本發(fā)明涉及真菌檢測，尤其涉及一種用于檢測真菌的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白及其應(yīng)用、一種真菌的親和分子檢測方法。

背景技術(shù)：

1、迄今為止，包括抗生素使用、癌癥治療、移植手術(shù)和侵入性治療等方面的突破以及艾滋病毒和sars-cov-2病毒的流行，導(dǎo)致免疫功能低下個體的數(shù)量大幅增加。因此，侵襲性真菌感染(ifis)已經(jīng)從一種罕見的疾病轉(zhuǎn)變成了發(fā)病普遍和死亡率升高的重要因素。念珠菌屬、曲霉菌屬、隱球菌、肺孢子蟲和毛霉菌是引起ifis的主要病原體，其中，白色假絲酵母菌是臨床常見的病原體之一。現(xiàn)有技術(shù)治療侵襲性真菌感染的藥物選擇主要有三類：唑類、棘白菌素和多烯類，但都有潛在毒性的缺點；ifis的非特異性癥狀和缺乏及時的確診技術(shù)往往導(dǎo)致漏診、誤診和治療失敗；同時目前缺乏及時的檢測方法來及時評估患者抗真菌治療的療效，從而增加了管理這些感染的復(fù)雜性。

2、真菌的細胞壁由糖蛋白、葡聚糖和幾丁質(zhì)組成。幾丁質(zhì)是一種多聚糖，由幾丁質(zhì)合酶(chs)廣泛家族酶體系合成，并共價結(jié)合到葡聚糖上構(gòu)建成一個復(fù)雜的多聚糖網(wǎng)絡(luò)，形成了真菌細胞壁堅固的結(jié)構(gòu)和彈性基礎(chǔ)，并且形成細胞外基質(zhì)逃避吞噬細胞的識別和免疫捕獲。此外，在哺乳動物、植物和細菌中尚未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)和chs基因的存在，只有根瘤菌(α變形菌)編碼nodc蛋白與幾丁質(zhì)合成酶具有同源性。因此，幾丁質(zhì)和chs被認為是真菌診斷和抗真菌治療的特異性靶點。傳統(tǒng)的真菌檢測方法，包括真菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)檢測、抗原和抗體檢測在臨床上廣泛使用，但基于培養(yǎng)的方法存在周轉(zhuǎn)周期長和靈敏度低等問題，血培養(yǎng)對侵襲性假絲酵母菌病(invasive?candidiasis，ic)檢測靈敏度約為50％～90％。在一項尸檢證實的ic患者中，生前血培養(yǎng)的靈敏度為21％～71％；侵襲性曲霉病(invasiveaspergillosis，ia)血培養(yǎng)陽性很少見，靈敏度僅在1％～5％之間；假絲酵母菌血培養(yǎng)陽性的平均時間為2～3天，最長7～8天。形態(tài)學(xué)檢測及抗原抗體檢測存在侵入性取材、主觀性以及靈敏度和特異度低。pcr和maldi-tof質(zhì)譜等分子技術(shù)為鑒定真菌病原體提供了另一有效的選擇。然而，一些缺點限制了它們的臨床應(yīng)用：首先，pcr檢測需要高純度的核酸樣本。商業(yè)化核酸提取試劑盒采用固相萃取柱，可能存在吸附效率低和洗脫不足導(dǎo)致dna損失；此外，試劑盒在阻斷來自人類基因組的干擾方面的效率較低。其次，pcr和maldi-tof質(zhì)譜方法都需要昂貴的設(shè)備、熟練的技術(shù)人員，這限制了它們在現(xiàn)場或臨床環(huán)境中的適用性。相反，等溫擴增技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)擴增(lamp)和重組酶聚合酶擴增(rpa)等可以使核酸在恒溫下進行擴增，這使它們非常適合于低資源環(huán)境應(yīng)用及現(xiàn)場診斷。與lamp相比，rpa簡化了檢測引物設(shè)計，引物數(shù)量的減少降低了引物相互作用或交叉反應(yīng)的風(fēng)險。使用簡單的恒溫設(shè)備在37～42℃內(nèi)孵育10～20分鐘即可完成核酸擴增。鑒于這些優(yōu)點，rpa已被廣泛應(yīng)用于多種病原體檢測。此外，rpa與聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)蛋白(cas)系統(tǒng)結(jié)合，增強了診斷技術(shù)的靈敏度、特異度、可編程性和實現(xiàn)可視化檢測。cas12a蛋白在crispr?rna(crrna)的引導(dǎo)下，特異性識別靶序列原間隔子鄰近基序(pam)tttn位點并結(jié)合到雙鏈dna上。隨后，cas12a酶順式切割活性和反式切割活性被激活，特異性切割裂解靶dsdna并非特異性切割體系中的ssdna報告探針，由此激發(fā)的熒光信號可以在藍光或紫外光照射下肉眼觀察，也可以通過熒光檢測器實時定量熒光強度。然而，rpa與crispr/cas12a的結(jié)合在實際應(yīng)用中面臨著挑戰(zhàn)，包括rpa和crispr/cas12a體系之間的干擾；此外，rpa的高放大效率引入了氣溶膠污染的潛在風(fēng)險，尤其是在開蓋操作程序中。目前的檢測方法，只關(guān)注真菌的特定成分如真菌蛋白、多糖或核酸，而不是考慮一個結(jié)構(gòu)完整的具有感染活性的真菌孢子，因此并不能準確地反映感染性真菌的存在。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測真菌的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白及其應(yīng)用，使用幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白與快速擴增和一鍋法檢測方法聯(lián)合可以快速準確的檢測真菌。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種用于檢測真菌的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，所述幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白包括chbd2、chbd3、efcbp-1、pfcbp-a、pfcbp-b、bccbp-1或sccbp-1；

