本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)和作物育種，具體地，涉及一種創(chuàng)制籽粒低鎘積累的抗鎘水稻的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鎘(cadimium，cd)是一種在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的重金屬和環(huán)境污染物，由于工業(yè)廢水、廢氣等排放量不斷增加，含金屬的農(nóng)藥和化肥過量使用，導(dǎo)致農(nóng)田土壤鎘含量不斷上升。鎘在人體內(nèi)易積累不易排出，半衰期長，在腎臟內(nèi)的半衰期可達10～30年。長期食用鎘含量超標(biāo)的大米會危害人體健康，導(dǎo)致疾病，如肝病、腎臟損傷、骨骼變異和癌癥等。減少水稻籽粒的鎘積累，修復(fù)土壤鎘污染，對確保糧食安全和人類健康具有重要意義。

2、水稻容易受到鎘污染，這是因為cd2+被轉(zhuǎn)運必需金屬元素fe2+、zn2+、mn2+的金屬轉(zhuǎn)運蛋白(metal?transporters，mt)轉(zhuǎn)運調(diào)控，土壤中的鎘被金屬轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至根部細胞共質(zhì)體中，一部分被oshma3(heavy?metal-transporting?atpase3，oshma3)隔離在根部細胞的液泡中，另一部分被oshma2和osccx2轉(zhuǎn)運至木質(zhì)部中，經(jīng)過木質(zhì)部到韌皮部的轉(zhuǎn)運和韌皮部再轉(zhuǎn)運最終到達籽粒。水稻中主要表達在與穗部相連的彌漫維管束中低親和力陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(low-affinity?cation?transporter，oslct1)，參與了鎘從膨大的大維管束向與穗部相連的擴散維管束的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致籽粒中積累鎘。

3、近年來人們采取了各種水稻鎘污染防治措施，多數(shù)的修復(fù)水稻鎘污染的方法存在局限性，田間修復(fù)技術(shù)例如通過土壤改良，生物修復(fù)，超積累植物修復(fù)等，周期長、效率低。除了田間修復(fù)技術(shù)外，培育低鎘積累的水稻品種是減少食物鏈中鎘污染既能經(jīng)濟又有效的方法。多數(shù)研究利用crispr-cas9等技術(shù)敲除根部主效的鎘轉(zhuǎn)運基因nramp5，降低水稻對鎘的吸收。同樣的，操縱oshma2、oslct1的突變可以減少水稻中cd的木質(zhì)部的裝載和地下-地上部分的長距離運輸與分配，并且，進一步通過協(xié)同過表達oshma3可以促使cd在根細胞液泡中的區(qū)室化，從而降低籽粒中的cd的積累量。但是，上述的基因功能喪失也會伴隨著其他礦質(zhì)元素的內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到干擾，如：oshma2功能喪失會使籽粒中cd減少的同時，zn的含量也會減少。通過基因編輯的方法雖然會使水稻籽粒鎘含量下降，但也會使其他人體必需金屬元素損失，而且土壤鎘污染仍然存在。

4、為了適應(yīng)鎘污染的土壤環(huán)境，水稻已經(jīng)進化出了各種抵抗鎘毒害的策略，包括鎘在細胞壁的沉積、液泡隔離、螯合、外排等。液泡是水稻中隔離鎘的主要細胞器。同時液泡也是植物和酵母中的細胞自噬途徑轉(zhuǎn)運物質(zhì)的最終目的地。細胞自噬是將受損細胞器，變性或衰老的大分子物質(zhì)等包裹在自噬囊泡運輸?shù)揭号?植物和酵母)或溶酶體(哺乳動物)中降解或隔離。自噬途徑由一系列保守的自噬相關(guān)(autophagy-related，atg)基因所調(diào)控，其中atg8被視為自噬途徑的標(biāo)志性蛋白。自噬根據(jù)對降解底物的選擇性可以分為選擇性自噬與非選擇性自噬。選擇性自噬由銜接蛋白與atg8互作，將不同的待降解底物包裹進自噬囊泡中。這些銜接蛋白與atg8互作都是通過銜接蛋白上保守的aim(atg8-interactingmotif)基序介導(dǎo)。aim基序包含的核心序列為w/y/f-xx-l/i/v，其中第一位和第四位氨基酸為保守氨基酸，“x”可為任意一種氨基酸。該aim通過與atg8表面保守的疏水縫隙配合來促進與atg8的結(jié)合，將選擇性自噬底物包裹進囊泡。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷與不足，提供一種創(chuàng)制籽粒低鎘積累的抗鎘水稻的方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個目的是提供一種組合物。

3、本發(fā)明的第二個目的是提供上述的組合物在創(chuàng)制抗鎘水稻中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的第三個目的是提供一種創(chuàng)制抗鎘水稻的方法。

5、本發(fā)明的第四個目的是提供上述的方法獲得的抗鎘水稻在抗水稻鎘污染中的應(yīng)用。

6、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實現(xiàn)的：

7、本發(fā)明首先通過crispr-cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建水稻oshma3?oslct1雙重突變體和表達cd結(jié)合自噬銜接蛋白aim-spmtl-gfp的水稻oshma3?oslct1雙重突變體植株，然后利用鎘特異性染料檢測cd結(jié)合自噬銜接蛋白aim-spmtl是否能夠?qū)d富集于葉片的原生質(zhì)體液泡中，并檢測創(chuàng)制的表達cd結(jié)合自噬銜接蛋白aim-spmtl-gfp的水稻oshma3?oslct1雙重突變體對鎘的耐性。

