本發(fā)明涉及豬帶絳蟲(chóng)重組活疫苗研究領(lǐng)域,具體為豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因重組乳酸乳球菌胞內(nèi)型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和鑒定方法。
背景技術(shù):
豬囊尾蚴病(cysticercosiscellulosae)俗稱(chēng)豬囊蟲(chóng)病(bladderdisease),是由豬帶絳蟲(chóng)(taeniasolium,ts)的中絳期幼蟲(chóng)豬囊尾蚴(cysticercuscellulosae)引起的一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病,是國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)劃防治的重點(diǎn)寄生蟲(chóng)病之一。本病呈世界性分布,主要流行于中非、南非、拉丁美洲、東亞和南亞等經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生條件差的國(guó)家及地區(qū)。我國(guó)主要流行于黑龍江、吉林、云南、河南、河北、山東和廣西等31個(gè)省市自治區(qū)。據(jù)近年普查,我國(guó)豬帶絳蟲(chóng)的感染率為0.112%,局部地區(qū)高達(dá)0.66%~6.00%,感染人數(shù)126萬(wàn),囊蟲(chóng)的感染率為0.14%~3.20%,感染人數(shù)300萬(wàn)。其中2.3%~25.0%的豬帶絳蟲(chóng)病患者由于自身感染而伴有囊蟲(chóng)的寄生。因此研發(fā)安全高效的疫苗防治該病意義重大。
tsol18基因相對(duì)保守,存在于激活的tso中,具有良好的免疫原性和抗原性,被認(rèn)為是最具發(fā)展前途的侯選疫苗基因。乳酸乳球菌(lactococcuslactis,l.lactis)是lab中最重要的模式菌,應(yīng)用范圍于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域密切相關(guān)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,選擇具有高效、無(wú)毒副作用的l.lactis作為載體,已在細(xì)菌、病毒、腫瘤、寄生蟲(chóng)等領(lǐng)域構(gòu)建了一系列基因工程疫苗。
就上述背景技術(shù)領(lǐng)域而言,尚未見(jiàn)豬帶絳蟲(chóng)重組l.lactis的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供豬帶絳蟲(chóng)重組乳酸乳球菌胞內(nèi)型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和鑒定方法。
為達(dá)到上述目的,采用的技術(shù)方案為:
豬帶絳蟲(chóng)重組乳酸乳球菌胞內(nèi)型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和鑒定方法,包含以下步驟:
1)、tsol18基因合成和引物設(shè)計(jì):根據(jù)豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列,采用基于pas的方法,在引物的兩端各設(shè)計(jì)了saci和hindiii酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基,合成576bp的tsol18基因;
2)、重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18的構(gòu)建及鑒定:合成的目的基因與表達(dá)載體pmg36e用saci/hindiii雙酶切相連接,獲得重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18,轉(zhuǎn)化至top克隆菌株,抽提陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序鑒定;
3)、豬帶絳蟲(chóng)重組pmg36e-tsol18/l.lactis的構(gòu)建及鑒定:
3.1)、乳球菌的活化及感受態(tài)制備:取乳酸球菌mg1363菌液接種于gm17固體培養(yǎng)基平板,然后收集菌體,用1:100的甘油磷酸緩沖液重懸菌體;
3.2)、重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18電轉(zhuǎn)化mg1363:將獲得的pmg36e-tsol18質(zhì)粒與感受態(tài)mg1363混合,進(jìn)行冰浴和電擊,加入蔗糖mrs培養(yǎng)基,然后進(jìn)行涂布紅霉素gm17平板培養(yǎng),選取陽(yáng)性菌落再進(jìn)行紅霉素液體培養(yǎng)基培養(yǎng);
3.3)、陽(yáng)性克隆鑒定:取上述3.2)步驟的培養(yǎng)菌液,離心棄上清,依次進(jìn)行洗滌、重懸、沸水浴、冰浴、離心,取上清作為pcr模板待用;使用基因特異性的引物進(jìn)行pcr鑒定,pcr產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定;
