本發(fā)明屬于生物，具體地講，涉及一種檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn的方法。

背景技術(shù)：

1、脊髓性肌萎縮癥（spinal?muscular?atrophy,?sma）是兒童最常見(jiàn)的一種常染色體隱性遺傳的神經(jīng)肌肉病，以脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性導(dǎo)致的肌無(wú)力和肌萎縮為主要臨床特征。sma發(fā)病率約為1/10000，亞洲人群攜帶率約為1/48~50。

2、與sma發(fā)病相關(guān)的基因位于人5號(hào)染色體5q13.2區(qū)域，即運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(survival?motor?neuron,?smn)，包括致病基因smn1和修飾基因smn2，而這兩個(gè)基因高度同源且反向重復(fù)，這一特性導(dǎo)致smn基因容易發(fā)生重組或缺失。

3、致病基因smn1的缺失、轉(zhuǎn)化或突變是sma發(fā)病的主要因素。95%的sma患者是由致病基因smn1純合缺失導(dǎo)致，即[0+0]型，另有5%則是由smn1復(fù)合雜合突變所致，即[0+1d]型。復(fù)合雜合突變[0+1d]型是由一條染色單體的純合缺失，另一條染色單體存在影響smn1基因表達(dá)的點(diǎn)突變組成。目前國(guó)內(nèi)在大樣本研究中發(fā)現(xiàn)的中國(guó)人特有的突變位點(diǎn)有2個(gè)：一個(gè)位于外顯子1上的突變，產(chǎn)生移碼突變；另外一個(gè)是位于第5外顯子上的突變，產(chǎn)生無(wú)義突變。這兩個(gè)突變經(jīng)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（acmg）致病性評(píng)估確認(rèn)為極強(qiáng)致病性的位點(diǎn)。

4、根據(jù)smn1的拷貝數(shù)，可對(duì)sma患者、攜帶者及正常人群進(jìn)行區(qū)分：當(dāng)受檢者smn1拷貝數(shù)為0時(shí)，則為sma患者；當(dāng)受檢者smn1為1個(gè)拷貝時(shí)為sma攜帶者，此時(shí)如果還攜帶微小變異，則受檢者為復(fù)合雜合突變；當(dāng)受檢者smn1拷貝數(shù)為2時(shí)，每一條染色體攜帶1個(gè)拷貝，即[1+1]型，為正常人，但對(duì)于一類(lèi)特殊類(lèi)型攜帶者（在攜帶者人群中頻率約為4%）其2個(gè)拷貝位于同一條染色體上，而另一條染色體上的smn1基因丟失，即[2+0]型，該類(lèi)型被稱(chēng)為沉默攜帶者，有50%的概率會(huì)將不含smn1的染色體傳給子代，產(chǎn)生sma患者。對(duì)于[2+0]型檢測(cè)，早期策略是通過(guò)引入幾個(gè)分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行家系分析，這樣操作方法非常繁瑣，非常不適合于篩查，此外這樣的體系引物復(fù)雜度更高，其擴(kuò)增穩(wěn)定性會(huì)受影響。有文獻(xiàn)報(bào)道（luo?etal.?genet?med?2014,?16:149–156）smn1基因的多態(tài)性位點(diǎn)與[2+0]型沉默攜帶者緊密相關(guān)，即，當(dāng)受檢者smn1為2個(gè)拷貝，同時(shí)攜帶點(diǎn)突變時(shí)，該受檢者即為[2+0]型沉默攜帶者，這為[2+0]型快速鑒別提供了新的思路。

5、修飾基因smn2產(chǎn)生的蛋白約有80-90%?是截短和不穩(wěn)定的，另外有10-20%?的全長(zhǎng)蛋白具有正常的功能，可以部分補(bǔ)償因突變導(dǎo)致的smn1喪失的基因功能。國(guó)內(nèi)外管理共識(shí)中，根據(jù)患者smn2拷貝數(shù)、發(fā)病年齡及表現(xiàn)出的運(yùn)動(dòng)能力，一般將sma劃分為i-iv型，smn2拷貝數(shù)逐級(jí)增多，發(fā)病年齡及患病程度逐級(jí)遞減。因此，smn2拷貝數(shù)在以調(diào)控smn蛋白為治療策略的藥物臨床試驗(yàn)中常常被作為重要參考數(shù)據(jù)，而在新生兒篩查中則被作為癥狀出現(xiàn)前患者治療評(píng)估的重要生物學(xué)標(biāo)志物。

