本發(fā)明涉及生物，具體涉及測序酶的高通量篩選體系和篩選方法。

背景技術(shù)：

1、fret是指在兩個不同的熒光基團(tuán)中，如果一個熒光基團(tuán)(供體donor)的發(fā)射光譜與另一個熒光基團(tuán)(受體acceptor)吸收光譜有一定的重疊,當(dāng)兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。fret發(fā)光原理如下圖1，激發(fā)供體熒光并當(dāng)熒光供體分子和熒光受體分子距離足夠靠近，即可發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)受體發(fā)光的現(xiàn)象，再通過熒光捕捉器，如酶標(biāo)儀，進(jìn)行熒光檢測：

2、fret發(fā)生條件：

3、1)能量匹配：供體分子的發(fā)射光譜可以被受體分子吸收并產(chǎn)生熒光信號。供體分子的發(fā)射光譜與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊(>30％)；

4、2)作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1～10nm；

5、3)fret效率公式：用于計算分子/基團(tuán)間作用距離r

6、

7、r0＝const·κ2·n-4·φd·jda

8、4)偶極-偶極作用：供體分子與受體分子作用時的向量必須滿足一定條件。

9、fret技術(shù)應(yīng)用范圍廣泛，從技術(shù)發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)有25年的歷史，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域及生物化學(xué)領(lǐng)域。通過fret技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息(作用距離、作用方向、能量傳遞效率)。常用于解決如下問題：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合體；轉(zhuǎn)錄機(jī)制；轉(zhuǎn)化途徑；分子運(yùn)動；蛋白折疊等生物學(xué)問題。

10、傳統(tǒng)的方法檢測單堿基摻入dna鏈的實(shí)驗(yàn)一般要通過電泳分析查看，耗時較長，通量較低，需要更高的時間和更大的成本；而且，電泳分析方法只能通過終點(diǎn)法來查看單堿基的摻入情況，無法實(shí)時檢測單堿基摻入的情況，因此通過電泳方法評估酶對單堿基摻入dna鏈的速度、效率以及催化活性或進(jìn)行高活性測序酶篩選時會耗時耗力。測序酶篩選技術(shù)的第一版，雖然也是使用能量共振轉(zhuǎn)移(fret)技術(shù)，但是由于操作流程繁雜，也沒有搭載自動工作站，因此無法進(jìn)行高通量篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于用于dna操作的酶的高通量篩選體系和篩選方法。

2、本發(fā)明提供了核苷酸類似物，其具有如下式(i)所示結(jié)構(gòu)：

3、

4、其中，

5、blocker為阻斷基團(tuán)；

6、p為三磷酸基團(tuán)；

7、x為含氮堿基，所述含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一種；

8、y為多肽；

9、r為-oh或-h；

10、優(yōu)選的，阻斷基團(tuán)blocker的結(jié)構(gòu)如下所示：

11、

12、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的核苷酸類似物具有如式(ii)所示結(jié)構(gòu)：

13、本發(fā)明所述的核苷酸類似物，其可包括脫氧核糖核苷酸類似物和/或核糖核苷酸類似物；所述脫氧核糖核苷酸類似物可摻入dna鏈，對dna鏈的合成和dna聚合酶發(fā)揮作用不產(chǎn)生干擾；所述核糖核苷酸類似物可摻入rna單鏈，對rna的合成和rna聚合酶活性不產(chǎn)生干擾。

14、本發(fā)明提供了測序酶篩選體系，其包括連接有第一檢測基團(tuán)的核苷酸類似物、連接有第二檢測基團(tuán)的模板dna和dna聚合酶。

15、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的測序酶篩選體系中，

16、所述模板dna的3’末端和/或5’末端連接有第二檢測基團(tuán)；

17、所述模板dna具有3’單鏈區(qū)或5’單鏈區(qū)中的至少一種和中部雙鏈區(qū)；

18、本發(fā)明的一些實(shí)施例中，

19、所述模板dna的3’末端連接有第二檢測基團(tuán)；

20、所述模板dna的5’末端連接有第二檢測基團(tuán)；

21、所述模板dna的3’末端和5’末端均連接有第二檢測基團(tuán)。

22、本發(fā)明中，所述模板dna可以具有3’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)，也可具有5’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)，也可以具有3’單鏈區(qū)、5’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)。

23、進(jìn)一步的，本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述模板dna具有3’單鏈區(qū)、5’單鏈區(qū)和中部雙鏈區(qū)。

24、本發(fā)明所述模板dna的3’單鏈區(qū)或5’單鏈區(qū)用于在dna聚合酶的作用下將核苷酸摻入dna鏈，隨后根據(jù)摻入速度評價聚合酶效率；所述3’單鏈區(qū)，5’單鏈區(qū)可同時存在，也可只存在一種，對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響；并且所述3’單鏈區(qū)和5’單鏈區(qū)的核苷酸序列組成對檢測結(jié)果也不產(chǎn)生影響；dna模板可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員需求進(jìn)行替換。

25、但本發(fā)明所述的模板dna設(shè)計適合本發(fā)明所述篩選體系，其合成簡單，篩選方便，用料節(jié)約。

26、本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述模板dna的3’單鏈區(qū)和5’單鏈區(qū)的核苷酸序列相反。

27、本發(fā)明中，所述模板dna也可以通過兩條3’端序列相同或不同，5’端序列反向互補(bǔ)的引物退火制成；所述5’端核苷酸的數(shù)目≥3’端核苷酸數(shù)目。