4)、蛋白表達(dá)鑒定:
4.1)、sds-page鑒定:選取未轉(zhuǎn)化的乳酸球菌培養(yǎng)于gm17液體培養(yǎng)基中,挑取步驟3.3)鑒定為陽(yáng)性的菌液,離心收集沉淀和上清;將沉淀在冰浴中進(jìn)行超聲破碎,加入等體積的2×sds上樣緩沖液,沸水浴4-8min,冷卻后取上樣,通過(guò)sds-page檢測(cè)上清和胞內(nèi)的蛋白表達(dá)情況;
4.2)、通過(guò)akta純化tsol18蛋白,使用anti-tsol18抗體檢測(cè)純化后的蛋白在15d左右有無(wú)目的條帶;
4.3)、westernblot鑒定:取akta純化tsol18蛋白進(jìn)行westernblot鑒定分析。
進(jìn)一步,所述步驟3.1)中,菌液接種后保持不通風(fēng),30℃培養(yǎng)過(guò)夜,至od值為0.2-0.8,然后將培養(yǎng)物冰浴10min,離心收集菌體,并用冷的甘油磷酸緩沖液洗滌菌體,再進(jìn)行重懸菌體。
進(jìn)一步,所述步驟3.2)中電擊電轉(zhuǎn)參數(shù)如下:電壓2000v,電容25uf,電阻200ω。
進(jìn)一步,所述步驟3.3)中,使用基因特異性的引物為:正向引物f(5'atggtttgtcgttttgctt3')和反向引物r(5'ttatgaacgacgaaccttttta3');反應(yīng)體系為:以正向和反向引物各1.0ul,1ul基因組為模板,dna聚合酶0.5ul,dntp2.5ul,10×pcrbuffer5.0ul,uptoddw50ul;pcr擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30min,循環(huán)擴(kuò)增30次,最后72℃復(fù)性10min。
進(jìn)一步,所述步驟4.1)中,2×sds上樣緩沖液為:0.1mol/ltris-hcl、ph6.8、10%二硫蘇糖、4%sds、0.2%溴酚藍(lán)和20%甘油。
進(jìn)一步,所述步驟4.3)具體為:取步驟4.2)純化后蛋白,加loadingbuffer煮沸冷卻后取20ul上樣,電泳條件:5%濃縮膠:90v30min;10%分離膠:120v,20min;轉(zhuǎn)膜:分別疊放好三層濾紙、sds-page膠和pvdf膜,pvdf膜事先需要甲醇活化15s左右,使用轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜,恒壓100v,60min;封閉:5%脫脂奶粉pbst溶液封閉膜,搖床37℃,2h,pbs漂洗5min;一抗孵育及染色,一抗孵育:4℃過(guò)夜;pbst在37℃漂洗5min×3,二抗孵育:抗體1:1500稀釋?zhuān)?7℃1h;pbst在37℃漂洗5min×4;曝光2min,進(jìn)行westernblot鑒定分析。
本發(fā)明以genbank中登陸的豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列為模板,以乳酸乳球菌(lactococcuslactis,l.lactis)mg1363為宿主系統(tǒng)進(jìn)行基因優(yōu)化,通過(guò)基因合成的方式,合成目的基因tsol18。雙酶切連接至pmg36e載體,構(gòu)建胞內(nèi)型表達(dá)載體pmg36e-tsol18,再將其電穿孔轉(zhuǎn)化至l.lactismg1363,成功構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)pmg36e-tsol18/l.lactismg1363。進(jìn)行pcr鑒定,sds-page和westernblot分析tsol18基因在l.lactis中的表達(dá)情況,在胞內(nèi)檢測(cè)到目標(biāo)蛋白表達(dá),胞外未檢測(cè)到目標(biāo)蛋白。通過(guò)akta蛋白純化鑒定及穩(wěn)定性分析表明,pmg36e-tsol18質(zhì)粒在l.lactismg1363中連續(xù)傳代20代,有較好的遺傳穩(wěn)定性,為豬囊尾蚴病疫苗的開(kāi)發(fā)與利用提供了有力的參考依據(jù)。
附圖說(shuō)明
圖1為豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列的原始序列碼;
圖2為豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列的優(yōu)化后序列碼;
圖3為豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列的原始gc含量圖;
圖4為豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列的優(yōu)化后gc含量圖;
圖5為tsol18基因部分序列比對(duì)結(jié)果圖;
圖6為sp-tsol18基因部分序列比對(duì)結(jié)果圖;
圖7為重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18雙酶切鑒定圖;
圖8為重組質(zhì)粒pmg36e-sp-tsol18雙酶切鑒定圖;
