本技術(shù)涉及使用培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)的無(wú)血清培養(yǎng)基在高生產(chǎn)力細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，以及用于測(cè)量和維持細(xì)胞培養(yǎng)條件、收集和純化具有降低的異質(zhì)性和改進(jìn)的質(zhì)量并且具有較高產(chǎn)率的蛋白質(zhì)的改進(jìn)系統(tǒng)和方法。

背景技術(shù)：

1、治療蛋白質(zhì)產(chǎn)物的制造工藝應(yīng)根據(jù)各種因素優(yōu)化，包括(但不限于)蛋白質(zhì)生產(chǎn)條件、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性以及所需最終藥品產(chǎn)物。即使在針對(duì)相同最終藥品產(chǎn)物使用相同治療蛋白質(zhì)時(shí)，可能還需要改變蛋白質(zhì)生產(chǎn)條件以使產(chǎn)物的滴度、批量、產(chǎn)率或質(zhì)量?jī)?yōu)化。反過來(lái)，增加并且優(yōu)化的滴度、批量和產(chǎn)率又需要優(yōu)化收集和純化過程以處理增加的滴度和裝載，同時(shí)維持可接受質(zhì)量屬性。

2、為了支持對(duì)重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)藥品產(chǎn)物增長(zhǎng)的需求，已開發(fā)出能夠產(chǎn)生較高滴度和改進(jìn)的質(zhì)量(包括降低的異質(zhì)性和減少的序列變異體)同時(shí)改進(jìn)總產(chǎn)率的細(xì)胞生產(chǎn)方法。因此，需要改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)基以滿足這些需求和特化細(xì)胞條件。

3、另外，測(cè)量和維持優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)條件是很關(guān)鍵的，并且需要專門設(shè)計(jì)的設(shè)備，包括用于測(cè)量溶解氣體(如氧氣)的探針和傳感器。然而，大規(guī)模容器和生物反應(yīng)器的使用可影響用于測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)條件的設(shè)備，包括其精確度和維護(hù)要求。由于生物醫(yī)藥行業(yè)受到嚴(yán)格監(jiān)管，因此測(cè)量值的不規(guī)則性可能需要調(diào)查，從而潛在地需要額外資源并使得制造過程延遲。因此，需要提供改進(jìn)的精確度并減少維護(hù)要求的用于測(cè)量大規(guī)模生物反應(yīng)器中的溶解氣體的改進(jìn)的系統(tǒng)和方法。

4、在生產(chǎn)之后，分離高度濃縮的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出額外的挑戰(zhàn)，包括有限的處理容積、過濾能力、色譜柱裝載容量和可能較高的原料藥粘度，其中的每一種都可能影響結(jié)果，如材料使用、所花費(fèi)時(shí)間、產(chǎn)物質(zhì)量、批料純度和批料產(chǎn)率。因此，還已開發(fā)出用于收集、純化和調(diào)配高滴度治療蛋白質(zhì)的新方法以在示例性收集和純化過程的每個(gè)單元操作時(shí)應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。

5、為了能夠處理更高滴度藥品產(chǎn)物，已開發(fā)出用于制造、收集和純化高滴度抗體藥品產(chǎn)物的改進(jìn)方法和系統(tǒng)。舉例來(lái)說(shuō)，增加的藥品產(chǎn)物滴度和藥物裝載可超過某些色譜純化過程的容量并改變粘度，其不利地影響藥品產(chǎn)物沿不同色譜步驟的轉(zhuǎn)移。因此，需要不僅解決個(gè)別純化步驟而且解決整個(gè)制造過程的改進(jìn)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開部分提供一種在高生產(chǎn)力細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)抗il4rα抗體的改進(jìn)方法。已開發(fā)出用于維持最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件的經(jīng)改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)基和方法以增加滴度并改進(jìn)質(zhì)量。還已開發(fā)出用以收集和純化增加的蛋白質(zhì)裝載，同時(shí)增加總產(chǎn)率、降低制造和操作復(fù)雜度并改進(jìn)原料藥和所調(diào)配藥品產(chǎn)物的整體質(zhì)量的改進(jìn)方法。

2、在一些實(shí)施方式中，抗il-4rα抗體為度普利尤單抗(dupilumab)。在一個(gè)方面中，抗il-4rα抗體包含有包含seq?id?no:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(hcvr)和包含seq?idno:2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(lcvr)。在一個(gè)方面中，抗il-4rα抗體包含有包含seq?idno:3、4和5的三個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(hcdr)序列和包含seq?id?no:6、7和8的三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(lcdr)序列。

