本公開屬于生物醫(yī)藥和疫苗，尤其涉及針對(duì)sars-cov-2，具體為針對(duì)不同的奧密克戎(omicron)變異株的多價(jià)疫苗和組合物。

背景技術(shù)：

1、sars-cov-2的基因組隨著在不同宿主群體中的傳播而不斷發(fā)生變異，產(chǎn)生了多種亞型，其中，sars-cov-2奧密克戎變異株是最早在南非發(fā)現(xiàn)的具有高度傳染性的一種變體。

2、奧密克戎作為新冠病毒的新型變異株，2021年11月被世界衛(wèi)生組織正式命名。奧密克戎的基因突變數(shù)量比德爾塔多1倍以上，綜合傳染性是德爾塔2倍以上。此外，奧密克戎擁有多個(gè)變種，新變種毒株會(huì)使新冠病毒的疫苗效果下降，這反而凸顯了加強(qiáng)免疫變得更重要，因?yàn)橐呙缒苡|發(fā)中和抗體，應(yīng)對(duì)新的變種病毒。

3、聯(lián)合疫苗由兩種以上疫苗原液按特定比例配合制成，可以預(yù)防多種疾病或由同一病原微生物的不同亞型感染引起的疾病，前者成為多聯(lián)疫苗，后者成為多價(jià)疫苗。聯(lián)合疫苗并不等于任意單種疫苗的簡(jiǎn)單疊加，其不僅不會(huì)加重注射后的副作用，還能有效降低因多次接種而可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

4、基于當(dāng)前不同sars-cov-2變異株肆虐的形勢(shì)之下，聯(lián)合型免疫策略為預(yù)防不同變異株的感染、減少疫苗注射次數(shù)以及降低免疫不良反應(yīng)提供了新思路。因此，迫切需要能夠同時(shí)有效針對(duì)不同sars-cov-2變異株的疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了針對(duì)sars-cov-2，特別是針對(duì)sars-cov-2omicron不同變異株的mrna疫苗，其遞送至小鼠體內(nèi)后能夠在體內(nèi)表達(dá)預(yù)融合穩(wěn)定形式的重組s蛋白，觸發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體。經(jīng)本發(fā)明的疫苗免疫的血清具有針對(duì)多種omicron變異株的特異性高效價(jià)抗體，而且對(duì)多種omicron變異株具有較強(qiáng)的交叉中和活性，同時(shí)對(duì)野生型和delta變異株均有一定的抑制效果。

2、本發(fā)明還提供了針對(duì)sars-cov-2及其變異株(例如omicron和delta變異株)的mrna疫苗組合物，經(jīng)本發(fā)明的mrna疫苗組合物免疫的血清能夠?qū)Χ喾Nsars-cov-2變異株起到抑制效果，其中對(duì)野生型、omicron型和delta型sars-cov-2均具有較強(qiáng)的中和能力，從而能夠預(yù)防不同變異株感染所引起的疾病。

3、sars-cov-2與sars-cov和mers-cov同屬于冠狀病毒科的β-冠狀病毒屬。sars-cov-2基因組序列全長(zhǎng)29903bp，與sars-cov基因序列同一性為79.5％，與mers-cov序列同一性為40％。sars-cov-2病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)包括單股正鏈核酸(ssrna)、刺突蛋白(spikeprotein，s)、膜蛋白(membrane?protein，m)、包膜蛋白(envelop?protein，e)和核衣殼蛋白(nucelocapsid?protein，n)。與其他β-冠狀病毒類似，sars-cov-2病毒的對(duì)細(xì)胞的吸附入侵過程主要依賴于s蛋白；在該過程中，s蛋白以同源三聚體的形式裝配，其具有短的胞質(zhì)尾和疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，將蛋白質(zhì)錨定到膜中。

4、s蛋白可分為受體結(jié)合亞基s1和膜融合亞基s2，s1亞基可進(jìn)一步分成信號(hào)肽區(qū)域(signal?peptide，sp)、n-端區(qū)域(n-terminal?domain，ntd)和受體結(jié)合域(receptorbinding?domain，rbd)。s2亞基通過跨膜區(qū)錨定在膜上，它含有膜融合過程所需要的基本元件，包括：內(nèi)在的膜融合肽(fusion?peptide，fp)、兩個(gè)7肽重復(fù)序列(heptad?repeat，hr)、跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane?domain，tm)，以及c末端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic?domain，cp)。

5、s蛋白從n端到c端由信號(hào)肽區(qū)域(sp)、胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)、跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(cp)組成。其中，胞外結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步分成n-端區(qū)域(ntd)、受體結(jié)合域(rbd)、一個(gè)內(nèi)在的膜融合肽(fp)和兩個(gè)7肽重復(fù)序列(hr1和hr2)，屬于第一類病毒膜融合蛋白。s蛋白的信號(hào)肽區(qū)域?qū)?yīng)于s蛋白的氨基酸位置1-13的區(qū)域；胞外結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于s蛋白的氨基酸位置14-1213的區(qū)域；跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于s蛋白的氨基酸位置1214-1237的區(qū)域；胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于s蛋白的氨基酸位置1238-1273的區(qū)域。s蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。在本文中，除非另有說明，否則重組s蛋白的氨基酸位置按照如seq?id?no.1所示的野生型s蛋白的氨基酸序列進(jìn)行編號(hào)。