圖9為乳球菌mg1363陽(yáng)性克隆子提取基因組dna測(cè)定圖;
圖10為pcr鑒定tsol18陽(yáng)性克隆子圖;
圖11為pcr鑒定sp-tsol18陽(yáng)性克隆子圖;
圖12為tsol18菌株表達(dá)鑒定分析結(jié)果圖;
圖13為sp-tsol18菌株表達(dá)鑒定分析結(jié)果圖;
圖14為tsol18蛋白純化鑒定圖;
圖15為sp-tsol18蛋白純化鑒定圖;
圖16為純化后tsol18蛋白的westernblot鑒定圖;
圖17為純化后sp-tsol18蛋白的westernblot鑒定圖;
圖18為tsol18質(zhì)粒鑒定結(jié)果圖;
圖19為sp-tsol18質(zhì)粒鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步介紹本發(fā)明,但本發(fā)明不僅限于下述實(shí)施例,可以預(yù)見(jiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員在結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的情況下,實(shí)施情況可能產(chǎn)生種種變化。
1目的基因分析
根據(jù)豬帶絳蟲(chóng)tsol18基因序列(登錄號(hào):af017788.1),對(duì)目的基因進(jìn)行分析和優(yōu)化。
2tsol18基因合成和引物設(shè)計(jì)
采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法,在引物的兩端各設(shè)計(jì)了saci和hindiii酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基,由南京鐘鼎生物實(shí)驗(yàn)室分別合成tsol18和sp-tsol18目的基因。
3重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18、pmg36e-sp-tsol18的構(gòu)建及鑒定
合成的目的基因與表達(dá)載體pmg36e用saci/hindiii雙酶切相連接,獲得重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18、pmg36e-sp-tsol18,轉(zhuǎn)化至top克隆菌株,抽提陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序鑒定。
4豬帶絳蟲(chóng)重組pmg36e-tsol18/l.lactis、pmg36e-sp-tsol18/l.lactis的構(gòu)建及鑒定
4.1乳球菌的活化及感受態(tài)制備
取乳酸球菌mg1363菌液接種于gm17固體培養(yǎng)基平板,在不通風(fēng)的條件下,30度培養(yǎng)過(guò)夜,培養(yǎng)至od值為0.2-0.8,培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)物冰浴10min,離心收集菌體,用冰冷的甘油磷酸緩沖液洗滌菌體,然后用1:100的甘油磷酸緩沖液重懸菌體,可見(jiàn)細(xì)小的圓形白色不透明菌落出現(xiàn),菌落邊緣呈明顯的不光滑形狀,從形態(tài)上與乳酸桿菌培養(yǎng)吻合。
4.2重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18、pmg36e-sp-tsol18電轉(zhuǎn)化mg1363
分別將獲得的pmg36e-tsol18、pmg36e-sp-tsol18質(zhì)粒與感受態(tài)mg1363混合,冰浴10min,電擊。電轉(zhuǎn)參數(shù)如下:電壓2000v,電容25uf,電阻200ω,進(jìn)行第一次脈沖,然后立即加入900ul低溫的蔗糖mrs培養(yǎng)基,冰上放置10min,期間不要振動(dòng),30℃復(fù)蘇培養(yǎng)2-3h,將菌液3000g離心棄去上清后濃縮于100ul蔗糖mrs培養(yǎng)基中,將其涂布在10ug/ml的紅霉素gm17平板上,培養(yǎng)2-3d。期間保持相對(duì)密閉環(huán)境,觀察菌落生長(zhǎng)情況,一周左右,陸續(xù)形成細(xì)小的圓形白色不透明菌落。選取不同的陽(yáng)性菌落,分別在每個(gè)陽(yáng)性菌落上使用滅菌牙簽挑取2~3個(gè)單菌落,置于1ml的g/l-sgm17+5ug/ml紅霉素液體培養(yǎng)基中,30℃下靜置培養(yǎng)72h,待溶液出現(xiàn)明顯的渾濁后待用。
4.3陽(yáng)性克隆鑒定
取上述培養(yǎng)的菌液,10000rpm離心10min,棄上清,ddh2o洗滌3次,10000rpm離心棄上清;加入30ul的ddh2o,重懸后沸水浴10min;冰浴2min,10000rpm離心10min,吸取上清作為pcr模板待用。使用基因特異性的引物進(jìn)行pcr鑒定,引物為:正向引物f(5'atggtttgtcgttttgctt3')和反向引物r(5'ttatgaacgacgaaccttttta3'),引物由南京鐘鼎生物公司合成。反應(yīng)體系為:以正向和反向引物各1.0ul,1ul基因組為模板,dna聚合酶0.5ul,dntp2.5ul,10×pcrbuffer5.0ul,uptoddw50ul;pcr擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30min,循環(huán)擴(kuò)增30次,最后72℃復(fù)性10min。pcr產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
