本發(fā)明涉及多肽合成,具體涉及一種多肽類新冠病毒膜融合抑制劑的合成方法。
背景技術(shù):
1、hy3000是一款多肽類新冠病毒膜融合抑制劑,通過與新冠病毒刺突蛋白hr1區(qū)域結(jié)合,阻止病毒六螺旋束結(jié)構(gòu)形成,阻斷病毒侵染細(xì)胞以達(dá)到抗病毒效果,hy3000在體內(nèi)外都表現(xiàn)出顯著的抗新型冠狀病毒作用,對新型冠狀病毒原始株及其多種流行變異株的抑制活性顯著,且抗病毒活性不受病毒變異影響。根據(jù)一期臨床研究結(jié)果,hy3000對人體無嚴(yán)重不良反應(yīng),安全性良好。
2、hy3000由46個氨基酸和一個膽固醇衍生物組成,分子式:c243h410n60o81s分子量:5500.35,肽序如圖1所示。
3、目前并無報道關(guān)于hy3000的化學(xué)合成方法,一般是選擇固相逐步偶聯(lián)法(fmoc-spps)合成hy3000的46肽部分,經(jīng)與膽固醇衍生物修飾得hy3000粗肽,再經(jīng)反相制備色譜純化可得hy3000精肽,該工藝操作簡單,但其偶聯(lián)過程中樹脂的收縮較為嚴(yán)重,難以順利偶聯(lián),易導(dǎo)致缺失肽雜質(zhì)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供一種多肽類新冠病毒膜融合抑制劑的合成方法。
2、為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
3、本發(fā)明提供一種多肽類新冠病毒膜融合抑制劑的合成方法,所述多肽類新冠病毒膜融合抑制劑為hy3000,該方法包括將hy3000的46肽部分分為在空白酰胺樹脂上逐個偶聯(lián)的fp(38-46)片段,及在2-ctcresin上逐個偶聯(lián)并進(jìn)行全保護(hù)裂解方式裂解得到的fp(28-37)片段、fp(21-27)片段、fp(9-20)片段、fp(1-8)片段;再通過fmoc固相偶聯(lián)的方式逐一偶聯(lián)全保護(hù)片段,得到所述hy3000。
4、進(jìn)一步的,所述空白酰胺樹脂為rinkamide-amresin或rinkamideresin或rinkamide-mbharesin;所述空白酰胺樹脂優(yōu)選為rinkamide-amresin;其中,所述rink?amide-amresin替代度為0.2mmol/g~0.5mmol/g,優(yōu)選替代度為0.3mmol/g~0.4mmol/g。
5、進(jìn)一步的,所述fp(38-46)片段包括fp(38-46)-resin片段;所述fp(38-46)-resin片段為以空白酰胺樹脂為固相載體進(jìn)行合成,所得肽樹脂肽序為h-gln(trt)38-glu(otbu)39-leu40-gly41-ser(tbu)42-gly43-ser(tbu)44-gly45-cys(trt)46-resin;所述fp(28-37)片段以2-ctcresin為固相載體,經(jīng)20%~30%tfe/dcm溶液處理,將全保護(hù)肽和樹脂載體分離,所得全保護(hù)片段肽肽序為fmoc-lys(boc)28-asn(trt)29-leu30-asn(trt)31-glu(otbu)32-ser(tbu)33-leu34-ile35-asp(otbu)36-leu37-oh;所述fp(21-27)片段以2-ctcresin為固相載體,經(jīng)20%~30%tfe/dcm溶液處理,將全保護(hù)肽和樹脂載體分離,所得全保護(hù)片段肽肽序為fmoc-asp(otbu)21-arg(pbf)22-leu23-asn(trt)24-glu(otbu)25-val26-ala27-oh;所述fp(9-20)片段以2-ctcresin為固相載體,經(jīng)20%~30%tfe/dcm溶液處理,將全保護(hù)肽和樹脂載體分離,所得全保護(hù)片段肽肽序為fmoc-ile9-asn(trt)10-ala11-ser(psi(me,me)pro)12-val13-val14-asn(trt)15-ile16-gln(trt)17-lys(boc)18-glu(otbu)19-ile20-oh;所述fp(1-8)片段以2-ctcresin為固相載體,經(jīng)20%~30%tfe/dcm溶液處理,將全保護(hù)肽和樹脂載體分離,所得全保護(hù)片段肽肽序為boc-val1-asp(otbu)2-leu3-gly4-asp(otbu)5-ile6-ser(tbu)7-gly8-oh。
6、進(jìn)一步的,所述2-ctcresin替代度為1.0mmol/g~1.5mmol/g,優(yōu)選替代度為1.1mmol/g。
