本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種雙環(huán)核苷類似物(經(jīng)修飾的核苷酸單體)在核酸干擾(rnai)藥物分子中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、rna干擾于1998年首次被發(fā)現(xiàn)并命名，指雙鏈rna(dsrna)在細(xì)胞內(nèi)特異性誘導(dǎo)與之同源的mrna降解，使相應(yīng)基因表達(dá)量下調(diào)，導(dǎo)致相應(yīng)基因在轉(zhuǎn)錄后的沉默。

2、從基因水平上，通過rnai幾乎可以治療所有的疾病，包括腫瘤、傳染病、遺傳性疾病等等，因而rnai已成為最熱門的生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域，也是未來最有發(fā)展前景的新藥開發(fā)方向。目前已有9款反義寡聚核酸(aso)藥物和6款sirna藥物進(jìn)入了臨床應(yīng)用。在抗感染、代謝和遺傳性治療方面發(fā)揮著獨特的作用。

3、rna干擾(rnai)現(xiàn)象是生物體本身具有的調(diào)控基因表達(dá)的方式，用來描述雙鏈rnai(dsrnai)可以阻斷基因的表達(dá)。sirna響應(yīng)機(jī)制是以一種核酸內(nèi)切酶復(fù)合物為特征介導(dǎo)的rna干擾方式，該核酸內(nèi)切酶復(fù)合物通常稱為rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(risc)。risc通過結(jié)合來自sirna反義鏈與靶基因mrna互補(bǔ)性配對的捕合，來對靶基因mrna進(jìn)行降解。

4、作為一個全新藥物治療機(jī)制，sirna優(yōu)點在于它可以靶向致病基因組中的靶基因，有著強(qiáng)力和持久的作用療效，可以顯著降低給藥頻率，提高患者用藥的依從性，從而達(dá)到更好的治療效果和更優(yōu)的安全性。

5、然而，sirna療法在開發(fā)中也遇到了獨特的挑戰(zhàn)。寡聚核酸類物質(zhì)靶向遞送、潛在脫靶效應(yīng)和體內(nèi)穩(wěn)定性曾是rnai藥物發(fā)展的三大挑戰(zhàn)。隨著過去十年來galnac技術(shù)和修飾技術(shù)的迭代開發(fā)，肝靶向遞送和體內(nèi)穩(wěn)定性問題已經(jīng)得到了解決和提高，但因脫靶帶潛在的安全風(fēng)險影響著sirna藥物研發(fā)。

6、現(xiàn)有的報道表明，rnai脫靶效應(yīng)的一個主要原因是與靶點mrna結(jié)合的sirna序列中的一部分片段可能起到像微rna(mirna)一樣的功能，它們可以與其它mrna的3’-端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’-utr)相結(jié)合，抑制mrna的翻譯和穩(wěn)定性。而mirna主要通過種子區(qū)域(5'-末端的位置2-8位)與靶mrna之間的堿基配對識別靶基因，由sirna引起的脫靶效應(yīng)主要源自sirna的反義鏈種子區(qū)域與一個或多個mrna的堿基互補(bǔ)性。種子區(qū)域的序列能夠影響多種基因的表達(dá)，成為rnai藥物副作用的主要因素。

7、為了有效解決種子區(qū)的脫靶效應(yīng)，alnylam通過對位于種子區(qū)的核苷酸單體進(jìn)行修飾，找到了一類新型核苷單體(甘油核酸，glycerol?nucleic?acid，簡稱gna)，引入到sirna反義鏈中的種子區(qū)后，能夠減低rnai的脫靶效應(yīng)，提高藥物的安全性。參見例如pct公開號wo2018098328a1。

8、本發(fā)明需要開發(fā)一種新的核苷酸類似物，摻入雙鏈rna后有助于降低脫靶毒性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過提供一種新的核苷酸類似物解決上述問題。

2、本發(fā)明涉及的新型修飾核苷酸能為rnai藥物分子提高對靶基因沉默的選擇性，降低脫靶效應(yīng)。

3、本發(fā)明所述的修飾核苷酸能改善rnai藥物分子的成藥性。在一些實施方式中，本發(fā)明所述的修飾核苷酸可增強(qiáng)sirna分子中反義鏈降解靶基因的選擇性。在一些實施方式中，本發(fā)明所述的修飾核苷酸引入到sirna分子中對藥效沒有降低。因此，本發(fā)明所述的修飾核苷酸對于sirna沉默，可增強(qiáng)其發(fā)揮藥效作用的安全性。

