本發(fā)明涉及一種多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合和其在包含mir-210-3p、mir-126-3p、mir-205-5p和mir-486-5p的多種靶mirna的多重檢測/定量中的應用。

背景技術(shù)：

1、本文提供的背景描述是為了總體上呈現(xiàn)本發(fā)明的上下文。本發(fā)明的背景技術(shù)部分中討論的主題不應僅僅由于在本發(fā)明的背景技術(shù)部分中對主題的提及而被假設為現(xiàn)有技術(shù)。類似地，在本發(fā)明的背景技術(shù)部分中提及的或與本發(fā)明的背景技術(shù)部分的主題相關(guān)聯(lián)的問題不應假設為先前已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中被識別。本發(fā)明的背景技術(shù)部分中的主題僅代表不同的方法，所述方法本身也可以是發(fā)明。

2、微小rna或mirna是一種廣泛存在于生物體中的非編碼rna，并且通常其長度為18-25個核苷酸。根據(jù)mirbase(22版本)，人類基因組編碼大約2,600個成熟的mirna。相關(guān)研究表明這些mirna參與許多生物學過程和其調(diào)控，如細胞凋亡、增殖、器官發(fā)生、發(fā)育、腫瘤發(fā)生和造血。同時，mirna還調(diào)控轉(zhuǎn)錄后階段的基因表達，并且因此在調(diào)控多種生命過程，如疾病的發(fā)生和發(fā)展以及細胞衰老中起重要作用。一些研究表明，mirna具有用作疾病臨床診斷工具的潛力。

3、直到1993年，lee等人使用定位克隆從秀麗隱桿線蟲(caenorhabditis?elegans)克隆了lin-4，才發(fā)現(xiàn)了第一個mirna。發(fā)現(xiàn)lin-4基因編碼長度為大約22個核苷酸的mirna。后來，在2000年，reinhart等人發(fā)現(xiàn)了let-7，其是已知的第二個調(diào)節(jié)蠕蟲時間發(fā)育的基因，并且是也被轉(zhuǎn)錄成21個核苷酸的mirna的負調(diào)控因子。從那時起，人們逐漸意識到mirna是在疾病發(fā)展和生物進化中發(fā)揮著調(diào)控作用的進化上保守的重要分子。

4、盡管mirna有潛力被用作疾病的診斷工具和其重要的調(diào)控作用，但它們的準確量化極其困難。實時熒光定量pcr(qpcr)檢測被認為是定量檢測的黃金標準，但在研究的早期并不適用于mirna的定量。這是由于mirna具有非常短的序列、在細胞中的低表達水平和高度同源的序列引起的。rna印跡雜交和基因芯片是早期用于研究mirna表達的主要方法，但這些方法在樣品要求、線性范圍和靈敏度方面存在局限性。

5、直到2005，chen等人首次使用莖環(huán)方法實施了單個mirna的實時熒光qpcr檢測(c.chen等人(2005)通過莖環(huán)rt-pcr對微小rna進行實時定量(real-time?quantificationof?micrornas?by?stem-loop?rt-pcr),《核酸研究(nucleic?acids?res.)》,33,e179)。檢測過程包含兩個主要步驟：逆轉(zhuǎn)錄和實時pcr。在第一步驟中，將莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物與mirna分子混合，并使用multiscribetm逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。然后使用常規(guī)taqman?pcr對所得產(chǎn)物進行定量分析。所使用的莖環(huán)引物具有與mirna的3'端的6個堿基的互補序列，以啟動逆轉(zhuǎn)錄反應。在實驗中，觀察到與傳統(tǒng)的線性引物相比，莖環(huán)引物具有更好的特異性和靈敏度。核苷酸堿基堆疊可以有效地提高熱穩(wěn)定性，并且莖環(huán)序列的空間結(jié)構(gòu)可以有助于其與基因組中的雙鏈dna分子結(jié)合。還提出，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物具有用于多種逆轉(zhuǎn)錄反應的潛力，并且可以具有更好的效率和特異性。

6、為了同時檢測/量化小樣品中的多種mirna，tang等人(2006)進一步改進了上述方法，以實現(xiàn)在單個胚胎干細胞中同時檢測220種mirna的表達(tang等人(2006)單個全胚胎干細胞的微小rna表達譜(microrna?expression?profiling?of?single?whole?embryonicstem?cells),《核酸研究》24e9)。所述方法主要涉及在循環(huán)脈沖溫度下對單個胚胎干細胞中的所有mirna進行逆轉(zhuǎn)錄，然后進行預pcr以提高所得產(chǎn)物的檢測靈敏度，并且然后將每個mirna表達的實時熒光定量分離。lao等人(2006)驗證了tang的方法，并且認為隨著檢測次數(shù)的增加，引物之間的相互反應也將會增加。使用上述方法在單一和多種檢測條件下獲得的特定mirna的ct值之間的差異是可觀察到的。因此，通過該方法獲得的結(jié)果仍需在單一檢測條件下進行驗證。lao等人還認為，引物之間的這種相互作用需要深入分析和研究才能減少，并且這項研究需要測試大量的引物組合。在已知的326種人類mirna中，這項工作對任何實驗室來說都是昂貴和困難的。目前，在研究疾病與多種mirna的表達水平之間的關(guān)系時，只有chen等人的單一定量檢測方法用于單獨地熒光定量檢測mirna的表達水平。