3、在一些實(shí)施方式中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)為抗原結(jié)合蛋白、阻斷抗體或受體拮抗劑(例如白介素-4受體α(il-4rα))。在一些方面中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)為具有fc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。因此，在一些方面中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)為抗體，如人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體片段(如fab或f(ab')2)、scfv分子等。

4、在一些實(shí)施方式中，制造工藝包括在包含化學(xué)成分確定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如定制制劑或市售基礎(chǔ)培養(yǎng)基)的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠表達(dá)如上文所描述的抗il4rα抗體或受體拮抗劑的細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，完全培養(yǎng)基不含血清(“無(wú)血清”培養(yǎng)基)和/或不含水解產(chǎn)物。在另一實(shí)施方式中，所述方法包括向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一種或多種下文所描述的使用點(diǎn)添加物的步驟。在一些方面中，下文所描述的使用點(diǎn)添加物也可在開始時(shí)包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中。

5、已發(fā)現(xiàn)，多胺補(bǔ)充培養(yǎng)基(“ps培養(yǎng)基”)增加細(xì)胞存活率和密度，減少細(xì)胞倍增時(shí)間，并且允許在此類補(bǔ)充培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生高滴度蛋白質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)，具有或不具有血清和/或補(bǔ)充性水解產(chǎn)物的ps培養(yǎng)基提供復(fù)原的細(xì)胞存活率和密度、細(xì)胞倍增時(shí)間和高滴度蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

6、在一個(gè)實(shí)施方式中，在ps培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞具有不超過30小時(shí)的平均倍增時(shí)間。在一個(gè)方面中，細(xì)胞倍增時(shí)間不超過24小時(shí)。同樣，與不包括多胺相比，在無(wú)血清培養(yǎng)基中包括多胺允許所培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到較高活細(xì)胞密度(vcd)。

7、在一個(gè)實(shí)施方式中，在不含血清和/或不含水解產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包含一種或多種選自下組的多胺：鳥氨酸、腐胺、精胺、亞精胺或其組合。

8、在一個(gè)實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基為無(wú)血清的，并包含濃度在30μm與900μm之間的鳥氨酸。在一個(gè)方面中，鳥氨酸以至少約30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、540、545、550、555、560、565、568、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、620、625、630、635、640、645、650、700、750、800、850或900μm的濃度(以微摩爾/升為單位表示)存在于培養(yǎng)基中。鳥氨酸可以約0.09mm至約0.9mm存在。在一些實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基包含≤7.5g/l的水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基不含任何水解產(chǎn)物。

9、在一個(gè)實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基為無(wú)血清的，并包含濃度在30μm與900μm之間的腐胺。在一個(gè)方面中，腐胺以至少約30、40、50、60、70、80、90、100、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、260、365、370、375、380、385、390、395、400、405或410μm的濃度(以微摩爾/升為單位表示)存在于培養(yǎng)基中。腐胺可以約0.20mm至約0.714mm存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基含有57mg/l±8.55mg/l的腐胺·2hcl以及≥15mg/l±2.25mg/l的鳥氨酸·hcl。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含≤7.5g/l的水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基不含任何水解產(chǎn)物。

10、在一個(gè)實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基為無(wú)血清的，并包含濃度在10μm與900μm之間的精胺。在一個(gè)方面中，精胺以至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、540、545、550、555、560、565、568、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、620、625、630、635、640、645、650、700、750、800、850或900μm的濃度(以微摩爾/升為單位表示)存在于培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基包含≤7.5g/l的水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基不含任何水解產(chǎn)物。

11、在一個(gè)實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基為無(wú)血清的，并包含濃度在10μm與900μm之間的亞精胺。在一個(gè)方面中，亞精胺以至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、260、365、370、375、380、385、390、395、400、405或410μm的濃度(以微摩爾/升為單位表示)存在于培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基含有57mg/l±8.55mg/l的精胺·4hcl以及≥15mg/l±2.25mg/l的亞精胺·hcl。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含≤7.5g/l的水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基含有≤16g/l的水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，ps培養(yǎng)基不含任何水解產(chǎn)物。