6、由此可見(jiàn)，除了smn1基因的拷貝數(shù)外，smn1基因關(guān)鍵位點(diǎn)的突變情況對(duì)于正常人群的篩查具有極為重要的價(jià)值，同時(shí)smn2基因的拷貝數(shù)精準(zhǔn)定量對(duì)臨床醫(yī)生針對(duì)不同患者制定相應(yīng)的治療方案也具有非常重要的指導(dǎo)意義。在臨床上需要一款可以同時(shí)滿(mǎn)足上述需求的快速便捷的檢測(cè)技術(shù)或產(chǎn)品。

7、目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道并上市的sma突變檢測(cè)技術(shù)，多是依賴(lài)于實(shí)時(shí)熒光定量pcr（real-time?pcr），該技術(shù)檢測(cè)周期短、儀器普及率高，適合于人群篩查，但不包含熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，會(huì)造成復(fù)合雜合突變患者或[2+0]型沉默攜帶者的漏檢，對(duì)患者及家庭造成不可挽回的傷害；此外對(duì)于≥2的拷貝數(shù)也無(wú)法精確定量；smn1與smn2的拷貝數(shù)檢測(cè)需要分開(kāi)進(jìn)行多管反應(yīng)，操作復(fù)雜不便。基于毛細(xì)管電泳平臺(tái)的多重連接探針擴(kuò)增（multiplex?ligation-dependent?probe?amplification,?mlpa）是目前國(guó)內(nèi)外共識(shí)推薦的檢測(cè)smn1及smn2拷貝數(shù)變異的金標(biāo)準(zhǔn)，不僅可以實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)的精準(zhǔn)定量，也可以完成點(diǎn)突變的檢測(cè)，但該方法不僅價(jià)格昂貴、操作繁瑣（需要經(jīng)過(guò)變性、雜交、連接、擴(kuò)增、上機(jī)檢測(cè)等步驟）、耗時(shí)長(zhǎng)（完成整個(gè)流程檢測(cè)需要2天），不能滿(mǎn)足大規(guī)模篩查的需求。

8、熒光pcr-毛細(xì)管電泳技術(shù)是采用熒光染料標(biāo)記引物，擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物在毛細(xì)管泳道電泳，利用軟件進(jìn)行圖像收集和分析擴(kuò)增片段大小的一項(xiàng)技術(shù)。最早嘗試使用該技術(shù)同時(shí)檢測(cè)smn拷貝數(shù)及各外顯子突變的專(zhuān)利（專(zhuān)利文獻(xiàn)us7875432b2），相較于其他檢測(cè)技術(shù)，該方法的優(yōu)勢(shì)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，不足之處在于雖可同時(shí)檢測(cè)拷貝數(shù)及點(diǎn)突變，但需要分兩個(gè)體系進(jìn)行擴(kuò)增，且只能得到smn1與smn2的拷貝數(shù)比例關(guān)系，無(wú)法精確定量smn1及smn2的拷貝數(shù)，但該嘗試使基于熒光pcr-毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)smn基因成為可能。之后出現(xiàn)了基于該技術(shù)對(duì)smn進(jìn)行檢測(cè)的改進(jìn)方法（參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn112048548b），改進(jìn)后的方法可以定量smn1與smn2的拷貝數(shù)及關(guān)鍵點(diǎn)突變，但仍有不足：通過(guò)一個(gè)體系檢測(cè)的結(jié)果為smn1及smn2基因外顯子7與外顯子8的拷貝數(shù)總和，而點(diǎn)突變則設(shè)置了另外一個(gè)體系進(jìn)行檢測(cè)。