7、隨著檢測次數(shù)的增加，引物之間的相互作用逐漸增加，并且其難度不僅呈指數(shù)級增加，而且成倍增加?？紤]到如探針引物之間的交叉反應、系統(tǒng)之間的特異性、靈敏度和效率等問題，使用單一原理實現(xiàn)多重實時熒光qpcr檢測幾乎是不可能的。目前的技術(shù)仍然無法使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物方法來實現(xiàn)對多種mirna的穩(wěn)定、標準化和準確的多重定量檢測。這些缺點也阻礙了其進入臨床領(lǐng)域。

8、因此，仍然迫切需要一種使得能夠在逆轉(zhuǎn)錄-熒光qpcr(rt-qpcr)過程中同時量化多種靶mirna的組合的多重檢測方法和多重莖環(huán)引物組合。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于上述內(nèi)容，本發(fā)明公開了一種使得能夠在多重rt-qpcr過程中同時量化多種靶mirna的組合的多重莖環(huán)引物組合。

2、在本發(fā)明的一方面，一種用于同時量化hsa-mir-210-3p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-205-5p和hsa-mir-486-5p的多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合，所述多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合包括：第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，所述第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.33的核酸序列；第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，所述第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.34的核酸序列；第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，所述第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.35的核酸序列；以及第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，所述第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.36的核酸序列。

3、在本發(fā)明的另一方面，一種用于同時量化多種靶mirna的多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合，所述多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合包括多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物；其中所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中的每種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物具有形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖環(huán)序列和與所述多種靶mirna之一的獨特的3'序列互補的錨定序列，其中所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的所述莖環(huán)序列是相同的。

4、在一個實施例中，所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中的每種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的長度為約40-65nt。

5、在一個實施例中，所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中的每種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的所述錨定序列的長度為約3-12nt。

6、在一個實施例中，所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括具有第一莖環(huán)序列和第一錨定序列的第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物；以及具有第二莖環(huán)序列和第二錨定序列的第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述第一莖環(huán)序列和所述第二莖環(huán)序列中的每個莖環(huán)序列包括seq?id?no.37的核酸序列；并且其中所述第一錨定序列和所述第二錨定序列中的每個錨定序列的長度選自4nt、6nt、8nt和11nt之一。

7、在一個實施例中，所述第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的所述第一錨定序列與所述多種靶mirna中的第一靶mirna的獨特的3'序列互補，并且所述第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的所述第二錨定序列與所述多種靶mirna中的第二靶mirna的獨特的3'序列互補。

8、在一個實施例中，所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物進一步包括具有第三莖環(huán)序列和第三錨定序列的第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述第三莖環(huán)序列包括seq?id?no.37的核酸序列；其中所述第三錨定序列的長度選自4nt、6nt、8nt和11nt之一；并且其中所述第三錨定序列與所述多種靶mirna中的第三靶mirna的獨特的3'序列互補。

9、在一個實施例中，所述多種莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物進一步包括具有第四莖環(huán)序列和第四錨定序列的第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述第四莖環(huán)序列包括seq?id?no.37的核酸序列；其中所述第四錨定序列的長度選自4nt、6nt、8nt和11nt之一；并且其中所述第四錨定序列與所述多種靶mirna中的第四靶mirna的獨特的3'序列互補。

10、在一個實施例中，所述多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合具有多特異性，使得所述第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物有效地且僅逆轉(zhuǎn)錄所述第一靶mirna，所述第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物有效地且僅逆轉(zhuǎn)錄所述第二靶mirna，所述第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物有效地且僅逆轉(zhuǎn)錄所述第三靶mirna，并且所述第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物有效地且僅逆轉(zhuǎn)錄所述第四靶mirna。

11、在一個實施例中，所述第一靶mirna、所述第二靶mirna、所述第三靶mirna和所述第四靶mirna中的每種靶mirna選自由hsa-mir-210-3p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-205-5p和hsa-mir-486-5p組成的組，其中所述第一靶mirna、所述第二靶mirna、所述第三靶mirna和所述第四靶mirna中的每種靶mirna彼此不同。

12、在一個實施例中，所述第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.33的核酸序列，所述第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.34的核酸序列，所述第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?idno.35的核酸序列，并且所述第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物包括seq?id?no.36的核酸序列。