5蛋白表達(dá)鑒定
5.1蛋白分析
蛋白跨膜及親疏水分析,蛋白信號(hào)肽分析。
5.2sds-page鑒定
選取未轉(zhuǎn)化的乳酸球菌命名為ck培養(yǎng)于gm17液體培養(yǎng)基中,分別挑取鑒定為陽(yáng)性的#1,接種于含有紅霉素的gm17液體培養(yǎng)基中;30℃靜置培養(yǎng)72h后,6000rpm,4℃離心15min心收集沉淀和上清備用,將沉淀重懸于預(yù)冷的pbs中,超聲破碎,冰浴中進(jìn)行超聲破碎,每次4s(300w),間隔8s,超聲約20min,加入等體積的2×sds上樣緩沖液(0.1mol/ltris-hcl,ph6.8,10%二硫蘇糖,4%sds,0.2%溴酚藍(lán),20%甘油),沸水浴4-8min。冷卻后取20ul上樣;分別通過(guò)sds-page檢測(cè)上清和胞內(nèi)的表達(dá)情況。
5.3蛋白純化鑒定
通過(guò)akta純化蛋白。
5.4westernblot鑒定
使用anti-tsol18抗體檢測(cè)純化后的蛋白后,取純化后蛋白,加loadingbuffer煮沸冷卻后取20ul上樣。電泳條件:5%濃縮膠:90v30min;10%分離膠:120v,20min。轉(zhuǎn)膜:分別疊放好三層濾紙、sds-page膠和pvdf膜(pvdf膜事先需要甲醇活化15s左右),使用轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜,恒壓100v,60min。封閉:5%脫脂奶粉pbst溶液封閉膜,搖床37℃,2h,pbs漂洗5min。一抗孵育及染色,一抗孵育:4℃過(guò)夜;pbst在37℃漂洗5min×3,二抗孵育:抗體1:1500稀釋?zhuān)?7℃1h;pbst在37℃漂洗5min×4。曝光2min,進(jìn)行westernblot分析。
6重組tsol18和sp-tsol18蛋白的穩(wěn)定性分析
利用pmg36e質(zhì)粒中含有的紅霉素抗性基因的特性,將獲得的含有目的基因的質(zhì)粒在不含紅霉素與含紅霉素的液體培養(yǎng)基中分別進(jìn)行連續(xù)傳代,每隔5代做一次質(zhì)粒穩(wěn)定率測(cè)定,連續(xù)傳至20代,質(zhì)粒穩(wěn)定率=從不含紅霉素的平板上選取100個(gè)單菌落接種于含紅霉素的平板上最后長(zhǎng)出的菌落數(shù)。
具體過(guò)程如下:挑取mg1363平板上單菌落,分別接種于gm17+(含紅霉素)液體培養(yǎng)基和gm17(不含紅霉素)液體培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)24h后,4℃放置過(guò)夜并保種,分別取培養(yǎng)物進(jìn)行劃線接種于gm17平板,30℃培養(yǎng)24h后,在劃線平板上分別挑取100個(gè)單菌落接種于相應(yīng)含紅霉素的培養(yǎng)基與不含紅霉素的培養(yǎng)基中,30度培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落,重復(fù)以上操作傳至20代,則停止傳代。根據(jù)100個(gè)單菌落接種于紅霉素平板的菌落生長(zhǎng)數(shù),計(jì)算其質(zhì)粒的其遺傳穩(wěn)定性。
7結(jié)果
7.1目的基因序列分析與優(yōu)化:
野生型基因序列:
atggtgtgtcggtttgctctcatcttcttggtggccgtcgttttggcgagcggtgaccgaacattcggcgacgatattttcgtgccataccttcgctgcttcgcccttagcgctaccgaaattggggtgttttgggatgctggagagatggttggccatggcgtagaggagatcaaagtgaaagtagaaaaagcaatacacccatacaagatctggaatgcaacagtcagcgcgaacaatggaaaagtcatcatcagagacttgaaggcgaagacaatttacagagtggacgtagacggttatcgaaacgaaatcatggtgtttggttcgcagcgtttcgcgacaacacttccgaaaaagcagatcaagcacaagaaggtccgaagatcgtag
優(yōu)化后基因序列:
atggtttgtcgttttgctttaatttttttagttgctgttgttttagcttcaggtgatcgtacttttggtgatgatatttttgttccatatttacgttgttttgctttatcagctactgaaattggtgttttttgggatgctggtgaaatggttggtcatggtgttgaagaaattaaagttaaagttgaaaaggctattcatccatataaaatttggaatgctactgtttcagctaataatggtaaggttattattcgtgatttaaaagctaaaactatttatcgtgttgatgttgatggttatcgtaatgaaattatggtttttggttcacaacgttttgctactactttaccaaaaaagcaaattaagcataaaaaggttcgtcgttcataa
