本發(fā)明總體上涉及酶促肽或蛋白質(zhì)連接。具體地，本發(fā)明提供了一種改進的酶促肽或蛋白質(zhì)連接方法，其包括將肽基天冬酰胺基連接酶(pal)催化的連接與谷氨酰胺環(huán)化酶(qc)催化的焦谷氨酰形成偶聯(lián)，以提高連接產(chǎn)物的產(chǎn)率。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、位點特異性蛋白連接有助于蛋白功能研究，并促進蛋白療法的發(fā)展(spicer,c.d.和davis,b.g.,《nat.commun.》5:4740(2014)；hoyt,e.a.等,《nat.rev.chem.》3,147–171(2019)；zhang,g.等,《chem.soc.rev.》44,3405-3717(2015)；sletten,e.m.和bertozzi,c.r.,《angew.chem.int.ed.》48,6974-6998(2009)；rosen,c.b.和francis,m.b.,《nat.chem.biol.》13,697-705(2017))。除了成熟的化學(xué)連接方法外，近年來，肽連接酶在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用變得越來越多(zhang,y.等,《chem.soc.rev.》47,9106-9136(2018)；lotze,j.等,《mol?biosyst.》12,1731–1745(2016)；weeks,a.m.和wells,j.a.,《chem.rev.》120,3127-3160(2020)；pishesha,n.l.等,《annu.rev.cell?dev.biol.》34,163–88(2018))。例如，一種流行的肽連接酶是分選酶a(sortase?a)，其能識別分選序列l(wèi)pxtg，并在蘇氨酸(thr)后進行連接(pishesha,n.l.等,《annu.rev.cell?dev.biol.》34,163–88(2018))。然而，分選酶a的催化效率較低，需要化學(xué)計量量的酶才能進行可行的連接反應(yīng)。相比之下，最近發(fā)現(xiàn)的以丁酸酶-1(butelase-1)為代表的肽基天冬酰胺基連接酶(pal)，(nguyen,g.k.t.等,《nat?chem?biol.》10,732–738(2014))的催化效率為分選酶a的104倍(nguyen,g.k.t.等,《nat.protoc.》11,1977–1988(2016)；tam,j.p.等,《sciencechina?chemistry》63,296–307(2020))。此外，pal需要一個最小的天冬酰胺基三肽識別基序asn-p1′-p2′，用于天冬酰胺(asn)后的連接，其中，p1′可耐受廣泛的氨基酸殘基，p2’通常是一個大的疏水性殘基(nguyen,g.k.t.等,《nat.protoc.》11,1977–1988(2016)；tam,j.p.等,《science?china?chemistry》63,296–307(2020))。作為天冬酰胺基內(nèi)肽酶(aep)家族的成員，pal利用催化的半胱氨酰硫醇切割酰基供體底物中的asn-p1′肽鍵，然后得到的天冬酰胺酰硫酯中間體被?；荏w底物的胺親核試劑分解。因此，連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)肽反應(yīng)形成。例如丁烯酶-1(butelase-1)，vypal2和oaaep1b-c247a為另外兩種具有極好轉(zhuǎn)肽酶活性的pal(hemua,x.等,《proc.natl.acad.sci.》116,11737-11746(2019)；harris,k.s.等,《nat.commun.》6,10199(2015)；yang,r.等,《j.am.chem.soc.》2017,139,5351-5358(2017))。然而，由于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)是可逆的，因此需要過量的親核試劑才能進行高產(chǎn)率的分子間連接反應(yīng)。