12、在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含選自下組的氨基酸的混合物(值得注意地，谷氨酰胺為一個(gè)例外，其可作為使用點(diǎn)添加物添加回培養(yǎng)基中)：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和其組合。

13、在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含至少40±6mm或至少70±10.5mm氨基酸或氨基酸鹽的混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含至少40mm氨基酸的混合物。在此方面或另一方面中，培養(yǎng)基包含至少70mm氨基酸的混合物。在一些實(shí)施方式中，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和進(jìn)料的全過程含有總計(jì)至少115mm氨基酸或氨基酸鹽的混合物。

14、在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含一種或多種脂肪酸。在一個(gè)方面中，培養(yǎng)基包含脂肪酸(或脂肪酸衍生物)與α生育酚的混合物。在一個(gè)方面中，脂肪酸或脂肪酸衍生物選自下組：亞油酸、亞麻酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、月桂酸、山崳酸、癸酸、十二酸、己酸、二十四酸、肉豆蔻酸和辛酸，并且還可包括衍生自脂肪酸的硫辛酸。

15、在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含一種或多種核苷。在一個(gè)方面中，核苷選自下組：腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、次黃嘌呤和其組合。

16、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含一種或多種鹽。在一些方面中，鹽選自二價(jià)陽(yáng)離子的組，如鈣鹽、鎂鹽和其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含氯化鈣、硫酸鎂和其組合。在另一方面中，鹽還可包括磷酸根的鹽。

17、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含以下中的任一種或多種：nahco3、谷氨酰胺、胰島素、葡萄糖、cuso4、znso4、fecl3、niso4、na4?edta、檸檬酸三鈉(na3?citrate)和其組合。在一個(gè)方面中，所述方法采用向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加選自下組的使用點(diǎn)化學(xué)物質(zhì)中的一種或多種的步驟：nahco3、谷氨酰胺、胰島素、葡萄糖、cuso4、znso4、fecl3、niso4、na4?edta、檸檬酸三鈉和其組合。

18、在一些實(shí)施方式中，使用點(diǎn)添加物包含?；撬?、磷酸酯、泊洛沙姆(poloxamer)188和其組合。在一些方面中，使用點(diǎn)添加物可在開始時(shí)包括在培養(yǎng)基中。

19、已發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中包括?；撬嵩黾蛹?xì)胞比生產(chǎn)率并使得那些細(xì)胞能夠產(chǎn)生較少氨副產(chǎn)物。在一個(gè)方面中，細(xì)胞培養(yǎng)基為無(wú)血清的，并包含約0.1mm至約10mm?；撬?、約1mm至約9mm?；撬?、約1mm至約8mm牛磺酸、約1mm至約7mm?；撬?、約1mm至約6mm牛磺酸、約1mm至約5mm?；撬帷⒓s1mm至約4mm?；撬帷⒓s1mm至約3mm?；撬帷⒓s1mm至約2mm?；撬帷⒓s0.1mm至約1mm?；撬帷⒓s0.2mm至約1mm?；撬?、約0.3mm至約1mm?；撬帷⒓s0.4mm至約1mm?；撬帷⒒蚣s0.5mm至約1mm?；撬帷?/p>

20、在一些實(shí)施方式中，本公開提供一種通過采用以下步驟來(lái)產(chǎn)生抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段的方法：(1)將編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)的核酸序列引入細(xì)胞中；(2)選擇攜帶所述核酸序列的細(xì)胞；(3)在本公開所描述的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)施方式中培養(yǎng)所選細(xì)胞；和(4)在細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)注的蛋白質(zhì)，其中所關(guān)注的蛋白質(zhì)分泌于培養(yǎng)基中。生物治療蛋白質(zhì)可為阻斷抗體或受體拮抗劑(例如阻斷il-4rα和il-13)和/或抗原結(jié)合蛋白，其可包含fc結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，抗體為人類、人源化、嵌合或非人類單克隆抗體或抗體片段。

21、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)方面中，細(xì)胞為適用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如cho細(xì)胞或衍生物cho-k1。在一些方面中，細(xì)胞表達(dá)所關(guān)注的蛋白質(zhì)，如生物治療蛋白質(zhì)。在一些方面中，用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞為能夠產(chǎn)生生物治療劑的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如cho、hek293和bhk細(xì)胞，或其任何衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞為cho細(xì)胞，如cho-k1細(xì)胞。