7、進(jìn)一步的,該方法具體包括:將所述fp(28-37)片段的c端和fp(38-46)-resin片段的n端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后,再脫去fmoc保護(hù)基得到fp(28-46)-resin片段;將所述fp(21-27)片段的c端與fp(28-46)-resin片段的n端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后,再脫去fmoc保護(hù)基得到fp(21-46)-resin片段;將所述fp(9-20)片段的c端與fp(21-46)-resin片段的n端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后,再脫去fmoc保護(hù)基得到fp(9-46)-resin片段;將所述fp(1-8)片段的c端與fp(9-46)-resin片段的n端進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)后,得到fp(1-46)-resin片段,得到所述hy3000的46肽肽樹脂。
8、進(jìn)一步的,用fmoc法固相縮合各個保護(hù)氨基酸或全保護(hù)片段所用的縮合體系為dic/hobt或dic/oxyma或pybop/hobt/diea其中的一種或多種,所用的反應(yīng)溶劑為dcm、dmf、dmso、nmp中的一種或多種;fmoc脫除試劑為20%pip/dmf溶液;縮合體系及其比例為肽樹脂/片段肽或/dic/hobt=1/2/2.4/2.4;所用的反應(yīng)溶劑優(yōu)選為dmf。
9、進(jìn)一步的,該方法還包括:將所述hy3000的46肽肽樹脂用裂解液在室溫下裂解2h~4h,得到所述hy3000的46肽粗肽,再經(jīng)制備色譜純化得所述hy3000的46肽精肽。
10、進(jìn)一步的,所述裂解液為80%以上體積比的tfa和苯酚、苯甲硫醚、dtt、edt、dodt、tes、tis、h2o中的一種或數(shù)種試劑的不同比例的混合物;所述裂解液優(yōu)選為tfa/edt/tis/h2o=91%:3%:3%:3%。
11、進(jìn)一步的,該方法還包括:將所述hy3000的46肽精肽與膽固醇衍生物bapc連接,再經(jīng)制備色譜純化得hy3000api。
12、進(jìn)一步的,在將所述hy3000的46肽精肽與膽固醇衍生物bapc連接的步驟中,包括:將所述hy3000的46肽精肽用dmf或dmso或thf溶清后,加入的bapc,再加入diea,在室溫下攪拌反應(yīng)1h~2h即得hy3000溶液;其中,hy3000的46肽精肽/bapc/diea=1/1.05~1.3/2~20,優(yōu)選為hy3000的46肽精肽/bapc/diea=1/1.05/15。
13、相較于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具有以下優(yōu)點:
14、本發(fā)明提供一種多肽類新冠病毒膜融合抑制劑的合成方法,以全保護(hù)片段肽固相偶聯(lián)法合成hy3000的46肽部分,具體為:首先通過固相合成得到幾個全保護(hù)的片段多肽,再在固相載體上依序縮合得到全保護(hù)的長肽鏈,最后裂解側(cè)鏈保護(hù)基得到hy3000的46肽部分。能避免因固相逐個偶聯(lián)氨基酸導(dǎo)致的肽鏈折疊、偶聯(lián)困難等問題,并能大大提高所得hy3000的46肽粗肽的純度、收率,最后再經(jīng)膽固醇衍生物(bapc)修飾后,通過制備色譜純化得到hy3000的api精肽。
15、1)本發(fā)明選擇不容易發(fā)生消旋反應(yīng)的氨基酸位點如ala、leu、ile、gly,由于空間位阻小,有利于反應(yīng)的快速進(jìn)行,可減少消旋副反應(yīng)的產(chǎn)生。
16、2)本發(fā)明根據(jù)逐步偶聯(lián)過程中肽樹脂的收縮現(xiàn)象選擇切分位點,避免了hy3000肽序中多處肽鏈折疊,克服了保護(hù)氨基酸逐個偶聯(lián)速率較慢的問題,可以得到純度、收率遠(yuǎn)高于逐個偶聯(lián)所得的46肽粗肽。
17、3)本發(fā)明所選擇的全保護(hù)片段肽序列,在全保護(hù)肽的制備過程中,保護(hù)氨基酸均易于偶聯(lián),肽樹脂裂解后易于析出純度高的全保護(hù)片段肽固體,無需使用制備色譜純化,節(jié)省時間及成本。
18、4)本發(fā)明所選擇的全保護(hù)片段肽序列,在將其依序偶聯(lián)至固相載體上時,無需特殊的條件,即可表現(xiàn)有很高的偶聯(lián)速率,且能得到雜質(zhì)更少,純度、收率均更高的46肽粗肽。