9、因此，尚無(wú)一種方便、快捷、價(jià)格適宜的在一管中不僅可以檢測(cè)smn1及smn2的拷貝數(shù)，還可以對(duì)關(guān)鍵突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以區(qū)分復(fù)合雜合突變，并可靠的將smn1?[2+0]型沉默攜帶者從smn1?[1+1]型的正常人群區(qū)分出來(lái)，既可以滿(mǎn)足臨床診斷需求又可對(duì)攜帶者進(jìn)行篩查的產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決目前檢測(cè)sma相關(guān)基因拷貝數(shù)、復(fù)合雜合突變及沉默攜帶者檢測(cè)方法的不足，本發(fā)明通過(guò)對(duì)大量備選內(nèi)參的篩選對(duì)比，最終選擇血紅蛋白β亞基（hemoglobinsubunit?beta?gene，hbb）基因及核糖核酸酶p/mrp亞基p30（ribonuclease?p/mrp?subunitp30，rpp30）中的一個(gè)或兩個(gè)作為內(nèi)參對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，并通過(guò)大量引物的篩選和體系優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在一管中對(duì)smn1及smn2外顯子7與外顯子8、中國(guó)人群2個(gè)高頻突變位點(diǎn)及用于區(qū)分[2+0]型沉默攜帶者的關(guān)鍵突變點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，這樣的體系設(shè)計(jì)可以在較低的檢測(cè)成本下實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)的高通量的檢測(cè)，更貼合臨床需求。

2、因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于，提供一種檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于，提供一種檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn的試劑盒。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于，提供一種可以更好的進(jìn)行人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn拷貝數(shù)變異檢測(cè)的計(jì)算方法。本發(fā)明的第四個(gè)方面，所述計(jì)算方法在精準(zhǔn)定量檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn高拷貝數(shù)中的應(yīng)用。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、作為本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn的方法，其是以能夠特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子7位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合1，能夠特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子8位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合2，能夠特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.22dupa的引物組合3，能夠特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.683t/a的引物組合4，和能夠特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的引物組合5，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

5、以及以?xún)?nèi)參引物hbb和/或內(nèi)參引物rpp30進(jìn)行擴(kuò)增，獲得內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物和/或內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物；

6、通過(guò)計(jì)算smn1或smn2的外顯子7或外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值，或，

7、通過(guò)計(jì)算smn1或smn2的外顯子7或外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值，或，

8、通過(guò)計(jì)算smn1或smn2的外顯子7或外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高和內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高之和的比值，或，

9、通過(guò)計(jì)算smn1的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn1的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，和/或，

10、通過(guò)計(jì)算smn1的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn1的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，和/或，

11、通過(guò)計(jì)算smn2的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn2的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，和/或，

12、通過(guò)計(jì)算smn2的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn2的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，

13、確定smn1和/或smn2外顯子7和/或外顯子8的拷貝數(shù)；

14、通過(guò)統(tǒng)計(jì)c.22dupa、c.683t/a及位置的峰高情況，確定c.22dupa、c.683t/a及點(diǎn)突變情況。

15、根據(jù)本發(fā)明，

16、所述內(nèi)參引物hbb的核苷酸序列如seq?id?no.13?和?seq?id?no.14所示；

17、內(nèi)參引物rpp30的核苷酸序列如seq?id?no.15?和?seq?id?no.16所示；

18、用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子7位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合1的核苷酸序列如seqid?no.1、seq?id?no.2和seq?id?no.3所示；

19、用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子8位點(diǎn)smn1、smn2的引物組合2的核苷酸序列如seq?idno.4、seq?id?no.5和seq?id?no.6所示；

20、用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.22dupa?的引物組合3的核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示；

21、用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.683t/a的引物組合4的核苷酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示；

22、用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的引物組合5的核苷酸序列如seq?idno.11和seq?id?no.12所示。

23、根據(jù)本發(fā)明，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

24、dntp及dutp終濃度范圍為100μm~400μm，擴(kuò)增引物終濃度范圍為40nm~400nm，dna聚合酶加入量范圍為1~3u，udg酶加入量范圍為0.01~0.2u。

25、進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

26、ddh2o?,?2.045μl?;

27、2.5x?multi?pcr?buffer，6μl；

28、10mm?dgtp、dctp、datp，1.35μl；

29、10mm?dttp，0.15μl；

30、10mm?dutp，0.3μl;