8、因此，本發(fā)明要求保護以下內(nèi)容：

9、一種組合物，所述組合物包含特異性靶向oshma3基因的sgrna表達盒、特異性靶向oslct1基因的sgrna表達盒和表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因。

10、優(yōu)選地，所述特異性靶向oshma3基因的sgrna表達盒的核苷酸序列如seq?id?no:1～2所示，所述特異性靶向oslct1基因的sgrna表達盒的核苷酸序列如seq?id?no:3～4所示，所述表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

11、優(yōu)選地，所述表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因上游還含有綠色組織特異表達啟動子，即含有綠色組織特異表達啟動子的表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因。

12、更優(yōu)選地，所述綠色組織特異表達啟動子為gssp3，其核苷酸序列如seq?id?no:6所示，則所述含有綠色組織特異表達啟動子的表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:7所示。

13、上述的組合物在創(chuàng)制抗鎘水稻中的應(yīng)用，所述抗鎘水稻的籽粒低鎘積累。

14、一種創(chuàng)制抗鎘水稻的方法，所述方法為將組合物克隆到載體中，構(gòu)建得到重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化野生型水稻，對獲得的轉(zhuǎn)化苗進行鑒定即得。

15、優(yōu)選地，所述重組載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：

16、s1.將所述特異性靶向oshma3基因的sgrna表達盒和特異性靶向oslct1基因的sgrna表達盒組裝到載體中，構(gòu)建得到雙基因編輯載體；

17、s2.使用限制性內(nèi)切酶酶切步驟s1得到的雙基因編輯載體，得到線性化的雙基因編輯載體；

18、s3.將所述表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因克隆到步驟s2得到的線性化的雙基因編輯載體，即得重組載體。

19、優(yōu)選地，所述載體為雙元載體pylcrispr/cas9pubi-h，其核苷酸序列見ncbi(txid1648237)。

20、優(yōu)選地，步驟s1所述組裝時使用的限制性內(nèi)切酶為bsaⅰ，所得到的雙基因編輯載體即為在pylcrispr/cas9pubi-h的bsaⅰ位點插入核苷酸序列如seq?id?no:8所示的片段。

21、優(yōu)選地，步驟s2所述的限制性內(nèi)切酶為pmei，步驟s3所得到的重組載體即為在步驟s2所得的線性化的雙基因編輯載體的pmei位點插入核苷酸序列如seq?id?no:9所示的片段。

22、優(yōu)選地，步驟s3所述的表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因上游還含有綠色組織特異表達啟動子，即含有綠色組織特異表達啟動子的表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因。

23、更優(yōu)選地，所述綠色組織特異表達啟動子為gssp3，其核苷酸序列如seq?id?no:6所示，則所述含有綠色組織特異表達啟動子的表達自噬相關(guān)的銜接蛋白的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:7所示。

24、優(yōu)選地，所述鑒定為以轉(zhuǎn)化苗的dna為模板，設(shè)計引物進行pcr擴增、測序，確認轉(zhuǎn)化苗成功構(gòu)建。

25、更優(yōu)選地，所述鑒定方法為以轉(zhuǎn)化苗的dna為模板，利用核苷酸序列如seq?id?no:24～25所示的引物擴增得到帶oshma3?t1和t2靶點的片段，利用核苷酸序列如seq?id?no:26～27所示的引物擴增得到帶oslct1?t1和t2靶點的片段，將擴增的帶oshma3?t1和t2靶點的片段和帶oslct1?t1和t2靶點的片段直接送測序，確定oshma3和oslct1雙重位點成功突變；再使用核苷酸序列如seq?id?no:36～37所示的引物擴增aim-spmtl片段，若能擴增得到aim-spmtl片段，則表明表達cd結(jié)合自噬銜接蛋白aim-spmtl-gfp的水稻oshma3?oslct1雙重突變體成功構(gòu)建。

26、任一上述的方法獲得的抗鎘水稻在抗水稻鎘污染中的應(yīng)用。

27、優(yōu)選地，所述抗水稻鎘污染為抗水稻籽粒鎘積累和/或修復(fù)鎘污染水稻田。

28、本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益效果：

29、本發(fā)明通過crispr-cas9構(gòu)建表達cd結(jié)合自噬銜接蛋白aim-spmtl-gfp的水稻oshma3?oslct1雙重突變體，不僅減少cd從木質(zhì)部向韌皮部的轉(zhuǎn)運和在根部液泡的積累，同時cd結(jié)合自噬銜接蛋白aim-spmtl-gfp還能將鎘積累在葉片的原生質(zhì)體液泡中，在不影響水稻籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)的情況下，減少籽粒的cd積累和將cd富集至非食用部位秸稈中以方便工業(yè)化處理。本發(fā)明所提供的籽粒低鎘積累的抗鎘水稻能夠減少食物鏈中的鎘污染，從而降低鎘對人體的危害。