸脫羧酶基因的來源菌株為bacilluslicheniformis，nadh氧化酶基因的來源菌株為clostridiumaminovalericum。實(shí)施例3-9合成基因簇的方法與實(shí)施例1相同，或?yàn)楝F(xiàn)有常規(guī)技術(shù)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過本申請公開的內(nèi)容獲悉該基因簇的核苷酸序列，對此不再累述實(shí)施例3-10對應(yīng)合成的基因簇的核苷酸序列。二、工程菌株在生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻的應(yīng)用應(yīng)用實(shí)施例1工程菌株ectmp1、ectmp2、ectmp3、ectmp4、ectmp5、ectmp6、ectmp7、ectmp8、ectmp9在生產(chǎn)前體物質(zhì)乙偶姻的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)將木薯去皮曬干后，粉碎至粒徑為100目的木薯粉；稱取木薯粉180g九份，分別加入燒杯中，每份再各補(bǔ)加入60g棉籽蛋白粉、1000ml自來水、0.5ml液化酶和0.2g氯化鈣，充分搖勻后，95℃液化1.5h，靜置冷卻；溫度降低至55℃以下時(shí)，加入0.5ml糖化酶和0.1g蛋白酶，在55℃糖化20h，調(diào)節(jié)ph7.5，離心收集上清，用無菌自來水稀釋上清液使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100μg/ml氨芐青霉素，分別取500ml轉(zhuǎn)移至上海百侖六聯(lián)發(fā)酵罐，在無菌條件下，取活化好的ectmp1、ectmp2、ectmp3、ectmp4、ectmp5、ectmp6、ectmp7、ectmp8、ectmp9工程菌菌液分別以體積比為5％的接種量分別接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm、通氣量1vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵16h、28h分別補(bǔ)糖50g/l，至乙偶姻濃度不再增加時(shí)結(jié)束發(fā)酵，獲得乙偶姻的發(fā)酵液。取樣并利用氣相色譜和液相色譜測定產(chǎn)物乙偶姻及副產(chǎn)物丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸的濃度，結(jié)果如表2所示。所述工程菌菌液的活化方法：將生產(chǎn)乙偶姻的ectmp1、ectmp2、ectmp3、ectmp4、ectmp5、ectmp6、ectmp7、ectmp8、ectmp9工程菌株分別劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂的并含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)12h；用牙簽挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)10h；所述的lb培養(yǎng)基配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。表2不同工程菌株的發(fā)酵產(chǎn)物工程菌株乙偶姻(g/l)丁二醇(g/l)丁二酸(g/l)乳酸(g/l)乙酸(g/l)ectmp160.52.83.52.73.6ectmp271.20.40.10.40.3ectmp352.33.83.33.13.9ectmp463.10.500.30.5ectmp545.23.53.92.73.4ectmp653.30.50.20.60.2ectmp748.23.52.82.63.7ectmp851.83.63.22.22.8ectmp946.33.23.52.52.9從表2中可以得知，敲除副產(chǎn)物合成途徑的關(guān)鍵基因glda、frdabcd、ldha和pta，工程菌株ectmp2、ectmp4、ectmp6的前體物質(zhì)乙偶姻產(chǎn)量，與未經(jīng)過基因敲除的工程菌株(分別對應(yīng)于ectmp1、ectmp3、ectmp5)相比顯著提高，乙偶姻的副產(chǎn)物2，3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸的濃度大大降低，因此敲除副產(chǎn)物合成途徑的關(guān)鍵基因提高了前體物質(zhì)乙偶姻產(chǎn)量，能夠降低四甲基吡嗪的生產(chǎn)成本。應(yīng)用實(shí)施例2工程菌株ectmp2在生產(chǎn)乙偶姻的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)將木薯去皮曬干后，粉碎至粒徑為100目的木薯粉；稱取木薯粉200g三份，分別加入燒杯中，再分別加入70g豆粕粉、70g豆餅粉、70g棉籽蛋白粉，再加入1000ml自來水、1.2ml液化酶和0.5g氯化鈣，充分搖勻后，90℃液化2h，靜置冷卻；溫度降低至50℃以下時(shí)，加入0.3ml糖化酶和0.2g蛋白酶，在55℃糖化24h，調(diào)節(jié)ph6.5，離心收集上清，用無菌自來水稀釋上清液使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中100μg/ml氨芐青霉素，分別取500ml添加至上海百侖六聯(lián)發(fā)酵罐，在無菌條件下，取經(jīng)活化的ectmp2工程菌菌液以體積比為10％的接種量接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度40℃、攪拌轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1.0vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵12h和24h分別補(bǔ)40g/l葡萄糖，發(fā)酵液中乙偶姻的濃度不再增加時(shí)發(fā)酵結(jié)束，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液。