2、已經(jīng)開發(fā)了幾種方法，將pal介導(dǎo)的連接平衡轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物側(cè)(nguyen,g.k.t.等,《angew.chem.int.ed.》54,15694-15698(2015)；cao,y.等,《bioconj.chem.》27,2592-2596(2016)；rehm,f.b.h.等,《j.am.chem.soc.》141(43),17388-17393(2019)；tang,t.m.s.等,《chem.sci.11》,5881-5888(2020)；rehm,f.b.h.等,《angew.chem.int.ed.》60,4004-4008(2021))。首次開發(fā)了硫縮肽(thiodepsipeptide)方法，該方法利用天冬酰胺酰硫酯肽作為酰基供體底物(肽-asn-thioglc-xaa)，從而使連接反應(yīng)不可逆(nguyen,g.k.t.等,《angew.chem.int.ed.》54,15694-15698(2015)；cao,y.等,《bioconj.chem.》27,2592-2596(2016))。然而，該方法的局限性是需要準(zhǔn)備硫酯底物。在rehm等人開發(fā)的第二種方法中，使用甘氨酸基纈氨酸?；荏w底物，與含有ngl的?；w進行連接，因為所得的asn-gly-val(ngv)基序比asn-gly-leu(ngl)對oaaep-c247a更穩(wěn)定，這降低了產(chǎn)物水解和連接反應(yīng)的可逆性。然而，ngv只比ngl相對更穩(wěn)定。作為較差的受體底物，gv肽的用量必須遠(yuǎn)超?；荏w(>20倍)。未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)連接。在tang等人開發(fā)的另一種方法中，使用asn-cys-leu作為oaaep1-c247a的p1-p1′-p2′三肽基序(tang,t.m.s.等,《chem.sci.》11,5881-5888(2020))。用醛化合物2-甲?；脚鹚?fpba)淬滅cys-leu離去基團的n-末端半胱氨酸降低了連接反應(yīng)的可逆性。然而，fpba顯著減緩了連接反應(yīng)，可能是因為醛可與胺底物和/或酶形成亞胺。最后，由rehm等人報道的方法使用ni2+螯合glh三肽的離去基團，以掩蓋其n-末端胺的親核性(rehm,f.b.h.等,《angew.chem.int.ed.》60,4004-4008(2021))。該方法極大提高了與小合成肽的蛋白質(zhì)n端和c端標(biāo)記反應(yīng)的產(chǎn)率。然而，對于蛋白質(zhì)到蛋白質(zhì)的連接，只觀察到適度的產(chǎn)率的增加—一種情況下從24％增加至36％，另一種情況從28％增加至39％(rehm,f.b.h.等，《angew.chem.int.ed.》60,4004-4008(2021))。因此，目前所有已知方法都有一定的局限性，特別是在涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)連接時。

3、因此，有必要提供改進的蛋白質(zhì)連接方法，以克服或至少改善上述一個或多個缺點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及一種酶促肽連接的方法，其中pal介導(dǎo)的分子間連接與谷氨酰胺環(huán)化酶(qc)催化的焦谷氨酰形成偶聯(lián)，以顯著提高連接產(chǎn)物的產(chǎn)率。

2、在一個方面，提供了一種酶促肽連接的方法，所述方法包括提供

3、i)肽基天冬酰胺基連接酶(pal)和谷氨酰胺環(huán)化酶(qc)；

4、ii)具有p1-p1′-p2′三肽pal基序作為?；w的第一肽或蛋白質(zhì)，其中

5、p1是asn或asp，p1′是gln或glu，p2′是疏水性氨基酸或β-支鏈氨基酸；

6、iii)第二肽或蛋白質(zhì)與第一肽或蛋白質(zhì)相同或不相同，在n-末端具有p1″-p2″基序作為酰基受體，其中p1″是任意氨基酸，p2″是疏水性氨基酸

7、或β-支鏈氨基酸；

8、iv)使所述肽基天冬酰胺基連接酶(pal)和谷氨酰胺環(huán)化酶(qc)與第一和第二肽/蛋白質(zhì)接觸；

9、其中，pal切割三肽pal基序中p1之后的第一肽/蛋白質(zhì)，并將所述第一肽/蛋白質(zhì)連接到第二肽/蛋白質(zhì)的p1″-p2″基序上，qc將釋放的p1′-p2′二肽基序中的p1′環(huán)化為焦谷氨酰(pglu)。