其原始序列碼如圖1所示,優(yōu)化后序列碼如圖2所示,原始gc含量如圖3所示,優(yōu)化后gc含量如圖4所示。
7.2目的基因的合成:采用基于pas的方法合成576bp的tsol18基因和749bp的sp-tsol18基因,與預(yù)期結(jié)果相符。
tsol18基因:
catgattacgccaagctcgcttgcacgcctctgcactcgtcggtcccggcatgtgtcgcccttgcagaaaaattcgtaattcgagctcgcatggtttgtcgttttgctttaatttttttagttgctgttgttttagcttcaggtgatcgtacttttggtgatgatatttttgttccatatttacgttgttttgctttatcagctactgaaattggtgttttttgggatgctggtgaaatggttggtcatggtgttgaagaaattaaagttaaagttgaaaaggctattcatccatataaaatttggaatgctactgtttcagctaataatggtaaggttattattcgtgatttaaaagctaaaactatttatcgtgttgatgttgatggttatcgtaatgaaattatggtttttggttcacaacgttttgctactactttaccaaaaaagcaaattaagcataaaaaggttcgtcgttcataaaagcttgcaaagtctgaaaacgaaggaagggcgacaccgacgcattcgcgaagtaccgatctccaatcactggc
sp-tsol18基因:
gattggagatcggtacttcgcgaatgcgtcggtgtcgcccttgcagaaaaattcgtaattcgagctcgcatgaaaaagaagatcatcagcgccatccttatgagcacagtaattctttctgctgccgctcctttgagtggtgtctatgccttagaaattagctctacttgtgacgcaatggtttgtcgttttgctttaatttttttagttgctgttgttttagcttcaggtgatcgtacttttggtgatgatatttttgttccatatttacgttgttttgctttatcagctactgaaattggtgttttttgggatgctggtgaaatggttggtcatggtgttgaagaaattaaagttaaagttgaaaaggctattcatccatataaaatttggaatgctactgtttcagctaataatggtaaggttattattcgtgatttaaaagctaaaactatttatcgtgttgatgttgatggttatcgtaatgaaattatggtttttggttcacaacgttttgctactactttaccaaaaaagcaaattaagcataaaaaggttcgtcgttcataaaagctttgcaaagtctgaaaacgaaggaagggcgacacatgccgggaccgacgagtgcagaggcgtgcaagcgagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcata。
7.3重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定:合成的tsol18基因和sp-tsol18基因,雙酶切至pmg36e載體的saci和hindiii位點(diǎn),測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列相符,見(jiàn)圖5、6。
7.4重組質(zhì)粒的酶切鑒定:重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18和pmg36e-sp-tsol18經(jīng)saci和hindiii雙酶切,用1%瓊脂糖凝膠電泳,證實(shí)獲得的tsol18基因和sp-tsol18基因正確的插入到pmg36e載體的saci和hindiii之間,與預(yù)期結(jié)果相符,見(jiàn)圖7、8,圖中m:dnamarker;1:酶切前質(zhì)粒;2:酶切后質(zhì)粒。
7.5乳球菌mg1363中重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆鑒定:從乳球菌mg1363中抽提重組質(zhì)粒,挑選陽(yáng)性克隆子,進(jìn)行基因組dna測(cè)定,確認(rèn)為陽(yáng)性克隆,見(jiàn)圖9,圖中m:dnamarker:1-6:tsol18陽(yáng)性克隆子基因組dna,7-12:sp-tsol18陽(yáng)性克隆子基因組dna,13:mg1363空菌株。