測定豆粕粉、豆餅粉、棉籽蛋白粉對應(yīng)的乙偶姻產(chǎn)量分別是59.3g/l、63.8g/l、73.3g/l。所述ectmp2工程菌菌液的活化方法：將ectmp2工程菌株分別劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂的并含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)15h；在無菌的條件下，用牙簽挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h；所述的lb培養(yǎng)基配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。應(yīng)用實(shí)施例3工程菌株ectmp4在生產(chǎn)乙偶姻的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)將木薯去皮曬干后，粉碎至粒徑為150目的木薯粉；稱取木薯粉185g，加入燒杯中，再加入25g棉籽蛋白粉和15g豆餅粉，再加入1000ml自來水、0.8ml液化酶和0.3g氯化鈣，充分搖勻后，95℃液化2h，靜置冷卻；溫度降低至55℃以下時(shí)，加入0.8ml糖化酶和0.3g蛋白酶，在55℃糖化18h，調(diào)節(jié)ph7.0，離心收集上清，用無菌自來水稀釋上清液使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100μg/ml氨芐青霉素，取500ml轉(zhuǎn)移至上海百侖六聯(lián)發(fā)酵罐，在無菌條件下，取經(jīng)活化的ectmp4工程菌菌液以體積比為8％的接種量接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速500rpm、通氣量0.7vvm條件下進(jìn)行發(fā)酵，15h和28h分別補(bǔ)50g/l的葡萄糖，發(fā)酵45h后，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液。經(jīng)過測定乙偶姻產(chǎn)量為67.2g/l。所述ectmp4工程菌菌液的活化方法：將ectmp4工程菌株分別劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂的并含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)10h；在無菌的條件下，用牙簽挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)15h；所述的lb培養(yǎng)基配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。應(yīng)用實(shí)施例4工程菌株ectmp5在生產(chǎn)乙偶姻的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)將木薯去皮曬干后，粉碎至粒徑為50目的木薯粉；稱取木薯粉100g，加入燒杯中，加入30g棉籽蛋白粉和30g豆粕粉，再加入1000ml自來水、2.0ml液化酶和0.01g氯化鈣，充分搖勻后，80℃液化5h，靜置冷卻；溫度降低至55℃以下時(shí)，加入0.2ml糖化酶和0.05g蛋白酶，在60℃糖化5h，調(diào)節(jié)ph7.0，離心收集上清，用無菌自來水稀釋上清液使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50μg/ml氨芐青霉素，取500ml轉(zhuǎn)移至上海百侖六聯(lián)發(fā)酵罐，在無菌條件下，取經(jīng)活化的ectmp5工程菌菌液以體積比為1％的接種量接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度42℃、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm、通氣量1.3vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)16h后補(bǔ)糖40g/l，發(fā)酵32h后再次補(bǔ)加等量木薯還原糖母液，發(fā)酵48h后，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液。經(jīng)過測定乙偶姻產(chǎn)量為48.3g/l。