6、通過對(duì)s蛋白預(yù)融合結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)s1亞基的rbd結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷鉸鏈類似的構(gòu)象移動(dòng)來隱藏或暴露受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，“向下”為受體不可結(jié)合狀態(tài)，“向上”為受體可結(jié)合狀態(tài)，處于較為不穩(wěn)定的狀態(tài)。這種構(gòu)象使得s蛋白能夠容易地與宿主受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ace2)結(jié)合。當(dāng)rbd與受體結(jié)合后，s2亞基通過將fp插入宿主細(xì)胞膜而改變?yōu)槿诤虾髽?gòu)象，hr1和hr2形成一個(gè)反平行的六螺旋束(6hb)，共同組成一個(gè)融合核心，最終導(dǎo)致病毒膜與細(xì)胞膜融合。使用冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)，在預(yù)融合構(gòu)象中確定了大量的三聚體s糖蛋白結(jié)構(gòu)域，預(yù)融合s蛋白上存在大量中和抗體敏感表位，而融合后構(gòu)象使僅存在于預(yù)融合構(gòu)象上的中和敏感表位的暴露量降至最低。因此，表達(dá)預(yù)融合穩(wěn)定形式的sars-cov-2s三聚體蛋白，是開發(fā)安全有效的sars-cov-2疫苗的關(guān)鍵。優(yōu)化的疫苗抗原將保留存在于s蛋白的預(yù)融合構(gòu)象形式中的表位，并誘導(dǎo)能夠抑制病毒融合的抗體。

7、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“sars-cov-2omicron變異株”、“sars-cov-2奧密克戎變異株”、“omicron變異株”、“奧密克戎變異株”、“b.1.1.529”、“omicron型新冠病毒”、“奧密克戎型新冠病毒”可互換使用，并且是指2021年11月在南非首次出現(xiàn)的sars-cov-2亞型，其相對(duì)于野生型sars-cov-2，在基因組諸多位置發(fā)生了突變，包括在s蛋白、orf1a、orf1b、orf9b、m蛋白、e蛋白、n蛋白中發(fā)生了突變。這些突變不僅導(dǎo)致omicron變異株傳播能力更強(qiáng)，而且導(dǎo)致該病毒亞型對(duì)抗體保護(hù)作用的抵制力增強(qiáng)，使其對(duì)目前的sars-cov-2疫苗更具有抵抗力，能夠逃避疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。目前，omicron變異株共有5個(gè)亞型(ba.1、ba.2、ba.3、ba.4、ba.5)，并且已經(jīng)先后演變成多種子代亞分支，例如bq1.1、ba.2.75.2、xbb、xbb.1.5、bf.7、ch.1.1。

8、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“sars-cov-2delta變異株”、“sars-cov-2德爾塔變異株”、“delta變異株”、“sars-cov-2德爾塔變異株”、“b.1.617.2”、“delta型新冠病毒”、“德爾塔型新冠病毒”可互換使用，并且是指2020年10月在印度首次出現(xiàn)的sars-cov-2亞型，其相對(duì)于sars-cov-2，在基因組諸多位置發(fā)生了突變。這些突變觸發(fā)了新冠病毒的免疫逃逸，導(dǎo)致該病毒相對(duì)于其他早期的新冠病毒亞型具有對(duì)人體適應(yīng)性更強(qiáng)、傳播速度更快、病毒載量更高、治療所需時(shí)間更長(zhǎng)、更容易發(fā)展成重癥等特點(diǎn)。

9、在第一方面，本發(fā)明提供了重組sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)，所述重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白在胞外結(jié)構(gòu)域中包括以下突變中的任一組：

10、(1)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

11、(2)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

12、(3)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k和d1199n；

13、(4)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

14、(5)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

15、其中，氨基酸位置按照如seq?id?no.1所示的野生型s蛋白的氨基酸序列進(jìn)行編號(hào)。

16、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“-”是指相應(yīng)位置的氨基酸缺失或刪除突變。例如，重組s蛋白包含“l(fā)24-”突變是指重組s蛋白在對(duì)應(yīng)于野生型s蛋白的氨基酸序列編號(hào)24的位置處亮氨酸(l)缺失或刪除。

17、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域中的s1/s2切割位點(diǎn)rrar(對(duì)應(yīng)于s蛋白的氨基酸位置682-685)可以經(jīng)突變以失去被蛋白酶例如弗林樣(furin-like)蛋白酶和溶酶體蛋白酶切割的能力。在一些實(shí)施方案中，可以將重組s蛋白中的s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg。

18、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域中的s2切割位點(diǎn)kr(對(duì)應(yīng)于s蛋白的氨基酸位置814-815)經(jīng)突變以失去被蛋白酶例如弗林樣蛋白酶和溶酶體蛋白酶切割的能力。在一些實(shí)施方案中，可以將重組s蛋白或其抗原性片段中的s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

19、sars-cov-2病毒在細(xì)胞內(nèi)包裝過程中，s蛋白可能會(huì)被蛋白酶例如弗林樣蛋白酶或溶酶體蛋白酶切割，分泌出s1亞基和s2亞基呈非融合狀態(tài)的s蛋白。通過對(duì)重組s蛋白中的切割位點(diǎn)例如s1/s2切割位點(diǎn)和/或s2切割位點(diǎn)進(jìn)行突變，可以避免重組s蛋白被蛋白酶切割，從而進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性。

20、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白還包括k986p和v987p突變。在重組s蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域中引入2個(gè)脯氨酸突變k986p和v987p可以提高預(yù)融合構(gòu)象的穩(wěn)定性。