4、所述chbd2的氨基酸序列如seq?id?no：1所示，編碼chbd2氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：2所示；

5、所述chbd3的氨基酸序列如seq?id?no：3所示，編碼chbd3氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：4所示；

6、所述efcbp-1的氨基酸序列如seq?id?no：5所示，編碼efcbp-1氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：6所示；

7、所述pfcbp-a的氨基酸序列如seq?id?no：7所示，編碼pfcbp-a氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：8所示；

8、所述pfcbp-b的氨基酸序列如seq?id?no：9所示，編碼pfcbp-b氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：10所示；

9、所述bccbp-1的氨基酸序列如seq?id?no：11所示，編碼bccbp-1氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：12所示；

10、所述sccbp-1的氨基酸序列如seq?id?no：13所示，編碼sccbp-1氨基酸的核苷酸序列如seq?id?no：14所示。

11、本發(fā)明還提供了所述的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在檢測真菌中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明還提供了一種真菌的親和分子檢測方法，包括如下步驟：

13、(1)將幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白與磁珠混合孵育，得到mb-cbp復(fù)合物；

14、(2)將mb-cbp復(fù)合物和檢測樣本混合孵育，得到混合物；

15、(3)提取混合物的基因組dna；

16、(4)對基因組dna進行快速擴增和一鍋法檢測；

17、所述幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白為所述的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。

18、作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述混合孵育的溫度為20～30℃；所述混合孵育的時間為0.5～2.0h；

19、所述幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白與磁珠混合孵育的體積質(zhì)量比為0.002～0.04:1。

20、作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述檢測樣本為血液和/或肺泡灌洗液。

21、作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述mb-cbp復(fù)合物和檢測樣本的混合的體積比為0.04～0.06：0.5～1.5；

22、步驟(2)所述的混合孵育的溫度為20～30℃，時間為20～35min。

23、作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述提取混合物的基因組dna的方法為硅羥基磁珠法。

24、作為優(yōu)選，步驟(4)中，所述對基因組dna進行快速擴增和一鍋法檢測的方法為rpa-crispr/cas12a；

25、具體步驟如下：

26、1)將基因組dna進行rpa擴增，收集擴增后的rpa體系；

27、2)將擴增后的rpa體系和crispr/cas12a體系混合孵育5～20min，檢測，根據(jù)熒光信號的強弱判斷是否有真菌。

28、作為優(yōu)選，所述crispr/cas12a體系包括如下組分：10×ne?buffer2.1，crrna，cas12a，寡核苷酸探針；

29、所述10×ne?buffer2.1的添加量為0.1～0.6μl；

30、所述crrna的添加量為1～4μl，所述crrna的初始濃度為1～3μmol/l，

31、所述cas12a的添加量為0.10～1.0μl；所述cas12a的初始濃度為4～5μmol/l；

32、所述寡核苷酸探針的添加量為0.5～1.5μl，所述寡核苷酸探針的初始濃度為1～15μmol/l；

33、所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no：15所示；

34、所述cas12a的核苷酸序列如seq?id?no：16所示；

35、所述寡核苷酸探針的核苷酸序列為5′-fam-ttattatt-bhq1-3′。

36、作為優(yōu)選，所述混合孵育的溫度為36～44℃。

37、本發(fā)明的有益效果：

38、本發(fā)明設(shè)計了一種新穎的親和分子診斷方法，通過幾丁質(zhì)親和磁分離法結(jié)合rpa-crispr/cas12a，快速、精確地定量檢測白色假絲酵母菌。通過制備幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(cbp)并評估它們與幾丁質(zhì)的結(jié)合親和力；隨后，使用偶聯(lián)cbp的磁珠從全血或肺泡灌洗液樣品中高效地捕獲真菌；并進一步用硅羥基磁珠提取純化真菌基因組dna，通過rpa-crispr/cas12a系統(tǒng)進行核酸快速擴增和一鍋法檢測。整個反應(yīng)可以在120min內(nèi)完成，對白色假絲酵母菌的檢測靈敏度達到101cfu/ml。該診斷平臺有望為侵襲性真菌感染提供低成本、高效益、快速、準確和即時診斷。