7.6乳球菌中重組質(zhì)粒的pcr鑒定:以乳球菌mg1363中抽提的重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18和pmg36e-sp-tsol18為模板,使用基因特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增,結(jié)果顯示1-6泳道為tsol18陽(yáng)性克隆子的pcr產(chǎn)物,見(jiàn)圖10、11;圖10中m:dnamarker;1-6:陽(yáng)性克隆子tsol18pcr鑒定,7:ck(陰性-mg1363);圖11中m:dnamarker;1-6:陽(yáng)性克隆子sp-tsol18pcr鑒定,7:ck(陰性-mg1363);其中1、2、4、5、6泳道為sp-tsol18陽(yáng)性克隆子的pcr產(chǎn)物,可得到393bp的tsol18基因片段,與預(yù)期結(jié)果相符。
7.7重組pmg36e-tsol18/l.lactis和pmg36e-sp-tsol18/l.lactis表達(dá)產(chǎn)物的sds-page分析:分別挑取鑒定為陽(yáng)性的克隆菌接種與含有紅霉素的gm17液體培養(yǎng)基中,與未轉(zhuǎn)化的mg1363(ck)培養(yǎng)于gm17液體培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)72h后,進(jìn)行sds-page電泳,ck(mg1363菌株)胞內(nèi)上清與沉淀中都未檢測(cè)到目標(biāo)的蛋白;tsol18在胞外上清未檢測(cè)到目標(biāo)蛋白,但在胞內(nèi)有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的表達(dá),sp-tsol18在胞外上清與胞內(nèi)沉淀都有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的表達(dá),見(jiàn)圖12、13。圖12中m:proteinmarker,1:ck培養(yǎng)72小時(shí)上清,2:ck培養(yǎng)72小時(shí)沉淀,3:pmg36e-tsol18轉(zhuǎn)化mg1363菌株培養(yǎng)72小時(shí)上清,4:pmg36e-tsol18轉(zhuǎn)化mg1363菌株培養(yǎng)72小時(shí)沉淀;圖13中,m:proteinmarker,1:ck培養(yǎng)72小時(shí)上清,2:ck培養(yǎng)72小時(shí)沉淀,3:pmg36e-sp-tsol18轉(zhuǎn)化mg1363菌株培養(yǎng)72小時(shí)上清,4:pmg36e-sp-tsol18轉(zhuǎn)化mg1363菌株培養(yǎng)72小時(shí)沉淀。
7.8tsol18和sp-tsol18蛋白的表達(dá)模式分析與產(chǎn)物純化:通過(guò)akta純化tsol18和sp-tsol18蛋白,使用anti-tsol18抗體檢測(cè)純化后的蛋白,兩種蛋白在15d左右有目的條帶,sp-tsol18蛋白在胞內(nèi)和胞外均出現(xiàn)特異性顯色帶,表明sp-tsol18蛋白抗原性?xún)?yōu)于tsol18蛋白,見(jiàn)圖14、15、16、17。圖14中m:proteinmarker,1:purified;圖15中m:proteinmarker,1:purified;圖16中m:proteinmarker,1:ck,2:tsol18上清,3:tsol18沉淀;圖17中m:proteinmarker,1:ck,2:sp-tsol18上清,3:sp-tsol18沉淀。
7.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):由表1、2、3、4可以看出含有目的基因的質(zhì)粒pmg36e-tosl18,pmg36e-sp-tosl18在mg1363乳酸球菌中連續(xù)傳代20代時(shí),在無(wú)紅霉素抗性條件下,質(zhì)粒穩(wěn)定率均為100%,在含紅霉素抗性條件下,質(zhì)粒穩(wěn)定率均為99%。將各代次的質(zhì)粒采用限制性?xún)?nèi)切酶saci/hindiii進(jìn)行雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確,連續(xù)傳至20代時(shí),與原代質(zhì)粒相符。提示pmg36e-tsol18、pmg36e-sp-tsol18質(zhì)粒在乳酸球菌mg1363中連續(xù)傳代20代時(shí),均有較好的遺傳穩(wěn)定性,見(jiàn)圖18、19。圖18中,m:dnamarker,1:tsol18原代質(zhì)粒,2:tsol18原代質(zhì)粒酶切后,3:tsol185代質(zhì)粒,4:tsol185代質(zhì)粒酶切后,5:tsol1810代質(zhì)粒,6:tsol1810代質(zhì)粒酶切后,7:tsol1815代質(zhì)粒,8:tsol1815代質(zhì)粒酶切后,9:tsol1820代質(zhì)粒,10:tsol1820代質(zhì)粒酶切后;圖19中,m:dnamarker,1:sp-tsol18原代質(zhì)粒,2:sp-tsol18原代質(zhì)粒酶切后,3:sp-tsol185代質(zhì)粒,4:sp-tsol185代質(zhì)粒酶切后,5:sp-tsol1810代質(zhì)粒,6:sp-tsol1810代質(zhì)粒酶切后,7:sp-tsol1815代質(zhì)粒,8:sp-tsol1815代質(zhì)粒酶切后,9:sp-tsol1820代質(zhì)粒,10:sp-tsol1820代質(zhì)粒酶切后。