13、在本發(fā)明的另一方面，一種用于同時量化多種靶mirna的表達水平的試劑盒，所述試劑盒包括：第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物具有第一莖環(huán)序列和第一錨定序列，并且所述第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物具有第二莖環(huán)序列和第二錨定序列，其中所述第一莖環(huán)序列和所述第二莖環(huán)序列中的每個莖環(huán)序列包括seq?idno.37的核酸序列，其中所述第一錨定序列和所述第二錨定序列中的每個錨定序列的長度選自4nt、6nt、8nt和11nt之一；第一正向引物和第二正向引物，其中所述第一正向引物和所述第二正向引物中的每種正向引物包括選自由seq?id?no.42-45組成的組的核酸序列，并且所述第一正向引物不同于所述第二正向引物；通用反向引物，所述通用反向引物包括seqid?no.50的核酸序列；第一探針和第二探針，其中所述第一探針包括第一探針序列、第一熒光報告基團和第一猝滅基團，并且所述第二探針包括第二探針序列、第二熒光報告基團和第二猝滅基團，其中所述第一探針序列和所述第二探針序列中的每個探針序列包括選自由seq?id?no.46-49組成的組的核酸序列。

14、在一個實施例中，所述第一熒光報告基團和所述第二熒光報告基團中的每個熒光報告基團選自由vic、cy5、rox和fam組成的組；并且所述第一熒光報告基團不同于所述第二熒光報告基團。

15、在一個實施例中，所述第一錨定序列與所述多種靶mirna中的第一靶mirna的3'序列互補，并且所述第二錨定序列與所述多種靶mirna中的第二靶mirna的獨特的3'序列互補。

16、在一個實施例中，所述試劑盒進一步包括：第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物具有第三莖環(huán)序列和第三錨定序列，其中所述第三莖環(huán)序列包括seqidno.37的核酸序列，并且其中所述第三錨定序列的長度選自4nt、6nt、8nt和11nt之一；第三正向引物，其中所述第三正向引物包括選自由seq?id?no.42-45組成的組的核酸序列，并且所述第三正向引物不同于所述第一正向引物和所述第二正向引物；以及第三探針，其中所述第三探針包括第三探針序列、第三熒光報告基團和第三猝滅基團，其中所述第三探針序列包括選自由seq?id?no.46-49組成的組的核酸序列。

17、在一個實施例中，所述第三熒光報告基團選自由vic、cy5、rox和fam組成的組；并且所述第三熒光報告基團不同于所述第一熒光報告基團和所述第二熒光報告基團。

18、在一個實施例中，所述試劑盒進一步包括：第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物具有第四莖環(huán)序列和第四錨定序列，其中所述第四莖環(huán)序列包括seqidno.37的核酸序列，其中所述第四錨定序列的長度選自4nt、6nt、8nt和11nt之一；第四正向引物，其中所述第四正向引物包括選自由seq?id?no.42-45組成的組的核酸序列，并且所述第四正向引物不同于所述第一正向引物、所述第二正向引物和所述第三正向引物；第四探針，其中所述第四探針包括第四探針序列、第四熒光報告基團和第四猝滅基團，其中所述第四探針序列包括選自由seq?id?no.46-49組成的組的核酸序列。

19、在一個實施例中，所述第四熒光報告基團選自由vic、cy5、rox和fam組成的組；并且所述第四熒光報告基團不同于所述第一熒光報告基團、所述第二熒光報告基團和所述第三熒光報告基團。

20、在本發(fā)明的另一方面，一種用于同時量化多種靶mirna的表達水平的試劑盒，所述試劑盒包括：多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合，所述多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合具有包括seq?id?no.33的核酸序列的第一莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、包括seq?id?no.34的核酸序列的第二莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、包括seq?id?no.35的核酸序列的第三莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和包括seq?id?no.36的核酸序列的第四莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物；正向引物組合，所述正向引物組合具有包括seq?id?no.42的核酸序列的第一正向引物、包括seq?id?no.43的核酸序列的第二正向引物、包括seq?id?no.44的核酸序列的第三正向引物和包括seq?id?no.45的核酸序列的第四正向引物；通用反向引物，所述通用反向引物包括seq?id?no.50的核酸序列；探針組合，所述探針組合具有包括seqid?no.46的核酸序列和vic的第一熒光報告基團的第一探針、包括seq?id?no.47的核酸序列和rox的第二熒光報告基團的第二探針、包括seq?id?no.48的核酸序列和cy5的第三熒光報告基團的第三探針、包括seq?id?no.49的核酸序列和fam的第四熒光報告基團的第四探針。

21、在本發(fā)明的另一方面，一種同時量化hsa-mir-210-3p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-205-5p和hsa-mir-486-5p的方法，所述方法包括使用以上呈現(xiàn)的多重逆轉(zhuǎn)錄引物組合執(zhí)行多重rt-qpcr。

22、在本發(fā)明的另一方面，一種用于使用hsa-mir-210-3p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-205-5p和hsa-mir-486-5p的定量結(jié)果來確定活受試者的醫(yī)學狀況的方法，所述方法包括：使用根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒執(zhí)行多重rt-qpcr；從所述多重rt-qpcr獲得hsa-mir-210-3p、hsa-mir-126-3p、hsa-mir-205-5p和hsa-mir-486-5p的定量結(jié)果；以及使用所述定量結(jié)果來確定所述活受試者的醫(yī)學狀況，其中所述活受試者的所述醫(yī)學狀況是肺癌。