22、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基：(1)為無(wú)血清的；(2)包含水解產(chǎn)物；(3)包含一種或多種多胺，至少包括鳥氨酸或精胺；(4)包含至少約40mm或至少約70mm氨基酸的混合物，包括以下中的至少一種：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和其組合；(5)包含生育酚以及脂肪酸的混合物；(6)包含核苷的混合物，包括以下中的至少一種：腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、次黃嘌呤和其組合；(7)包含以下中的至少一種的鹽：鈣、鎂和磷酸根；并且(8)包含以下使用點(diǎn)添加物中的至少一種：nahco3、谷氨酰胺、胰島素、葡萄糖、cuso4、znso4、fecl3、niso4、na4?edta、檸檬酸三鈉和其組合。

23、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基：(1)為無(wú)血清的；(2)包含一種或多種多胺，至少包括鳥氨酸或精胺；(3)包含至少約40mm或至少約70mm氨基酸的混合物，包括以下中的至少一種：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和其組合；(4)包含生育酚以及脂肪酸的混合物；(5)包含核苷的混合物，包括以下中的至少一種：腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、次黃嘌呤和其組合；(6)包含鹽，包括以下中的至少一種：鈣鹽、鎂鹽、磷酸鹽和其組合；并且(7)包含以下使用點(diǎn)添加物中的至少一種：nahco3、谷氨酰胺、胰島素、葡萄糖、cuso4、znso4、fecl3、niso4、na4?edta、檸檬酸三鈉和其組合。

24、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基：(1)為無(wú)血清的；(2)包含≤7.5g/l的水解產(chǎn)物；(3)包含0.09±0.014mm、0.3±0.05mm、0.6±0.09mm或0.9±0.14mm鳥氨酸；(4)任選地另外包含0.10±0.03mm、0.20±0.03mm、0.35±0.06mm或0.714±0.11mm腐胺、亞精胺或精胺；(5)包含至少約40mm或至少約70mm氨基酸的混合物，包括以下中的至少一種：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和其組合；(6)包含生育酚和任選的脂肪酸的混合物；(7)包含核苷的混合物，包括腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、次黃嘌呤和其組合；并且(8)包含鈣鹽、鎂鹽、磷酸鹽和其組合。

25、在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基：(1)不包含水解產(chǎn)物；(2)包含濃度為至少90μm±14μm的鳥氨酸；(3)并且任選地包含如至少150μm±14μm的腐胺。在其它實(shí)施方式中，設(shè)想其它多胺，如精胺、亞精胺等在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

26、在一些實(shí)施方式中，本公開提供一種在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含：(1)0.09±0.014mm、0.3±0.05mm、0.6±0.09mm或0.9±0.14mm的鳥氨酸；(2)另外任選的0.20±0.03mm、0.35±0.06或0.714±0.11mm的腐胺；(3)至少約40mm或至少約70mm氨基酸的混合物，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；(4)生育酚以及脂肪酸的混合物；(5)核苷的混合物，包括腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黃嘌呤；和(6)鈣鹽、鎂鹽和磷酸鹽，其中根據(jù)此方法培養(yǎng)的細(xì)胞的平均倍增時(shí)間不超過24小時(shí)或不超過使用包含少于0.09±0.015mm多胺的類似細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的倍增時(shí)間的三分之一。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)物能夠獲得比包含少于0.09±0.014mm鳥氨酸(或少于0.09±0.014mm鳥氨酸和少于0.2±0.03mm腐胺)的類似細(xì)胞培養(yǎng)基中的類似細(xì)胞培養(yǎng)物高至少3倍的活細(xì)胞密度。在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含≤7.5g/l的水解產(chǎn)物；并且在另一實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不含水解產(chǎn)物。

27、在一些實(shí)施方式中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)通過以下步驟產(chǎn)生：(1)將編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)(如抗體或其它抗原結(jié)合蛋白)的核酸序列引入cho細(xì)胞中；(2)選擇攜帶所述核酸序列的細(xì)胞；(3)在無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞，所述無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基包含：(a)0.09±0.014、0.3±0.05mm、0.6±0.09mm或0.9±0.14mm的鳥氨酸；(b)另外任選的0.20±0.03mm、0.35±0.06或0.714±0.11mm的腐胺；(c)至少40mm或至少70mm氨基酸的混合物，包括以下中的一種或多種：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；(d)生育酚以及任選的脂肪酸的混合物；(e)核苷的混合物，包括以下中的一種或多種：腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、次黃嘌呤和其組合；和(f)鹽，包括以下中的一種或多種：鈣鹽、鎂鹽、磷酸鹽和其組合；和(4)在cho細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)注的蛋白質(zhì)，其中所關(guān)注的蛋白質(zhì)分泌于培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方式中，無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基可包括≤7.5g/l的水解產(chǎn)物；或在其它實(shí)施方式中完全不包括水解產(chǎn)物。