21、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白可以不包含功能性融合肽結(jié)構(gòu)域(fp結(jié)構(gòu)域：對(duì)應(yīng)于s蛋白的氨基酸位置788-806)。例如，重組s蛋白可以包含經(jīng)突變的融合肽結(jié)構(gòu)域，例如通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加，導(dǎo)致融合肽結(jié)構(gòu)域失去其天然功能，例如介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜進(jìn)行融合的功能。或者，在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白可以不包含融合肽結(jié)構(gòu)域。

22、通過在重組s蛋白中去除功能性融合肽結(jié)構(gòu)域，能夠提高預(yù)融合構(gòu)象的穩(wěn)定性，使得保留和暴露s蛋白的預(yù)融合構(gòu)象上存在的大量中和抗體敏感表位。

23、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白可以不包含跨膜結(jié)構(gòu)域(對(duì)應(yīng)于s蛋白的氨基酸位置1214-1237的區(qū)域)和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(對(duì)應(yīng)于s蛋白的氨基酸位置1238-1273的區(qū)域)。在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白可以不包含胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白可以不包含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白還包含三聚體結(jié)構(gòu)域，所述三聚體結(jié)構(gòu)域當(dāng)表達(dá)時(shí)促進(jìn)所述重組s蛋白形成三聚體。

24、如本文所用，“三聚體結(jié)構(gòu)域”是指當(dāng)表達(dá)時(shí)，能夠自發(fā)或誘導(dǎo)形成三聚體的蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域已知多種此類三聚體結(jié)構(gòu)域。通過在重組s蛋白中包括三聚體結(jié)構(gòu)域(例如通過構(gòu)建融合蛋白)，能夠促進(jìn)重組s蛋白形成三聚體構(gòu)象，和/或穩(wěn)定化重組s蛋白的三聚體構(gòu)象。

25、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白中的三聚體結(jié)構(gòu)域可以包含t4噬菌體fibritin三聚體基序。在一些實(shí)施方案中，所述t4噬菌體fibritin三聚體基序可以具有seq?id?no.29(gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl)所示的氨基酸序列。

26、在一些實(shí)施方案中，三聚體結(jié)構(gòu)域可以與重組s蛋白直接融合。在另一些實(shí)施方案中，三聚體結(jié)構(gòu)域可以通過接頭與重組s蛋白融合。在一些實(shí)施方案中，三聚體結(jié)構(gòu)域可以與重組s蛋白的n端融合。在另一些實(shí)施方案中，三聚體結(jié)構(gòu)域可以與重組s蛋白的c端融合。例如，三聚體結(jié)構(gòu)域可以通過接頭與重組s蛋白的c端融合。在一些實(shí)施方案中，所述接頭序列可以包含seq?id?no.30(saig)所示的序列。

27、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白還包含信號(hào)序列；優(yōu)選地，所述信號(hào)序列包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(ighv)信號(hào)序列。例如，所述信號(hào)序列可以具有seq?id?no.31(mdwiwrilflvgaatgahs)所示的氨基酸序列。

28、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由以下中的任一項(xiàng)組成：

29、i)胞外結(jié)構(gòu)域；

30、ii)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和任選的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；

31、iii)胞外結(jié)構(gòu)域和三聚體結(jié)構(gòu)域；

32、iv)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、任選的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、和三聚體結(jié)構(gòu)域；

33、v)信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域；

34、vi)信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和任選的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；

35、vii)信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域和三聚體結(jié)構(gòu)域；和

36、viii)信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、任選的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、和三聚體結(jié)構(gòu)域。

37、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由以下組成：任選的信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、任選的跨膜結(jié)構(gòu)域、任選的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和任選的三聚體結(jié)構(gòu)域。

38、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由以下組成：胞外結(jié)構(gòu)域、任選的跨膜結(jié)構(gòu)域和任選的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

39、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由以下組成：信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

40、在一些實(shí)施方案中，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變中的一種或多種：

41、(1)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

42、(2)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

43、(3)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k和d1199n；

44、(4)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

45、(5)t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；

46、(6)s1/s2切割位點(diǎn)rrar經(jīng)突變以失去被弗林樣蛋白酶和溶酶體蛋白酶切割的能力，優(yōu)選地，s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg；

47、(7)s2切割位點(diǎn)kr經(jīng)突變以失去被弗林樣蛋白酶和溶酶體蛋白酶切割的能力，優(yōu)選地，s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n；

48、(8)k986p和/或v987p突變；

49、(9)融合肽結(jié)構(gòu)域經(jīng)突變以失去介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜進(jìn)行融合的功能；優(yōu)選融合肽結(jié)構(gòu)域缺失突變。

50、在一些實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(ighv)信號(hào)序列。例如，所述信號(hào)序列具有seq?id?no.31所示的氨基酸序列。

51、在一些實(shí)施方案中，所述三聚體結(jié)構(gòu)域?yàn)閠4噬菌體fibritin三聚體基序。在一些實(shí)施方案中，所述t4噬菌體fibritin三聚體基序具有seq?id?no.29所示的氨基酸序列。

52、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

53、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

54、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、k986p、v987p、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。例如，重組s蛋白具有如seq?id?no.6所示的氨基酸序列。

55、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

56、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

57、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、k986p、v987p、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。例如，重組s蛋白具有如seq?id?no.7所示的氨基酸序列。

58、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k和d1199n。

59、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、d1199n、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

60、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、d1199n、k986p、v987p、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。例如，重組s蛋白具有如seq?id?no.8所示的氨基酸序列。

61、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

62、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

63、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、k986p、v987p、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。例如，重組s蛋白具有如seq?id?no.9所示的氨基酸序列。