28、本發(fā)明中，所述第一檢測基團(tuán)發(fā)射光譜與第二檢測基團(tuán)的吸收光譜有重疊。

29、進(jìn)一步的，所述第一檢測基團(tuán)發(fā)射光譜與第二檢測基團(tuán)的吸收光譜具有≥30的重疊。

30、具體的，所述第一檢測基團(tuán)和第二檢測基團(tuán)可以包括如下所示中的任意一種組合：

31、第一檢測基團(tuán)為b-phycoerythrin；第二檢測基團(tuán)為cy5；或

32、第一檢測基團(tuán)為rhodamine?6g；第二檢測基團(tuán)為cy5；或

33、第一檢測基團(tuán)為gfp；第二檢測基團(tuán)為yfp；或

34、第一檢測基團(tuán)為cy3；第二檢測基團(tuán)為cy5；或

35、第一檢測基團(tuán)為fluorescein；第二檢測基團(tuán)為tetramethylrhodamine；或

36、第一檢測基團(tuán)為cfp；第二檢測基團(tuán)為gfp；或

37、第一檢測基團(tuán)為bfp；第二檢測基團(tuán)為dsrfp；或

38、第一檢測基團(tuán)為tryptophan；第二檢測基團(tuán)為dansyl。

39、更一步的，本發(fā)明中，

40、所述第一檢測基團(tuán)為cy3；

41、所述第二檢測基團(tuán)為cy5。

42、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括輔料和如下i)～ii)所示中的至少一種：

43、i)、本發(fā)明所述的核苷酸類似物；

44、ii)、本發(fā)明所述的測序酶篩選體系。

45、進(jìn)一步的，所述輔料為生物技術(shù)領(lǐng)域常用的固體或液體試劑或其組合；

46、更進(jìn)一步的，所述輔料包括裂解液、清洗液、純化試劑或緩沖液中的一種或兩種以上的組合。

47、本發(fā)明提供了測序酶的篩選方法，其包括：利用如本發(fā)明所述的核苷酸類似物和/或如本發(fā)明所述的測序酶篩選體系和/或如本發(fā)明所述的試劑盒對測序酶進(jìn)行篩選。

48、進(jìn)一步的，所述的篩選方法包括如下步驟：

49、將連接有第一檢測基團(tuán)的核苷酸類似物、核苷酸、連接有第二檢測基團(tuán)的模板dna、測序酶、緩沖液和水的混合物進(jìn)行反應(yīng)和檢測，根據(jù)檢測信號隨時間變化的活性曲線獲得單堿基的摻入速率后對所述dna聚合酶進(jìn)行篩選；

50、所述核苷酸包括與核苷酸類似物具有不同含氮堿基的核苷酸的混合物。

51、本發(fā)明所述的篩選方法中，

52、所述核苷酸類似物的濃度為0.25μm；

53、所述核苷酸的濃度為0.25μm；

54、所述連接有第二檢測基團(tuán)的模板dna的濃度為0.1μm；

55、所述測序酶的濃度為0.5mg/ml。

56、本發(fā)明所述的篩選方法中，

57、所述反應(yīng)的條件為溫度40℃反應(yīng)2h；

58、所述檢測的條件為：激發(fā)波長為530nm、發(fā)射波長為568nm和676nm；每1～3min檢測一次；

59、所述單堿基的摻入速率為所述活性曲線的斜率。

60、本發(fā)明所述的篩選方法也可以在正常dna鏈或rna鏈的情況下，通過普通pcr的預(yù)變性、退火、延伸的程序進(jìn)行。

61、本發(fā)明所述的測序酶經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)獲得，所述誘導(dǎo)表達(dá)的步驟可借助于自動化設(shè)備也可手動完成；本發(fā)明中所述的誘導(dǎo)表達(dá)借助于tecan自動工作站完成，在可達(dá)到后續(xù)檢測要求的前提下利用自動化儀器設(shè)備完成測序酶的小體積培養(yǎng)和快速生產(chǎn)，有利于縮短進(jìn)程、節(jié)約時間和成本。

62、本發(fā)明提供了如下i)～iv)所示中的至少一種在制備測序酶篩選產(chǎn)品、測序酶反應(yīng)動力學(xué)測試、評估沒得催化活性和/或評估酶對堿基摻入模板鏈的速度、效率中的應(yīng)用：

63、i)、本發(fā)明所述的核苷酸類似物；

64、ii)、本發(fā)明所述的測序酶篩選體系；

65、iii)、本發(fā)明所述的試劑盒；

66、iv)、本發(fā)明所述的篩選方法。

67、進(jìn)一步的，所述測序酶包括dna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、加尾酶或rna聚合酶中的至少一種。

68、本發(fā)明所述的篩選方法可對測序酶篩選產(chǎn)品的性能進(jìn)行評估。

69、本發(fā)明將熒光對cy3和cy5分別連接在dna模板鏈和datp上，構(gòu)建了dna聚合酶篩選體系，在借助于自動化平臺和酶標(biāo)儀的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了dna聚合酶對修飾單堿基摻入dna鏈的速度、效率以及催化活性的評估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的篩選體系和配套的篩選方法可實(shí)現(xiàn)dna聚合酶的高通量篩選，節(jié)約了篩選的時間，降低了篩選的成本，并且所述篩選體系和篩選方法可以應(yīng)用到其他相關(guān)項目中，具有廣泛的應(yīng)用前景。