28、在一些實(shí)施方式中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)通過以下步驟產(chǎn)生：(1)將編碼所關(guān)注的蛋白質(zhì)(如抗體或其它抗原結(jié)合蛋白)的核酸序列引入cho細(xì)胞中；(2)選擇攜帶所述核酸序列的細(xì)胞；(3)在無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選細(xì)胞，所述無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基包含：(a)0.09±0.014、0.3±0.05mm、0.6±0.09mm或0.9±0.14mm的鳥氨酸；(b)另外任選的0.20±0.03mm、0.35±0.06或0.714±0.11mm的腐胺；(c)至少40mm或至少70mm氨基酸的混合物，包括以下中的一種或多種：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和其組合；(d)生育酚以及脂肪酸的混合物；(e)核苷的混合物，包括以下中的一種或多種：腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷、次黃嘌呤和其組合；和(f)鹽，包括以下中的一種或多種：鈣鹽、鎂鹽和磷酸鹽；和(4)在cho細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)注的蛋白質(zhì)，其中所關(guān)注的蛋白質(zhì)分泌于培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方式中，無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基可包括≤7.5g/l的水解產(chǎn)物；或在其它實(shí)施方式中完全不包括水解產(chǎn)物。

29、本公開部分提供一種用于增加滴度(titer)的經(jīng)改進(jìn)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)(seedtrain)方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，與在1.7×105至2.3×105個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)初始活細(xì)胞密度(vcd)相比，每個(gè)步驟(n-5至n-1)處的初始vcd增加到約3.5×105至約5.43×105個(gè)細(xì)胞/毫升。在一些方面中，(n-5至n-1中的)初始vcd比標(biāo)準(zhǔn)種子擴(kuò)大培養(yǎng)中的替代初始vcd高約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6.、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍或3.0倍。在一個(gè)方面中，優(yōu)化的種子擴(kuò)大培養(yǎng)引起最終滴度(g/l)增加2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、1％、17％、18％、19％或20％。在一個(gè)方面中，在最終生產(chǎn)容器(production?vessel)中觀察到的峰值乳酸與標(biāo)準(zhǔn)種子擴(kuò)大培養(yǎng)相比沒有實(shí)質(zhì)性差異。

30、本公開部分提供用于測(cè)量和控制細(xì)胞培養(yǎng)條件的改進(jìn)容器和生物反應(yīng)器，所述細(xì)胞培養(yǎng)條件包括溶解氣體，如氧氣和二氧化碳，其為維持生物醫(yī)藥行業(yè)內(nèi)的健康細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)過程的重要過程參數(shù)。

31、本公開部分提供用于空氣鼓泡、攪拌和溶解氣體的測(cè)量的改進(jìn)方法和系統(tǒng)。更確切地說(shuō)，本公開提供各時(shí)間間隔處的優(yōu)化溶解氣體濃度，以及具有優(yōu)化攪拌速率和工作容積以提供必要攪拌同時(shí)最大限度地減小剪應(yīng)力的改進(jìn)生物反應(yīng)器。

32、在某些示例性實(shí)施方式中，優(yōu)化生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段期間沿種子擴(kuò)大培養(yǎng)的包括各種傳感器的容器和生物反應(yīng)器中的起始體積、空氣鼓泡和攪拌設(shè)定點(diǎn)，以經(jīng)由最大限度地減小對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的剪應(yīng)力以及優(yōu)化各時(shí)間處的活細(xì)胞密度(vcd)、溶解氧、二氧化碳和ph來(lái)改進(jìn)過程穩(wěn)定性。

33、在一些實(shí)施方式中，鼓泡速率可用于改變細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的pco2含量以調(diào)節(jié)表達(dá)度普利尤單抗的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的酸性和堿性變異體。