64、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k。

65、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

66、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白從n端到c端由信號(hào)序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成，所述胞外結(jié)構(gòu)域相對(duì)于野生型序列具有以下突變：t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k、k986p、v987p、s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg和s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。例如，重組s蛋白具有如seq?id?no.10所示的氨基酸序列。

67、在一些實(shí)施方案中，重組s蛋白具有選自seq?id?no.6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。

68、在第二方面，本發(fā)明提供了mrna，其編碼本發(fā)明第一方面的重組s蛋白。

69、在一些實(shí)施方案中，mrna從5’到3’方向包含帽結(jié)構(gòu)、5’-utr、編碼本發(fā)明的重組s蛋白的開放閱讀框(orf)、3’-utr和polya尾。

70、在一些實(shí)施方案中，帽結(jié)構(gòu)可以具有m7g5’ppp5’(2’-ome)npg，其中m7g為n7-甲基鳥嘌呤核苷；p為磷酸；ppp為三磷酸；2’-ome為2’-甲氧基修飾；n為任意核苷，例如腺嘌呤核苷(a)、鳥嘌呤核苷(g)、胞嘧啶核苷(c)和尿嘧啶核苷(u)，或天然存在的其它核苷或經(jīng)修飾的核苷。

71、在一些實(shí)施方案中，5’-utr可以包含選自下組的基因的5’-utr或其同源物、片段或變體：β-珠蛋白(hbb)基因、熱休克蛋白70(hsp70)基因、軸絲動(dòng)力蛋白重鏈2(dnah2)基因、17β-羥基類固醇脫氫酶4(hsd17b4)基因。例如，變體序列可以與相應(yīng)基因的野生型5’-utr序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。

72、在一些實(shí)施方案中，5’-utr包含衍生自17β-羥基類固醇脫氫酶4(hsd17b4)基因的5’-utr或其同源物、片段或變體。在一些實(shí)施方案中，5’-utr包含衍生自17β-羥基類固醇脫氫酶4(hsd17b4)基因的5’-utr或其同源物、片段或變體。在一些實(shí)施方案中，5’-utr包含如seq?id?no.27(gtcccgcagtcggcgtccagcggctctgcttgttcgtgtgtgtgtcgt?tgcaggccttattc)所示的序列。

73、在一些實(shí)施方案中，3’-utr可以包含選自下組的基因的3’-utr或其同源物、片段或變體：白蛋白(alb)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(hbb)基因、酪氨酸羥化酶基因、熱休克蛋白70(hsp70)基因，脂氧合酶基因和膠原蛋白α基因。例如，變體序列可以與相應(yīng)基因的野生型3’-utr序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，3’-utr包含衍生自白蛋白(alb)基因的3’-utr或其同源物、片段或變體。優(yōu)選地，3’-utr包含如seq?id?no.28(agccaacaccctgtctaaaaaacataaatttctttaatcattttgcctc?ttttctctgtgcttcaattaataaaaaatggaaagaacct)所示的序列。

74、在一些實(shí)施方案中，poly?a尾的長(zhǎng)度可以為100-200個(gè)核苷酸，例如約100個(gè)核苷酸，約110個(gè)核苷酸，約120個(gè)核苷酸，約130個(gè)核苷酸，約140個(gè)核苷酸，約150個(gè)核苷酸，約160個(gè)核苷酸，約170個(gè)核苷酸，約180個(gè)核苷酸，約190個(gè)核苷酸，或約200個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，polya尾的長(zhǎng)度可以為100-150個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述poly?a尾的長(zhǎng)度可以為約120個(gè)核苷酸。

75、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的mrna包含如seq?id?no.15-19中任一項(xiàng)所示的序列，或由seq?id?no.15-19中任一項(xiàng)所示的序列組成。

76、在一些實(shí)施方案中，mrna中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以是經(jīng)修飾的。例如，mrna中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如所有核苷酸)可以各自獨(dú)立替換為天然存在的核苷酸類似物或人工合成的核苷酸類似物。

77、在一些實(shí)施方案中，天然存在的核苷酸類似物選自假尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和n6-甲基腺苷。在一些實(shí)施方案中，人工合成的核苷酸類似物選自n1-甲基假尿苷和5-乙炔基尿苷。

78、在一些實(shí)施方案中，mrna中的一個(gè)或多個(gè)尿苷三磷酸可以各自獨(dú)立地替換為假尿苷三磷酸、2-硫尿苷三磷酸、5-甲基尿苷三磷酸、n1-甲基假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸，和/或一個(gè)或多個(gè)胞苷三磷酸可以各自獨(dú)立地替換為5-甲基胞苷三磷酸，和/或一個(gè)或多個(gè)腺苷三磷酸可以各自獨(dú)立地替換為n6-甲基腺苷三磷酸。

79、在一些實(shí)施方案中，mrna中的一個(gè)或多個(gè)尿苷三磷酸可以各自獨(dú)立替換為假尿苷三磷酸、1-甲基-假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸。在一些實(shí)施方案中，mrna中的一個(gè)或多個(gè)胞苷三磷酸可以各自獨(dú)立替換為5-甲基胞苷三磷酸。

80、在第三方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含一種或多種本發(fā)明第一方面的重組s蛋白，或一種或多種本發(fā)明第二方面的mrna。

81、在一些實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種本發(fā)明第一方面的重組s蛋白。在一些實(shí)施方案中，組合物包含具有seq?id?no.6-10中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的重組s蛋白。

82、在一些實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種本發(fā)明第二方面的mrna。在一些實(shí)施方案中，組合物包含具有seq?id?no.15-19中任一項(xiàng)所示的序列的mrna。