所述ectmp5工程菌菌液的活化方法：將ectmp5工程菌株分別劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂的并含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)12h；在無菌的條件下，用牙簽挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h；所述的lb培養(yǎng)基配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。應(yīng)用實(shí)施例5工程菌株ectmp6在生產(chǎn)乙偶姻的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)將木薯去皮曬干后，粉碎至粒徑為200目的木薯粉；稱取木薯粉155g，加入燒杯中，加入40g豆粕粉、20g棉籽蛋白粉和20g豆餅粉，再加入1000ml自來水、1.5ml液化酶和0.5g氯化鈣，充分搖勻后，100℃液化1h，靜置冷卻；溫度降低至55℃以下時(shí)，加入1ml糖化酶和0.5g蛋白酶，在50℃糖化20h，調(diào)節(jié)ph7.0，離心收集上清，用無菌自來水稀釋上清液使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加80μg/ml氨芐青霉素，取500ml轉(zhuǎn)移至上海百侖六聯(lián)發(fā)酵罐，在無菌條件下，取經(jīng)活化的ectmp7工程菌菌液以體積比為5％的接種量接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速700rpm、通氣量0.5vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)14h后補(bǔ)糖50g/l，發(fā)酵28h、45h后分別補(bǔ)加30g/l木薯還原糖母液，發(fā)酵60h后，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液。經(jīng)過測定乙偶姻產(chǎn)量為68.5g/l。所述ectmp6工程菌菌液的活化方法：將ectmp6工程菌株分別劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂的并含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)10h；在無菌的條件下，用牙簽挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)15h；所述的lb培養(yǎng)基配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。應(yīng)用實(shí)施例6工程菌株ectmp7在生產(chǎn)乙偶姻的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)將木薯去皮曬干后，粉碎至粒徑為100目的木薯粉；稱取木薯粉150g，加入燒杯中，再加入40g棉籽蛋白粉和30g豆餅粉，再加入1000ml自來水、1.0ml液化酶和0.2g氯化鈣，充分搖勻后，90℃液化3h，靜置冷卻；溫度降低至55℃以下時(shí)，加入0.5ml糖化酶和0.25g蛋白酶，在55℃糖化12h，調(diào)節(jié)ph7.0，離心收集上清，用無菌自來水稀釋上清液使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100μg/ml氨芐青霉素，取500ml轉(zhuǎn)移至上海百侖六聯(lián)發(fā)酵罐，在無菌條件下，取經(jīng)活化的ectmp7工程菌菌液以體積比為8％的接種量接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度38℃、攪拌轉(zhuǎn)速500rpm、通氣量1.2vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)16h后，發(fā)酵液中葡萄糖濃度下降為20.3g/l，補(bǔ)糖40g/l，發(fā)酵32h、46h后再次補(bǔ)加等量木薯還原糖母液，發(fā)酵60h后，獲得含有乙偶姻的發(fā)酵液。經(jīng)過測定乙偶姻產(chǎn)量為60.3g/l。所述ectmp7工程菌菌液的活化方法：將ectmp7工程菌株分別劃線到含有質(zhì)量體積比為1.8％瓊脂的并含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)15h；在無菌的條件下，用牙簽挑取lb平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)10h；所述的lb培養(yǎng)基配方為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。三、前體物質(zhì)乙偶姻與nh4+反應(yīng)合成四甲基吡嗪應(yīng)用實(shí)施例7磷酸氫二銨濃度對乙偶姻轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪的影響：取應(yīng)用實(shí)施例3含有乙偶姻的發(fā)酵液，以8000rpm離心10min，去除沉淀，取上清液測定乙偶姻的濃度為67.2g/l，分別取100ml加入3個(gè)燒杯中，然后分別加入乙偶姻1、2.0、2.5倍摩爾濃度的磷酸氫二銨，溶解后，調(diào)節(jié)ph至7.5，各取20ml加入100ml三角瓶中，在65℃、150rpm下水浴搖床中反應(yīng)20h，乙偶姻與nh4+反應(yīng)合成四甲基吡嗪。