10、應(yīng)當(dāng)理解，肽通常比蛋白質(zhì)短，包含氨基酸，并且都適合根據(jù)本發(fā)明進行連接。

11、在一些實施方案中，p2′選自下組：leu、met、phe、tyr、trp、val、ile、和thr。

12、在一些實施方案中，p2″選自下組：leu、phe、tyr、trp、val、ile、和thr。

13、在一些實施方案中，pal選自下組：包含如seq?id?no:1所示的氨基酸序列的丁酸酶1(butelase1)、包含如seq?id?no:2或seq?id?no:3所示的氨基酸序列的丁酸酶-2(butelase-2)、包含如seq?id?no:4所示的氨基酸序列的vypal2、，包含如seq?id?no:5所示的氨基酸序列的vypal3、包含如seq?id?no:6所示的氨基酸序列的oaaep1b-c247a、包含如seq?id?no:7所示的氨基酸序列的heaep3、包含如seq?id?no:8所示的氨基酸序列的atlegγ、包含如seq?id?no:9所示的氨基酸序列的vupal1、包含如seq?id?no:10所示的氨基酸序列的hapal1和包含如seq?id?no:11所示的氨基酸序列的oaaep1b。

14、在一些實施方案中，qc選自下組：包含如seq?id?no:12所示的氨基酸序列的人谷氨酰胺環(huán)化酶、包含如seq?id?no:13所示的氨基酸序列的小鼠谷氨酰胺環(huán)化酶、包含如seqid?no:14所示的氨基酸序列的果蠅谷氨酰胺環(huán)化酶、包含如seq?id?no:15所示的氨基酸序列的擬南芥谷氨酰胺環(huán)化酶、包含如seq?id?no:16所示的氨基酸序列的芋螺(conus)谷氨酰胺環(huán)化酶、包含如seq?id?no:17所示的氨基酸序列的侏儒響尾蛇(sistrurus)氨酰胺環(huán)化酶和包含如seq?id?no:18所示的氨基酸序列的細(xì)菌谷氨酰胺環(huán)化酶。

15、在一些實施方案中，第二肽或蛋白質(zhì)還包括p1″-p2″酰基受體和所述第二肽/蛋白質(zhì)之間的至少一個氨基酸的間隔物。

16、在一些實施方案中，qc：pal：第一肽或蛋白質(zhì)的比率分別在0.1:1:1000至1:1:50的范圍內(nèi)，較佳地，分別在0.1:1:1000至0.1:1:50的范圍內(nèi)。

17、在一些實施方案中，所述第一和第二肽或蛋白質(zhì)相同，并在連接時形成二聚體。

18、在一些實施方案中，所述第一和第二肽或蛋白質(zhì)的其中一個是表位結(jié)合肽或蛋白質(zhì)，另一個肽或蛋白質(zhì)包含有效載荷。

19、在一些實施方案中，所述有效載荷還包括有效載荷-釋放連桿。

20、在一些實施方案中，所述表位結(jié)合肽或蛋白質(zhì)選自下組：抗體或其功能片段、親和體如zegfr或zegfr-fc和darpin。

21、在一些實施方案中，所述抗體或其功能片段選自下組：小型抗體、雙抗體、scfv、納米抗體和f(ab′)2。

22、在一些實施方案中，所述有效載荷為成像劑或治療劑。

23、在一些實施方案中，所述成像劑為放射性標(biāo)記螯合劑或光學(xué)標(biāo)記。

24、在一些實施方案中，所述放射性標(biāo)記螯合劑選自下組：1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸(nota)，1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)和1,4,7-三氮雜環(huán)-1-戊二酸-4,7-二乙酸(nodaga)；和/或所述光學(xué)標(biāo)記為hrp或gfp或類似物。

25、在一些實施方案中，所述治療劑為單甲基奧瑞他汀e(monomethyl?auristatin?e,mmae)或放射性標(biāo)記的dota。

26、有利地，本公開的方法允許以更高的效率進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-肽和肽-肽連接，并且即使在兩個連接伴侶摩爾比相等的情況下，也能獲得接近定量的產(chǎn)率。通過以下詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地得出本發(fā)明的這些優(yōu)點和其他優(yōu)點。

27、附圖簡述