83、在一些實(shí)施方案中，組合物中不同重組s蛋白或不同mrna的摩爾比例為1-3:1-3，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1.5:2.5、2:1.5、2:2.5、2:3、2.5:3，優(yōu)選1:1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中不同的本發(fā)明第一方面的重組s蛋白的摩爾比例為1-3:1-3，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1.5:1、1.5:2、1.5:2.5、2:1、2:1.5、2:2.5、2:3、2.5:1、2.5:1.5、2.5:2、2.5:3、3:1、3:2、3:2.5，優(yōu)選1:1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中不同的本發(fā)明第二方面的mrna的摩爾比例為1-3:1-3，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1.5:1、1.5:2、1.5:2.5、2:1、2:1.5、2:2.5、2:3、2.5:1、2.5:1.5、2.5:2、2.5:3、3:1、3:2、3:2.5，優(yōu)選1:1。

84、在一些實(shí)施方案中，組合物還包含至少一種以下重組s蛋白或編碼其的mrna：

85、(a)野生型s蛋白；

86、(b)相對(duì)于野生型s蛋白包括以下突變的重組s蛋白：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r和d950n；

87、(c)相對(duì)于野生型s蛋白包括以下突變的重組s蛋白：a67v、h69缺失突變、v70缺失突變、t95i、g142缺失突變、v143缺失突變、y144缺失突變、y145d、n211缺失突變、l212i、在r214和d215之間三個(gè)氨基酸e、p、e的插入突變、g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、t547k、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、n856k、q954h、n969k和l981f；

88、(d)相對(duì)于野生型s蛋白包括以下突變的重組s蛋白：g75v、t76i、r246缺失、s247缺失、y248缺失、l249缺失、t250缺失、p251缺失、g252缺失、d253n、l452q、f490s、d614g和t859n。

89、在一些實(shí)施方案中，上述重組s蛋白(a)-(d)中的s1/s2切割位點(diǎn)rrar可以經(jīng)突變以失去被蛋白酶例如弗林樣蛋白酶和溶酶體蛋白酶切割的能力；優(yōu)選地，s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg。

90、在一些實(shí)施方案中，上述重組s蛋白(a)-(d)中的s2切割位點(diǎn)kr可以經(jīng)突變以失去被蛋白酶例如弗林樣蛋白酶和溶酶體蛋白酶切割的能力；優(yōu)選地，s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n。

91、在一些實(shí)施方案中，上述重組s蛋白(a)-(d)相對(duì)于野生型s蛋白還包括k986p和v987p突變。

92、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組s蛋白(a)-(d)具有選自seq?id?no.2-5中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼重組s蛋白(a)-(d)的mrna具有選自seq?idno.11-14中任一項(xiàng)所示的序列。

93、在一些實(shí)施方案中，組合物中不同重組s蛋白或不同mrna的摩爾比例為1-3:1-3，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1.5:2.5、2:1.5、2:2.5、2:3、2.5:3，優(yōu)選1:1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中不同的本發(fā)明第一方面的重組s蛋白的摩爾比例為1-3:1-3，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1.5:1、1.5:2、1.5:2.5、2:1、2:1.5、2:2.5、2:3、2.5:1、2.5:1.5、2.5:2、2.5:3、3:1、3:2、3:2.5，優(yōu)選1:1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中不同的本發(fā)明第二方面的mrna的摩爾比例為1-3:1-3，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1.5:1、1.5:2、1.5:2.5、2:1、2:1.5、2:2.5、2:3、2.5:1、2.5:1.5、2.5:2、2.5:3、3:1、3:2、3:2.5，優(yōu)選1:1。

94、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n、s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

95、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

96、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

97、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

98、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n、s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

99、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k和d1199n；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

100、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

101、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k和d1199n；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

102、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1、重組s蛋白-2和重組s蛋白-3，或mrna-1、mrna-2和mrna-3，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；其中重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、g142d、k147e、w152r、f157l、i210v、v213g、g257s、g339h、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h、n969k和d1199n；重組s蛋白-3或mrna-3編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1、重組s蛋白-2與重組s蛋白-3的摩爾比例為1:1:1，或組合物中mrna-1、mrna-2與mrna-3的摩爾比例為1:1:1。

103、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1、重組s蛋白-2和重組s蛋白-3，或mrna-1、mrna-2和mrna-3，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n、s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；其中重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-3或mrna-3編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1、重組s蛋白-2與重組s蛋白-3的摩爾比例為1:1:1，或組合物中mrna-1、mrna-2與mrna-3的摩爾比例為1:1:1。

104、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1、重組s蛋白-2和重組s蛋白-3，或mrna-1、mrna-2和mrna-3，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n、s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；其中重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-3或mrna-3編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486s、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1、重組s蛋白-2與重組s蛋白-3的摩爾比例為1:1:1，或組合物中mrna-1、mrna-2與mrna-3的摩爾比例為1:1:1。

105、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1、重組s蛋白-2和重組s蛋白-3，或mrna-1、mrna-2和mrna-3，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n、s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；其中重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-3或mrna-3編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1、重組s蛋白-2與重組s蛋白-3的摩爾比例為1:1:1，或組合物中mrna-1、mrna-2與mrna-3的摩爾比例為1:1:1。

106、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1、重組s蛋白-2和重組s蛋白-3，或mrna-1、mrna-2和mrna-3，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：t19r、g142d、e156g、f157和r158缺失突變、a222v、l452r、t478k、d614g、p681r、d950n、s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；其中重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、l452r、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-3或mrna-3編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1、重組s蛋白-2與重組s蛋白-3的摩爾比例為1:1:1，或組合物中mrna-1、mrna-2與mrna-3的摩爾比例為1:1:1。