表1:mg1363中pmg36e-tosl18質(zhì)粒在無(wú)紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率。
表2:mg1363中pmg36e-tosl18質(zhì)粒在有紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率。
表3:mg1363中pmg36e-sp-tosl18質(zhì)粒在無(wú)紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率。
表4:mg1363中pmg36e-sp-tosl18質(zhì)粒在有紅霉素選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率。
tsol18基因是由gauci等克隆的一個(gè)cdna片段,其長(zhǎng)度為579bp,其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?90bp,可編碼130個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),理論相對(duì)分子質(zhì)量(mr)為14.7kd。該基因存在于激活的tso中,具有良好的免疫原性和抗原性,被認(rèn)為是最具發(fā)展前途的侯選疫苗基因,受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,是當(dāng)前豬帶絳蟲(chóng)疫苗研究的熱點(diǎn)。近年來(lái),先后開(kāi)展了tsol18基因的重組蛋白疫苗、dna疫苗、重組酵母疫苗、重組鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌疫苗、重組雙歧桿菌疫苗及重組bcg疫苗,上述疫苗已在動(dòng)物模型中取得較好的免疫效果。隨著疫苗研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)重組蛋白疫苗需要經(jīng)過(guò)基因克隆、表達(dá)和蛋白純化等復(fù)雜過(guò)程,技術(shù)難度大,成本較高,同時(shí)它只能誘導(dǎo)體液免疫和th細(xì)胞應(yīng)答,不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞應(yīng)答;dna疫苗操作簡(jiǎn)單,能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫、th細(xì)胞和ctl應(yīng)答,但dna可整合到宿主細(xì)胞的基因組中,有引起原癌基因活化和抑制基因失活的危險(xiǎn);重組畢赤酵母中表達(dá)蛋白存在過(guò)度糖基化,可能影響重組蛋白的合成與分泌,且糖基化后的蛋白具有高度異質(zhì)性,會(huì)使重組蛋白發(fā)生功能改變;鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌屬于革蘭陰性菌,其在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的脂多糖毒素可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒性,可能會(huì)干擾編碼基因在宿主細(xì)胞中的正確表達(dá)和合成,并且存在細(xì)菌毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)性;雙歧桿菌屬專(zhuān)性厭氧革蘭氏陽(yáng)性桿菌,不利于操作,目前仍不能像大腸桿菌一樣廣泛和常用,表達(dá)系統(tǒng)不成熟,就其遺傳背景和分子生物學(xué)特性等研究還不是很透徹,而且,經(jīng)本課題組研究發(fā)現(xiàn)其保護(hù)效果不太令人滿(mǎn)意(74.85%);bcg作為一種減毒牛型分支桿菌,仍存在毒力作用,有返毒力的可能,可能會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生毒副作用,甚至導(dǎo)致感染結(jié)核病,作為疫苗表達(dá)效果不滿(mǎn)意,且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),操作存在風(fēng)險(xiǎn),推廣困難。因此,有必要研究新型的豬帶絳蟲(chóng)疫苗。
活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原的編碼基因插入病毒或細(xì)菌載體中,使其成為表達(dá)外源性抗原的重組病毒或細(xì)菌。其免疫動(dòng)物后在機(jī)體內(nèi)以天然的方式感染和加工抗原,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫反應(yīng),從而起到免疫保護(hù)作用。目前用于這類(lèi)疫苗的載體有沙門(mén)氏菌、牛痘病毒、bcg等,而相對(duì)于這些病毒和細(xì)菌載體,乳酸菌(lacticacidbacteria,lab)對(duì)于人體則更加安全。