31、10μm?seq?id?no.?1，0.315μl;

32、10μm?seq?id?no.?2，0.165μl;

33、10μm?seq?id?no.?3，0.21μl;

34、10μm?seq?id?no.?4，0.315μl;

35、10μm?seq?id?no.?5，0.315μl;

36、10μm?seq?id?no.?6，0.315μl;

37、10μm?seq?id?no.?7，0.165μl;

38、10μm?seq?id?no.?8，0.165μl;

39、10μm?seq?id?no.?9，0.165μl;

40、10μm?seq?id?no.?10，0.165μl;

41、10μm?seq?id?no.?11，0.165μl;

42、10μm?seq?id?no.?12，0.165μl;

43、10μm?seq?id?no.?13，0.105μl;

44、10μm?seq?id?no.?14，0.105μl;

45、10μm?seq?id?no.?15，0.105μl;

46、10μm?seq?id?no.?16，0.105μl;

47、10μm?seq?id?no.?17，0.315μl;

48、10μm?seq?id?no.?18，0.315μl;

49、dna聚合酶（5u/μl），0.45μl;

50、udg酶（2u/μl），0.03μl;

51、dna?1μl。

52、根據(jù)本發(fā)明，所述擴(kuò)增的條件：50℃?2min?1cycle?，95℃?2min?1cycle,?接下來(lái)95℃?15sec、56℃?30sec、72℃?1min?共計(jì)25?cycles,?最后72℃?30min。

53、作為本發(fā)明的第二個(gè)方面，一種檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn的試劑盒，其包含：

54、通用引物1和通用引物2，

55、內(nèi)參引物，所述內(nèi)參引物包括內(nèi)參引物hbb；和/或，內(nèi)參引物rpp30；

56、用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子7位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合1，包括能夠擴(kuò)增基因組中smn1基因但不擴(kuò)增smn2基因的引物以及能夠擴(kuò)增基因組中smn2基因但不擴(kuò)增smn1基因的引物，檢測(cè)結(jié)果能夠區(qū)分外顯子7位點(diǎn)的smn1擴(kuò)增產(chǎn)物與smn2擴(kuò)增產(chǎn)物；

57、用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子8位點(diǎn)smn1、smn2的引物組合2，包括能夠擴(kuò)增基因組中smn1基因但不擴(kuò)增smn2基因的引物以及能夠擴(kuò)增基因組中smn2基因但不擴(kuò)增smn1基因的引物，檢測(cè)結(jié)果能夠區(qū)分外顯子8位點(diǎn)的smn1擴(kuò)增產(chǎn)物與smn2擴(kuò)增產(chǎn)物；

58、用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.22dupa?的引物組合3，用于特異擴(kuò)增突變模板；

59、用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.683t/a的引物組合4，用于特異擴(kuò)增突變模板；

60、用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的引物組合5，用于特異擴(kuò)增突變模板。

61、根據(jù)本發(fā)明，所述通用引物1和通用引物2的引物序列分別如seq?id?no.17和seqid?no.?18所示。

62、根據(jù)本發(fā)明，所述用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子7位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合1中，為提高引物的區(qū)分性及特異性，在能夠擴(kuò)增基因組中smn1基因但不擴(kuò)增smn2基因的引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，在能夠擴(kuò)增基因組中smn2基因但不擴(kuò)增smn1基因的引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，同時(shí)在擴(kuò)增smn2基因或smn1基因的特異性引物5’末端引入5-6個(gè)與smn基因完全不同源的堿基序列，在保證兩個(gè)基因片段完全區(qū)分的前提下，也確保了引物的特異性。

63、根據(jù)本發(fā)明，所述用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子8位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合1中，為提高引物的區(qū)分性及特異性，在能夠擴(kuò)增基因組中smn1基因但不擴(kuò)增smn2基因的引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，在能夠擴(kuò)增基因組中smn2基因但不擴(kuò)增smn1基因的引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，同時(shí)在擴(kuò)增smn2基因或smn1基因的特異性引物5’末端引入5-6個(gè)與smn基因完全不同源的堿基序列，在保證兩個(gè)基因片段完全區(qū)分的前提下，也確保了引物的特異性。