經(jīng)過測定不同濃度磷酸氫二銨對應(yīng)的四甲基吡嗪的產(chǎn)量分別是12.9g/l、17.9g/l、18.3g/l。應(yīng)用實(shí)施例8添加過氧化氫對乙偶姻轉(zhuǎn)化生產(chǎn)四甲基吡嗪的影響：取應(yīng)用實(shí)施例5含有乙偶姻的發(fā)酵液，以8000rpm離心10min，去除沉淀，取上清液測定乙偶姻的濃度為68.5g/l，取400ml加入燒杯中，然后加入乙偶姻2.0倍摩爾濃度的磷酸氫二銨，溶解后，調(diào)節(jié)ph至7.5，分別取六份20ml的溶液加入100ml三角瓶中，在90℃、100rpm下水浴搖床中反應(yīng)，反應(yīng)3h后分別加入為乙偶姻摩爾濃度0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0倍的過氧化氫，再反應(yīng)3h，乙偶姻與nh4+反應(yīng)合成四甲基吡嗪。經(jīng)過測定相對應(yīng)的四甲基吡嗪產(chǎn)量為18.7、20.8、22.6、25.3、23.7、21.9g/l。sequencelisting<110>南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司，廣西科學(xué)院<120>生產(chǎn)(r)-乙偶姻基因工程菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用<130>3849<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>3849<212>dna<213>人工合成<400>1taaggaggatatacatatgaactcggagaaacagtcgcgccaatgggcgcatggcgccga60catggttgtgggccaactggaagcccagggcgtgaagcaggtgtttggcatcccgggcgc120gaaaattgacaaggtgtttgactcgctgctggatagcagcattgagatcattcctgtgcg180ccatgaggcgaacgccgcctttatggccgccgcggttggtcgtctgaccggtaaggccgg240cgtggccttagtgaccagcggtcctggttgttctaatctgattaccggcattgcgaccgc300gaactcggagggcgatcctgtggtggccttaggcggtgcggttaagcgcgcggataaagc360caaactggtgcaccagagcatggataccgtggcgatgtttagcccggtgacgaagtacgc420cgttgaagttagctcgccggacgcgattgcggaggtggttagcaacgcgtttcgtgccgc480ggaacatggccgtcctggtggcgcgttcgtttcgctgccgcaggacattgttgatcagcc540tgcgaccggtgcgatcttaccggccagcggtcctgccctgatgggtccggcccctgaaag600cgcgatcaatgatgttgcgaaattaattgacaatgcgaaaaacccggtgattctgctggg660cttaatggcctcgcagcctgccaatagcgcggcgttacgcaaactgctggagaagagccg720tattccggtgacttctacttaccaagccgccggcgcggtgaatcaggaacactttacccg780ctttgccggtcgcgtgggtctgttcaacaatcaagcgggtgaccgcctgttacacctggc840ggatctgatcatttgcattggctacagcccggttgaatacgaaccgagcatgtggaacag900cggcgatgccacgctggtgcatatcgatgttctgcctgcgtacgaggaacgcaattatgt960gccggatatcgagctggtgggtgacattgccgcgaccctgaatttactggcctcgcgtat1020tgaccacaagctggaactgagccaacgcgcgtcggagattctggtggaccgccaacatca1080gcgcgatttattagaccgccgtggtgcgtcgctgaaccagtttgcgctgcatcctctgcg1140cattgttcgcgcgatgcaggatatcgtgaacaacgatgtgaccctgaccgtggacatggg1200cagcttccatatctggatcgcgcgttatctgtacagcttccgcgcccgtcaggtgatgat1260cagcaacggccagcagactatgggtgttgccttaccgtgggcgatcggcgcgtggctggt1320taacccgggtcgtaaggttgtgagcgtgtcgggcgatggcggtttcttacagagcagcat1380ggagctggaaacggccgtgcgcctgaacgccaacgtgttacatattatttgggtggataa1440cggctataacatggtggccatccaagaggagaagaagtatcagcgcctgagcggtgttgc1500gtttggcccggtggatttcaaggcctatgcggatgcctttggcgcccgtggcttcgccgt1560ggaaagcgccgatgcgttagaaagcaccctgcgcgcggctatggatgttaatggtccggc1620ggttgttgcgattccggtggattacagcgataacccgctgctgatgggccagctgcatct1680gtcgcagattctgtaataaggaggatatacatatgatgcacagctcggcgtgcgattgtg1740aagcgtcgctgtgcgaaaccctgcgcggctttagcgccaaacatccggacagcgttatct1800accagacctcgctgatgagcgcgctgctgtcgggcgtttacgaaggcgacaccacgatcg1860ccgatctgctggctcatggtgatttcggtctgggcaccttcaacgaactggacggcgaaa1920tgattgccttttcttctcaggtgtaccagttacgcgccgacggcagcgcgcgcgcggcca1980aaccggaacagaaaacgccgttcgccgtgatgacgtggttccaaccgcagtatcgcaaaa2040cgtttgatgccccggtttcgcgtcagcagattcatgacgtgatcgatcagcagattccga2100gcgacaacctgttctgcgcgctgcgcattgacggcaattttcgccacgcccacacccgca2160cggttcctcgccaaacgccgccgtaccgtgccatgaccgatgtgctggacgaccagccgg2220tgtttcgttttaaccaacgcgaaggcgtgctggttggcttccgcacgccgcagcacatgc2280agggcattaatgttgccggctaccatgagcactttattaccgacgatcgccagggcggcg2340gtcatttactggattatcagctggagagcggtgtgctgaccttcggcgagattcacaaac2400tgatgatcgacctgccggccgacagcgccttcttacaagcgaatctgcacccgagcaacc2460tggacgccgcgattcgttcggtggaaaattaataaggaggatatacatatgaaaatcgtt2520gttatcggtaccaaccacgctggtatcgctaccgctaacaccctgctggaacagtacccg2580ggtcacgaaatcgttatgatcgaccgtaactctaacatgtcttacctgggttgcggtacc2640gctatctgggttggtcgtcagatcgaaaaaccggacgaactgttctacgctaaagctgaa2700gacttcgaagctaaaggtgttaaaatcctgaccgaaaccgaagtttctgaaatcgacttc2760gctaacaaaaaagtttacgctaaaaccaaatctgacgacgaaatcatcgaagcttacgac2820aaactggttctggctaccggttctcgtccgatcatcccgaacctgccgggtaaagacctg2880aaaggtatccacttcctgaaactgttccaggaaggtcaggctatcgacgctgaattcgct2940aaagaaaaagttaaacgtatcgctgttatcggtgctggttacatcggtaccgaaatcgct3000gaagctgctaaacgtcgtggtaaagaagttctgctgttcgacgctgaaaacacctctctg3060gcttcttactacgacgaagaattcgctaaaggtatggacgaaaacctggctcagcacggt3120atcgaactgcacttcggtgaactggctaaagaattcaaagctaacgaagaaggttacgtt3180tctcagatcgttaccaacaaagctacctacgacgttgacctggttatcaactgcatcggt3240ttcaccgctaactctgctctggcttctgacaaactggctaccttcaaaaacggtgctatc3300aaagttgacaaacaccagcagtcttctgacccggacgtttacgctgttggtgacgttgct3360accatctactctaacgctctgcaggacttcacctacatcgctctggcttctaacgctgtt3420cgttctggtatcgttgctggtcacaacatcggtggtaaagaactggaatctgttggtgtt3480cagggttctaacggtatctctatcttcggttacaacatgacctctaccggtctgtctgtt3540aaagctgctaaaaaactgggtctggaagtttctttctctgacttcgaagacaaacagaaa3600gcttggttcctgcacgaaaacaacgactctgttaaaatccgtatcgtttacgaaaccaaa3660tctcgtcgtatcatcggtgctcagctggcttctaaatctgaaatcatcgctggtaacatc3720aacatgttctctctggctatccaggaaaaaaaaaccatcgacgaactggctctgctggac3780ctgttcttcctgccgcacttcaactctccgtacaactacatgaccgttgctgctctgaac3840gctaaataa3849當(dāng)前第1頁12