34、本公開還提供用于測(cè)量溶解氣體的改進(jìn)的方法和系統(tǒng)。電化學(xué)探針和光學(xué)探針還可用于測(cè)量其它溶解氣體，如二氧化碳。相比于光學(xué)探針，電化學(xué)探針更常用于容器和生物反應(yīng)器中，因?yàn)殚L(zhǎng)久以來(lái)已證明，電化學(xué)探針與光學(xué)探針或傳感器相比具有較寬的線性范圍和更快的反應(yīng)時(shí)間。然而，電化學(xué)溶解氧探針就頻繁更換膜和電解質(zhì)溶液來(lái)說(shuō)需要大量維護(hù)，并且需要漫長(zhǎng)的極化時(shí)間。此外，已知電化學(xué)探針由于氣泡干擾而提供有噪聲的讀數(shù)，下文實(shí)例中提供的大規(guī)模生物反應(yīng)器中有發(fā)生此情形的證據(jù)。所述噪聲可導(dǎo)致超出正常操作范圍的偏移，并且歸因于行業(yè)內(nèi)的嚴(yán)格監(jiān)管，必須經(jīng)由生物醫(yī)藥公司的質(zhì)量保證系統(tǒng)來(lái)研究和證實(shí)所述偏移。在通常歸因于鼓泡干擾而出現(xiàn)的短暫高側(cè)偏移情況下進(jìn)行研究，從而對(duì)制造來(lái)源進(jìn)行限制。

35、盡管光學(xué)探針受來(lái)自攪拌、攪動(dòng)和鼓泡的氣泡干擾影響較小，并且不具有相同的電解質(zhì)更換和極化需求，但光學(xué)探針與電化學(xué)探針相比準(zhǔn)確性更低并且反應(yīng)性更小。此外，評(píng)定光學(xué)探針的使用的先前研究限于水監(jiān)測(cè)應(yīng)用和小規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用。綜述文獻(xiàn)中在測(cè)試光學(xué)探針期間所使用的最大容器為50l一次性生物反應(yīng)器(marvell等人,2009)，因而與光學(xué)探針在尚未解決光學(xué)探針的性能問題的大規(guī)模不銹鋼生產(chǎn)(>1,000l)中的使用相關(guān)的報(bào)告科學(xué)文獻(xiàn)留有空白。

36、因此，本公開提供一種用于減少電化學(xué)探針中的信號(hào)噪聲的經(jīng)改進(jìn)的系統(tǒng)和方法，其減少或消除可歸因于氣泡干擾的誤報(bào)。另外，本公開提供一種改進(jìn)用于在大規(guī)模容器和生物反應(yīng)器中測(cè)量溶解氣體的光學(xué)探針的準(zhǔn)確性的系統(tǒng)和方法，其與常規(guī)電化學(xué)探針相比需要較少維護(hù)并且不易受氣泡干擾影響。如下文更詳細(xì)地論述，用經(jīng)改進(jìn)的數(shù)據(jù)處理方法開發(fā)具有電化學(xué)探針和光學(xué)探針的容器和生物反應(yīng)器，以使測(cè)量值的準(zhǔn)確性達(dá)到最佳，同時(shí)通過減少或消除超出正常操作范圍的非所需偏移事件來(lái)最大限度地減少維護(hù)，此在嚴(yán)格監(jiān)管的生物醫(yī)藥行業(yè)中需要漫長(zhǎng)的質(zhì)量研究。

37、在一個(gè)實(shí)施方式中，本公開提供通過以下步驟來(lái)測(cè)量生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞的vcd的方法：向在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞施加電場(chǎng)；測(cè)量電容；并在所測(cè)量電容與活細(xì)胞密度之間建立相關(guān)性。

38、在一個(gè)實(shí)施方式中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)能夠以與在包含少于0.09±0.014mm鳥氨酸(或少于0.09±0.014mm鳥氨酸和少于0.2±0.03mm腐胺)的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的類似細(xì)胞所產(chǎn)生的平均七天滴度相比，高至少7％、高至少14％、高至少80％、高至少兩倍或高至少三倍的平均七天滴度被生產(chǎn)。

39、為了收集和純化增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，開發(fā)不僅可適應(yīng)增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)量并且改進(jìn)總產(chǎn)率百分比的新的經(jīng)改進(jìn)的方法。所述方法包括例如優(yōu)化收集預(yù)處理、蛋白a色譜、病毒滅活、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、病毒截留過濾、濃縮和滲濾以及原料藥調(diào)節(jié)，其進(jìn)一步描述于下文中。