64、根據(jù)本發(fā)明，用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.22dupa?的引物組合3，在特異性上游引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，只特異性擴(kuò)增突變模板，而不會(huì)擴(kuò)增野生模板，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

65、根據(jù)本發(fā)明，用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.683t/a的引物組合4，在特異性上游引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，只特異性擴(kuò)增突變模板，而不會(huì)擴(kuò)增野生模板，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

66、根據(jù)本發(fā)明，用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的引物組合5，在特異性上游引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，只特異性擴(kuò)增突變模板，而不會(huì)擴(kuò)增野生模板，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

67、根據(jù)本發(fā)明，所述用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子7位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合1的核苷酸序列如seq?id?no.1、seq?id?no.?2和seq?id?no.?3所示。

68、根據(jù)本發(fā)明，所述用于特異性擴(kuò)增區(qū)分外顯子8位點(diǎn)的smn1、smn2的引物組合2的核苷酸序列如seq?id?no.4、seq?id?no.?5和seq?id?no.?6所示。

69、根據(jù)本發(fā)明，所述特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.22dupa?的引物組合3的核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.?8所示。

70、根據(jù)本發(fā)明，所述用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)c.683t/a的引物組合4的核苷酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.?10所示。

71、根據(jù)本發(fā)明，所述用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的引物組合5的核苷酸序列如seq?id?no.11和seq?id?no.?12所示。

72、根據(jù)本發(fā)明，所述內(nèi)參基因hbb的核苷酸序列如seq?id?no.13和seq?id?no.?14所示。

73、根據(jù)本發(fā)明，所述內(nèi)參基因rpp30的核苷酸序列如seq?id?no.15和seq?id?no.?16所示。

74、作為本發(fā)明的第三個(gè)方面，一種用于檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn拷貝數(shù)變異的計(jì)算方法，采用如上述任一項(xiàng)所述的試劑盒或采用如上述任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn的方法進(jìn)行檢測(cè)，

75、通過(guò)計(jì)算smn1或smn2的外顯子7或外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值，或，

76、通過(guò)計(jì)算smn1或smn2的外顯子7或外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值，或，

77、通過(guò)計(jì)算smn1或smn2的外顯子7或外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高和內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高之和的比值，或，

78、通過(guò)計(jì)算smn1的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn1的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，和/或，

79、通過(guò)計(jì)算smn1的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn1的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，和/或，

80、通過(guò)計(jì)算smn2的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn2的外顯子7的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，和/或，

81、通過(guò)計(jì)算smn2的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參hbb擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值與smn2的外顯子8的擴(kuò)增產(chǎn)物峰高與內(nèi)參rpp30擴(kuò)增產(chǎn)物峰高的比值之和，

82、確定smn1和/或smn2外顯子7和/或外顯子8的拷貝數(shù)；

83、通過(guò)統(tǒng)計(jì)c.22dupa、c.683t/a及位置的峰高情況，確定c.22dupa、c.683t/a及點(diǎn)突變情況。

84、根據(jù)本發(fā)明，所述計(jì)算方法的計(jì)算公式為：

85、。

86、作為本發(fā)明的第四個(gè)方面，上述所述的計(jì)算方法在精準(zhǔn)定量檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn高拷貝數(shù)中的應(yīng)用。

87、進(jìn)一步的，上述所述的計(jì)算方法在精準(zhǔn)定量檢測(cè)人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因smn大于4個(gè)拷貝數(shù)中的應(yīng)用。

88、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

89、1、本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種可以在一管中同時(shí)對(duì)smn1及smn2拷貝數(shù)變異、smn1微小變異、復(fù)合雜合突變及沉默攜帶者進(jìn)行檢測(cè)的方法。

90、由于在同一個(gè)反應(yīng)中除了需要檢測(cè)smn1基因的cnv、snp外，還需要同時(shí)檢測(cè)smn2基因的cnv，而smn1與smn2兩個(gè)基因的同源性極高，只有5個(gè)堿基的差異，因此本發(fā)明通過(guò)巧妙的引物設(shè)計(jì)，在特異性引物的3’末端引入了2~3個(gè)差異堿基，既保證了引物的擴(kuò)增效率，又保證了引物的特異性；除此之外，基于毛細(xì)管電泳需要通過(guò)片段大小來(lái)區(qū)分不同產(chǎn)物的原理，雖然毛細(xì)管電泳可以區(qū)分出1個(gè)堿基大小的片段差異，但是為避免因擴(kuò)增區(qū)域存在的單堿基插入缺失而導(dǎo)致的smn1與smn2片段重合的風(fēng)險(xiǎn)，在特異性引物5’末端引入了5-6個(gè)與smn基因完全不同源的堿基序列，在保證兩個(gè)基因片段的完全區(qū)分的前提下，也確保了引物的特異性。

91、2、提供了一種[2+0]型沉默攜帶者突變的便捷檢測(cè)方法

92、由于smn1基因的多態(tài)性位點(diǎn)與[2+0]型沉默攜帶者緊密關(guān)聯(lián)，即，當(dāng)受檢者smn1為2個(gè)拷貝，同時(shí)攜帶點(diǎn)突變時(shí)，該受檢者即為[2+0]型沉默攜帶者，基于此，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了基于熒光pcr-毛細(xì)管電泳的方法在同一體系中同時(shí)檢測(cè)smn1拷貝數(shù)及多態(tài)性位點(diǎn)，既不需要通過(guò)mlpa結(jié)合ngs這樣復(fù)雜的檢測(cè)方法，也不需要引入多個(gè)未有明確研究支持的分子遺傳標(biāo)記，既簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，也簡(jiǎn)化了多重?cái)U(kuò)增體系中的引物復(fù)雜度，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

93、3、提供了一種拷貝數(shù)變異的新型計(jì)算方法

94、不管是熒光定量pcr還是熒光pcr-毛細(xì)管電泳技術(shù)均是基于pcr技術(shù)而進(jìn)行，而pcr技術(shù)優(yōu)勢(shì)是高度靈敏，而正是由于經(jīng)過(guò)多個(gè)指數(shù)擴(kuò)增的循環(huán)后，也導(dǎo)致了可以將最初的差異高度放大，而這也給拷貝數(shù)的精準(zhǔn)定量帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。本發(fā)明設(shè)置了2個(gè)內(nèi)參，在校正加樣過(guò)程中誤差的同時(shí)，也起到互相補(bǔ)充校正的作用，而對(duì)照品則是校正板間差異的關(guān)鍵，兩者的選擇特別是內(nèi)參的選擇及計(jì)算方法對(duì)最終結(jié)果的準(zhǔn)確性起著非常重要的作用。本發(fā)明使用2個(gè)內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)各個(gè)靶基因的峰高值，并通過(guò)一種全新的算法，按如下公式分別計(jì)算各個(gè)基因的q值，根據(jù)q值即可判斷相應(yīng)基因的拷貝數(shù)：

95、。

96、4、提供了一種可以對(duì)更高拷貝數(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)定量的檢測(cè)方法

97、已發(fā)布的技術(shù)并不能區(qū)分大于4個(gè)拷貝的smn1/2拷貝數(shù)，只能籠統(tǒng)的將≥4作為一組，而本發(fā)明借助反應(yīng)體系設(shè)置及計(jì)算方法改進(jìn)，可以很好地區(qū)分出4個(gè)拷貝與5個(gè)拷貝的基因。

98、5、內(nèi)參的選擇與獨(dú)特的計(jì)算方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)0~5個(gè)拷貝的良好區(qū)分：雙內(nèi)參的選擇，起到互相補(bǔ)充校正的作用，解決了單內(nèi)參體系下高拷貝區(qū)分不佳的問(wèn)題；而雙內(nèi)參的計(jì)算方法也不同于常用的取靶標(biāo)與兩個(gè)內(nèi)參之和比值的計(jì)算方法，本發(fā)明采用兩個(gè)內(nèi)參分別計(jì)算后取和的計(jì)算方法，可以很好的解決因其中一個(gè)內(nèi)參結(jié)果異常，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果偏差被放大，進(jìn)而導(dǎo)致區(qū)分性不佳的問(wèn)題。