乳酸乳球菌(lactococcuslactis,l.lactis)是lab中最重要的模式菌,應(yīng)用范圍于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域密切相關(guān)。其生理生化特性簡(jiǎn)單,遺傳背景清楚,作為疫苗遞呈載體有獨(dú)特優(yōu)勢(shì):(1)為食品級(jí)微生物,乳制品發(fā)酵的主要成份,安全性高;(2)本身分泌蛋白較少,減少了載體微生物自身蛋白對(duì)外源分泌蛋白的干擾,且不產(chǎn)生任何細(xì)胞外蛋白酶,不會(huì)引起分泌蛋白發(fā)生細(xì)胞外降解;(3)具有粘膜佐劑特性;(4)與乳酸桿菌不同之處,l.lactis基本不在胃腸道定植,不會(huì)危害腸道內(nèi)正常菌群和造成潛在的基因污染及避免長(zhǎng)期定植帶來(lái)的耐受?;蚬こ讨亟Ml.lactis是將l.lactis作為工程菌,利用dna重組技術(shù)將外源基因?qū)雔.lactis中,依靠l.lactis在宿主的復(fù)制,分泌表達(dá)外源抗原,以誘導(dǎo)對(duì)疾病的特異性體液和細(xì)胞免疫,提高l.lactis激發(fā)的免疫效應(yīng)。
1989年vandeguchte等以l.lactis乳脂亞種蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)為基礎(chǔ),構(gòu)建質(zhì)粒載體pmg36e,其大小約3.6kb,便于宿主菌攜帶,廣泛應(yīng)用于多種蛋白的表達(dá)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者將其進(jìn)行改造,成功構(gòu)建了食品級(jí)表達(dá)載體,對(duì)于食品、藥品生產(chǎn)和食品級(jí)疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。因此,食品級(jí)表達(dá)載體pmg36e可能是構(gòu)建重組l.lactis疫苗的理想載體。而就寄生蟲(chóng)領(lǐng)域,尚未見(jiàn)豬帶絳蟲(chóng)重組l.lactis疫苗的報(bào)道。本研究采用全基因合成方法構(gòu)建tsol18和sp-tsol18抗原編碼基因,將其定向克隆入食品級(jí)表達(dá)載體pmg36e中,構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)重組質(zhì)粒pmg36e-tsol18和sp-tsol18,經(jīng)雙酶切、pcr和測(cè)序鑒定,證實(shí)tsol18和sp-tsol18基因成功插入pmg36e中,再將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)入l.lactismg1363,構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)重組pmg36e-tsol18/l.lactis、pmg36e-sp-tsol18/l.lactis,從含紅霉素抗性的gm17液體培養(yǎng)基中挑選陽(yáng)性菌液為模板進(jìn)行pcr鑒定,證實(shí)豬帶絳蟲(chóng)重組pmg36e-tsol18/l.lactis、pmg36e-sp-tsol18/l.lactis構(gòu)建成功。并通過(guò)sds-page分析顯示tsol18在胞外上清未檢測(cè)到目標(biāo)蛋白,但在胞內(nèi)有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的表達(dá),而sp-tsol18在胞外上清與胞內(nèi)沉淀都有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的表達(dá),westernblot顯示使用anti-tsol18抗體檢測(cè)通過(guò)akta純化后的tsol18和sp-tsol18蛋白,兩種蛋白均在15d左右有目的條帶,sp-tsol18蛋白在胞內(nèi)和胞外均出現(xiàn)特異性顯色帶,表明tsol18基因可在l.lactis中表達(dá),且表達(dá)的蛋白具有特異的抗原性,sp-tsol18蛋白抗原性?xún)?yōu)于tsol18蛋白。含有目的基因的質(zhì)粒pmg36e-tosl18,pmg36e-sp-tosl18在mg1363乳酸球菌中連續(xù)傳代20代時(shí),在無(wú)紅霉素抗性條件下,質(zhì)粒穩(wěn)定率均為100%,在含紅霉素抗性條件下,質(zhì)粒穩(wěn)定率均為99%。將各代次的質(zhì)粒采用限制性?xún)?nèi)切酶saci/hindiii進(jìn)行雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確,連續(xù)傳至20代時(shí),與原代質(zhì)粒相符。pmg36e-tsol18、pmg36e-sp-tosl18質(zhì)粒在乳酸球菌mg1363中連續(xù)傳代20代時(shí),均有較好的遺傳穩(wěn)定性。為豬囊尾蚴病疫苗的開(kāi)發(fā)與利用提供了有力的參考依據(jù)。