40、本公開提供一種用于純化抗il4rα抗體的方法。在一些示例性實(shí)施方式中，方法包括：(a)使所述抗體經(jīng)受預(yù)處理；(b)收集所述抗體；(c)使所述抗體經(jīng)受親和色譜；(d)使從步驟(c)的洗脫液匯集的抗體在約3至約4.5的ph下經(jīng)受病毒滅活并隨后將ph調(diào)節(jié)到約5至約8；(e)使從步驟(d)匯集的所述抗體以流通模式經(jīng)受陰離子交換色譜；(f)使從步驟(e)的流通級(jí)分匯集的所述抗體以結(jié)合和洗脫模式經(jīng)受陽(yáng)離子交換色譜；(g)使從步驟(f)的洗脫液匯集的所述抗體以流通模式經(jīng)受疏水性相互作用色譜；和(h)使從步驟(g)的流通級(jí)分匯集的所述抗體經(jīng)受病毒截留過濾。

41、在一個(gè)方面中，步驟(h)的抗體進(jìn)一步經(jīng)受濃縮以及使用ph在4.0與4.5之間的滲濾緩沖液進(jìn)行的滲濾。

42、在一個(gè)方面中，滲濾緩沖液包含約4mm乙酸鹽至約6mm乙酸鹽。

43、在一個(gè)方面中，收集預(yù)處理包括使所述抗體經(jīng)受約4.5至5.0或約4.0至約5.5的瞬時(shí)ph水平，并隨后將ph水平增加到約5.5至6.5。

44、在一個(gè)方面中，親和色譜為蛋白a色譜。

45、在一個(gè)方面中，步驟(b)的收集包括離心和深度過濾。

46、在一個(gè)方面中，在3kl至25kl生物反應(yīng)器中收集抗體。

47、在一個(gè)方面中，蛋白a柱的裝載ph在7與8之間。在一個(gè)方面中，蛋白a柱的裝載ph在6與8之間。在一個(gè)方面中，蛋白a柱的裝載ph為約6。

48、在替代示例性實(shí)施方式中，方法包括：(a)培養(yǎng)表達(dá)抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段的細(xì)胞；(b)使所述細(xì)胞經(jīng)受約4.0至5.5或約4.0至約5.5的瞬時(shí)ph水平，隨后將ph調(diào)節(jié)到約5.5至6.5；(c)通過離心收集所述細(xì)胞以從包含抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段的澄清培養(yǎng)基分離細(xì)胞碎片；(d)使所述澄清培養(yǎng)基經(jīng)受親和色譜；(e)使從步驟(d)中的洗脫液匯集的抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段在約3至約4.5的ph下經(jīng)受病毒滅活并隨后將ph調(diào)節(jié)到約5至約8；(f)使從步驟(e)匯集的抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段以流通模式經(jīng)受陰離子交換色譜；(g)使從步驟(f)的流通級(jí)分匯集的抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段以結(jié)合和洗脫模式經(jīng)受陽(yáng)離子交換色譜；(h)使從步驟(g)的洗脫液匯集的抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段以流通模式經(jīng)受疏水性相互作用色譜；和(i)使從步驟(h)的流通級(jí)分匯集的抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)受病毒截留過濾，由此產(chǎn)生抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段。

49、在一個(gè)方面中，方法進(jìn)一步包括在步驟(i)之后使所述抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)受超濾和滲濾(uf/df)。

50、在一個(gè)方面中，親和色譜為蛋白a色譜。

51、在一個(gè)方面中，抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段包含有包含seq?id?no:3、4和5的三個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(hcdr)序列和包含seq?id?no:6、7和8的三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(lcdr)序列。

52、在一個(gè)方面中，抗il-4rα抗體或其抗原結(jié)合片段包含有包含seq?id?no:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(hcvr)和包含seq?id?no:2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(lcvr)。

53、在一個(gè)方面中，抗il-4rα抗體為度普利尤單抗。

54、當(dāng)結(jié)合以下描述和附圖考慮時(shí)，將更好地了解和理解本公開的這些和其它方面。盡管以下描述指示各種實(shí)施方式和其多個(gè)具體細(xì)節(jié)，但其僅借助于說(shuō)明給出并且不具有限制性?？稍诒景l(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種取代、修改、添加或重排，并且下文提供描述本公開的額外方面的額外所列舉的實(shí)施例。