107、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1、重組s蛋白-2和重組s蛋白-3，或mrna-1、mrna-2和mrna-3，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)突變?yōu)閍n、k986p和v987p；其中重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-3或mrna-3編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1、重組s蛋白-2與重組s蛋白-3的摩爾比例為1:1:1，或組合物中mrna-1、mrna-2與mrna-3的摩爾比例為1:1:1。

108、在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含重組s蛋白-1和重組s蛋白-2，或mrna-1和mrna-2，其中重組s蛋白-1或mrna-1編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、h69-、v70-、g142d、v213g、g339d、r346t、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、k444t、l452r、n460k、s477n、t478k、e484a、f486v、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；重組s蛋白-2或mrna-2編碼的重組s蛋白相對(duì)于野生型s蛋白包含以下突變：s1/s2切割位點(diǎn)rrar突變?yōu)間gsg、s2切割位點(diǎn)kr突變?yōu)閍n、k986p、v987p、t19i、l24-、p25-、p26-、a27s、v83a、g142d、y144-、h146q、q183e、v213e、g252v、g339h、r346t、l368i、s371f、s373p、s375f、t376a、d405n、r408s、k417n、n440k、v445p、g446s、n460k、s477n、t478k、e484a、f486p、f490s、q498r、n501y、y505h、d614g、h655y、n679k、p681h、n764k、d796y、q954h和n969k；并且組合物中重組s蛋白-1與重組s蛋白-2的摩爾比例為1:1，或組合物中mrna-1與mrna-2的摩爾比例為1:1。

109、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

110、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適合用于與人和動(dòng)物的組織接觸而沒有過度毒性、刺激性、變應(yīng)性應(yīng)答或其它問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的載體、賦形劑或稀釋劑。

111、用于本發(fā)明的組合物中的示例性載體包括鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水。用于本發(fā)明的組合物中的示例性賦形劑包括填充劑、粘合劑、崩解劑、包衣劑、吸附劑、抗粘附劑、助流劑、防腐劑、抗氧化劑、調(diào)味劑、著色劑、甜味劑、溶劑、共溶劑、緩沖劑、螯合劑、粘度賦予劑、表面活性劑、稀釋劑、潤(rùn)濕劑、載體、稀釋劑、防腐劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和張力調(diào)節(jié)劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知選擇合適的賦形劑以制備本發(fā)明的組合物。通常，合適的賦形劑的選擇尤其取決于所使用的活性劑、待治療的疾病和組合物的期望劑型。

112、根據(jù)所采用的活性劑(如mrna)，可將本公開的組合物制備成各種形式，如固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)或凍干形式，特別可以是軟膏劑、乳膏劑、透皮貼劑、凝膠劑、粉劑、片劑、溶液劑、氣霧劑、顆粒劑、丸劑、混懸劑、乳劑、膠囊劑、糖漿劑、液體劑、酏劑、浸膏劑、酊劑或流浸膏提取物的形式，或者是特別適用于所需施用方法的形式。本發(fā)明已知的用于生產(chǎn)藥物的過程在第22版的remington’s?pharmaceutical?sciences(ed.maackpublishing?co，easton，pa.，2012)中顯示，并可包括例如常規(guī)混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或凍干過程。

113、在一些實(shí)施方案中，組合物可以是疫苗組合物，任選地，疫苗組合物還包含一種或多種佐劑。

114、如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“疫苗組合物”指誘導(dǎo)或改進(jìn)對(duì)特定疾病的免疫的生物制劑。用疫苗組合物激發(fā)個(gè)體的免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的形成和/或增殖，該免疫細(xì)胞特異性識(shí)別由疫苗包含的化合物。所述免疫細(xì)胞的至少一部分保持存活一段時(shí)間，其可以延長(zhǎng)至疫苗接種后10、20或30年。如果個(gè)體的免疫系統(tǒng)在前述時(shí)間段內(nèi)遇到衍生能引發(fā)免疫應(yīng)答的化合物的病原體，那么通過疫苗接種生成的免疫細(xì)胞被再活化，且相比于尚未用疫苗激發(fā)和首次遇到病原體的免疫原性化合物的個(gè)體的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)針對(duì)該病原體的免疫應(yīng)答。

115、在本文中，“疫苗接種”、“免疫接種”、“免疫”或“接種”是指向受試者施用疫苗，其目的是防止受試者發(fā)展出疾病的一種或多種癥狀。原則上，疫苗接種包括初次疫苗接種和任選地一次或多次加強(qiáng)疫苗接種。初次疫苗接種或初次免疫定義為施用本文公開的組合物或單位劑量以建立保護(hù)性免疫應(yīng)答的初次施用計(jì)劃。加強(qiáng)疫苗接種或加強(qiáng)免疫是指在初次疫苗接種之后，例如在初次疫苗接種計(jì)劃的最后一次施用后至少一周、至少2周、至少一個(gè)月、至少6個(gè)月、至少1年或甚至5或10年之后進(jìn)行的施用或施用計(jì)劃。加強(qiáng)施用試圖增強(qiáng)或重建初次疫苗接種的免疫應(yīng)答。

116、對(duì)本發(fā)明的組合物或疫苗組合物的免疫應(yīng)答是受試者中形成對(duì)組合物中存在的抗原蛋白的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。出于本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng)答”指由抗體分子，包括分泌性(iga)或igg分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答”指由t-淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要方面牽涉細(xì)胞裂解t細(xì)胞(“ctl”)的抗原特異性應(yīng)答。ctl對(duì)由主要組織相容性復(fù)合物(mhc)編碼并且在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合呈遞的肽抗原具有特異性。ctl幫助誘導(dǎo)并促進(jìn)對(duì)胞內(nèi)微生物的破壞，或者此類微生物感染的細(xì)胞的裂解。細(xì)胞免疫的另一個(gè)方面牽涉輔助t細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答。輔助t細(xì)胞作用為幫助刺激功能，并且聚焦非特異性效應(yīng)細(xì)胞針對(duì)在其表面上展示與mhc分子結(jié)合的肽抗原的細(xì)胞的活性。細(xì)胞免疫應(yīng)答還涉及生成由活化的t細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞，包括那些自cd4+和cd8+t細(xì)胞衍生的細(xì)胞生成的細(xì)胞因子、趨化因子和其它此類分子。

117、因此，免疫應(yīng)答可以是刺激ctl，和/或輔助t細(xì)胞生成或活化的應(yīng)答。也可以刺激趨化因子和/或細(xì)胞因子的生成。本發(fā)明的組合物或疫苗組合物也可以引發(fā)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，免疫應(yīng)答可以包括下列一種或多種效應(yīng)：b細(xì)胞的抗體(例如iga或igg)生成；和/或抑制物、細(xì)胞毒性或輔助t細(xì)胞和/或特異性針對(duì)疫苗中存在的蛋白的t細(xì)胞的活化。這些應(yīng)答可以用來中和感染性，和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體，或抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(adcc)以對(duì)經(jīng)免疫個(gè)體提供保護(hù)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定法和中和測(cè)定法測(cè)定此類應(yīng)答。

118、如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“佐劑”指在細(xì)胞水平或體液水平增加、刺激、活化、加強(qiáng)或調(diào)節(jié)針對(duì)組合物的活性成分的免疫應(yīng)答的試劑，例如，免疫佐劑刺激免疫系統(tǒng)針對(duì)實(shí)際抗原的應(yīng)答但其本身沒有免疫效應(yīng)。這樣的佐劑的實(shí)例包括但不限于無機(jī)佐劑(例如，無機(jī)金屬鹽例如磷酸鋁或氫氧化鋁)、有機(jī)佐劑(例如，皂角苷或鯊烯)、油基佐劑(如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)、細(xì)胞因子(如il-1β、il-2、il-7、il-12、il-18、gm-cfs和inf-γ)、顆粒狀佐劑(例如，免疫刺激性復(fù)合物(iscoms)、脂質(zhì)體或可生物降解的微球)、病毒顆粒、細(xì)菌佐劑(例如單磷酰脂質(zhì)a或胞壁肽)、合成佐劑(例如，非離子型嵌段共聚物、胞壁肽類似物或合成脂質(zhì)a)或合成多核苷酸佐劑(例如，多聚精氨酸或多聚賴氨酸)。優(yōu)選地，佐劑選自鋁佐劑(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、明礬)、mf59、as03、病毒體(例如肝炎病毒病毒體和流感病毒病毒體)、as04、熱可逆水包油乳液、isa51、弗氏佐劑、il-12、cpg基序、甘露糖或其任意組合。

119、在一些實(shí)施方案中，所述組合物或疫苗組合物還包含一種或多種另外的治療劑。例如，所述治療劑可以選自另外的抗原性蛋白或多肽、抗體、激素或激素類似物，和小分子藥物。

120、在第四方面，本發(fā)明提供了dna，其編碼本發(fā)明第二方面的mrna。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的dna可以用于在體外通過轉(zhuǎn)錄制備本發(fā)明的mrna。

121、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的dna包含如seq?id?no.20-24中任一項(xiàng)所示的序列，或由seq?id?no.20-24中任一項(xiàng)所示的序列組成。

122、在第五方面，本發(fā)明提供了重組質(zhì)粒，其包含本發(fā)明第四方面的dna。

123、在一些實(shí)施方案中，重組質(zhì)粒為pt7ts質(zhì)粒。

124、在一些實(shí)施方案中，重組質(zhì)粒還包含起始序列(ori)、t7啟動(dòng)子、5’-utr和3’-utr。

125、在一些實(shí)施方案中，起始序列為cole1型起始序列。優(yōu)選地，起始序列包含如seqid?no.25所示的序列，或由seq?id?no.25所示的序列組成。

126、在一些實(shí)施方案中，t7啟動(dòng)子包含如seq?id?no.26(taatacgactcactataatg)所示的序列，或由seq?id?no.26所示的序列組成。

127、在一些實(shí)施方案中，5’-utr可以包含選自下組的基因的5’-utr或其同源物、片段或變體：β-珠蛋白(hbb)基因、熱休克蛋白70(hsp70)基因、軸絲動(dòng)力蛋白重鏈2(dnah2)基因、17β-羥基類固醇脫氫酶4(hsd17b4)基因。例如，變體序列可以與相應(yīng)基因的野生型5’-utr序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。

128、在一些實(shí)施方案中，5’-utr包含衍生自17β-羥基類固醇脫氫酶4(hsd17b4)基因的5’-utr或其同源物、片段或變體。在一些實(shí)施方案中，5’-utr包含衍生自17β-羥基類固醇脫氫酶4(hsd17b4)基因的5’-utr或其同源物、片段或變體。在一些實(shí)施方案中，5’-utr包含如seq?id?no.27所示的序列。

129、在一些實(shí)施方案中，3’-utr可以包含選自下組的基因的3’-utr或其同源物、片段或變體：白蛋白(alb)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(hbb)基因、酪氨酸羥化酶基因、熱休克蛋白70(hsp70)基因，脂氧合酶基因和膠原蛋白α基因。例如，變體序列可以與相應(yīng)基因的野生型3’-utr序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的序列同一性。

130、在一些實(shí)施方案中，3’-utr包含衍生自白蛋白(alb)基因的3’-utr或其同源物、片段或變體。優(yōu)選地，3’-utr包含如seq?id?no.28所示的序列。

131、在一些實(shí)施方案中，重組質(zhì)粒還包含polya、抗性基因啟動(dòng)子和抗性基因。

132、在一些實(shí)施方案中，poly?a尾的長(zhǎng)度可以為100-200個(gè)核苷酸，例如約100個(gè)核苷酸，約110個(gè)核苷酸，約120個(gè)核苷酸，約130個(gè)核苷酸，約140個(gè)核苷酸，約150個(gè)核苷酸，約160個(gè)核苷酸，約170個(gè)核苷酸，約180個(gè)核苷酸，約190個(gè)核苷酸，或約200個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，polya尾的長(zhǎng)度可以為100-150個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述poly?a尾的長(zhǎng)度可以為約120個(gè)核苷酸。

133、在一些實(shí)施方案中，抗性基因啟動(dòng)子為氨芐青霉素抗性基因啟動(dòng)子。

134、在一些實(shí)施方案中，抗性基因?yàn)榱蛩峥敲顾乜剐曰颉?/p>

135、在第六方面，本發(fā)明提供了mrna-載體顆粒，其包含本發(fā)明第二方面的mrna，以及包封所述mrna的載體材料。

136、在一些實(shí)施方案中，載體材料可以選自魚精蛋白、脂質(zhì)納米顆粒(lnp)、高分子材料和無機(jī)納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體材料是lnp。

137、在一些實(shí)施方案中，lnp可以包含離子化脂質(zhì)、聚乙二醇化脂質(zhì)、膽固醇及衍生物和磷脂中的一種或多種。例如，lnp可以包含離子化脂質(zhì)、聚乙二醇化脂質(zhì)、膽固醇及衍生物和磷脂中的任一種，其中任意兩種、任意三種或全部四種的組合。

138、在第七方面，本發(fā)明提供了預(yù)防和/或治療受試者中與sars-cov-2感染相關(guān)的疾病或病癥的方法，其包括向受試者施用有效量的本發(fā)明第一方面的重組s蛋白、第二方面的mrna、第三方面的組合物、第五方面的重組質(zhì)粒、或第六方面mrna-載體顆粒。

139、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”或“治療”是指疾病或病癥的獲得或發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)的降低，即，使疾病的臨床癥狀的至少一種在疾病發(fā)作之前易受疾病感染、或未暴露于致病原的受試者中不發(fā)展。例如，治療可以包括：(i)在可能易患疾病、障礙和/或病癥但尚未診斷患有所述疾病、障礙和/或病癥的患者中預(yù)防所述疾病、障礙和/或病癥；(ii)抑制所述疾病、障礙和/或病癥，即阻止其發(fā)展；或(iii)減輕所述疾病、障礙和/或病癥，即引起所述疾病、障礙和/或病癥的消退。

140、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“有效量”意指當(dāng)施用到受試者用于治療或預(yù)防疾病時(shí)足以實(shí)現(xiàn)這樣的治療或預(yù)防的化合物的量?！坝行Я俊笨扇Q于化合物、疾病及其嚴(yán)重度、以及待治療的受試者的年齡、體重等改變?！爸委熡行Я俊笔侵赣糜谥委熜灾委煹挠行Я俊！邦A(yù)防有效量”是指用于預(yù)防性治療的有效量。

141、如本文所用的術(shù)語(yǔ)“施用”是指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何各種方法和遞送系統(tǒng)將藥劑物理導(dǎo)入受試者。示例性施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、脊柱或其他腸胃外施用途徑，例如通過注射或輸液。

142、如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”、“個(gè)體”、和“患者”是本領(lǐng)域中公知的，并且在本文中可互換使用，指需要治療的任何受試者，特別是哺乳動(dòng)物受試者。實(shí)例包括但不限于人和其它靈長(zhǎng)類，包括非人靈長(zhǎng)類，諸如黑猩猩及其它猿和猴物種。術(shù)語(yǔ)個(gè)體、受試者和患者本身不表示特定年齡、性別、人種等。

143、在本發(fā)明的方法的實(shí)施方案中，所述疾病或病癥為野生型sars-cov-2或sars-cov-2變異株，例如omicron變異株或delta變異株感染引起的疾病或病癥。

144、在第八方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的重組s蛋白、第二方面的mrna、第三方面的組合物、第五方面的重組質(zhì)粒、或第六方面的mrna-載體顆粒在制備用于在受試者中預(yù)防和/或治療與sars-cov-2感染相關(guān)的疾病或病癥的藥物中的用途。

145、在第九方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的重組s蛋白、第二方面的mrna、第三方面的組合物、第五方面的重組質(zhì)粒、或第六方面的mrna-載體顆粒，其用于預(yù)防和/或治療受試者中與sars-cov-2感染相關(guān)的疾病或病癥。

146、在本發(fā)明的用途的實(shí)施方案中，所述疾病或病癥為野生型sars-cov-2或sars-cov-2變異株，例如omicron變異株或delta變異株感染引起的疾病或病癥。