4、術(shù)語：

5、如本發(fā)明所用，術(shù)語“c1-6烷基”指飽和脂肪族烴基團(tuán)，其為含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實施例則包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基等。烷基可以是取代的或非取代的，當(dāng)被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基優(yōu)選為一個或多個以下基團(tuán)，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)烷硫基、氧基、羧基或羧酸酯基。

6、如本發(fā)明所用，術(shù)語“鹵代烷基”指被一個或多個鹵素取代的烷基，其中烷基如上所定義。

7、如本發(fā)明所用，術(shù)語“c1-6烷氧基”指-o-(烷基)或者-o-(鹵代烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基、環(huán)己氧基。烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個以下基團(tuán)，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)烷硫基、羧基或羧酸酯基。

8、如本發(fā)明所用，術(shù)語“c2-6烯基”指具有2至6個碳原子和至少一個碳碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基團(tuán)。其包括：乙烯基(c2)、1-丙烯基(c3)、2-丙烯基(c3)、1-丁烯基(c4)、2-丁烯基(c4)、丁二烯基(c4)、戊烯基(c5)、戊二烯基(c5)、己烯基(c6)以及雜烯基(其中一個或者多個碳原子被雜原子取代，如硼、氮、氧、硅、磷、硫)。烯基基團(tuán)可以被一個或多個取代基任選取代。

9、“c2-6炔基”指具有2至6個碳原子和至少一個碳碳叁鍵以及任選的一個或者多個碳碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基團(tuán)。其包括：乙炔基(c2)、1-丙炔基(c3)、2-丙炔基(c3)、1-丁炔基(c4)、2-丁炔基(c4)、戊炔基(c5)、己炔基(c6)以及雜炔基(其中一個或者多個碳原子被雜原子取代，如硼、氮、氧、硅、磷、硫)。炔基基團(tuán)可以被一個或多個取代基任選取代。

10、術(shù)語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14元全碳單環(huán)或稠合多環(huán)(也就是共享毗鄰碳原子對的環(huán))基團(tuán)，優(yōu)選為6至10元，例如苯基和萘基。芳基可以是取代的或非取代的，當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個以下基團(tuán)，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷硫基、雜環(huán)烷硫基、羧基或羧酸酯基。

11、術(shù)語“羥基”指-oh基團(tuán)。

12、術(shù)語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

13、術(shù)語“氨基”指-nh2。

14、術(shù)語“氰基”指-cn。

15、術(shù)語“硝基”指-no2。

16、術(shù)語“羰基”指＝o。

17、術(shù)語“羧基”指-c(o)oh。

18、術(shù)語“巰基”指-sh。

19、術(shù)語“酯基”指-c(o)o(烷基)或-c(o)o(環(huán)烷基)，其中烷基和環(huán)烷基如上所定義。

20、術(shù)語“?；敝负?c(o)r基團(tuán)的化合物，其中r為烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基。

21、術(shù)語“任選”或“任選地”意味著隨后所描述的事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，該說明包括該事件或環(huán)境發(fā)生或不發(fā)生的場合。例如，“任選被烷基取代的雜環(huán)基團(tuán)”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環(huán)基團(tuán)被烷基取代的情形和雜環(huán)基團(tuán)不被烷基取代的情形。

22、術(shù)語“取代的”指基團(tuán)中的一個或多個氫原子，優(yōu)選為最多5個，更優(yōu)選為1～3個氫原子彼此獨立地被相應(yīng)數(shù)目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學(xué)位置，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過現(xiàn)有技術(shù)手段和實驗條件下(通過實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結(jié)合時可能是不穩(wěn)定的。

23、如本發(fā)明所用，“小核酸”是含有約10-50個單鏈核苷酸或雙鏈核苷酸堿基對的寡聚核苷酸序列。在一些實施方式中，小核酸具有與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的靶基因核心序列至少部分互補(bǔ)的核堿基序列。在一些實施方式中，寡核苷酸在遞送至表達(dá)基因的細(xì)胞后，能調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)。靶基因表達(dá)可以在體外或體內(nèi)被調(diào)控?！靶『怂帷卑ǖ幌抻冢汗押塑账帷捂湽押塑账?、單鏈反義寡核苷酸、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、核酶、干擾性rna分子和dicer酶底物。

24、如本發(fā)明所用，術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”是指連接的核苷的聚合物，其中每一個核苷可獨立地被修飾或不被修飾。

25、如本發(fā)明所用，“rnai藥物”是指含有能夠以序列特異性方式降低或抑制信使rna(mrna)翻譯的rna或rna類(例如化學(xué)修飾的rna)寡核苷酸分子。

26、如本發(fā)明所用，rnai藥物可以通過rna干擾機(jī)制(例如通過與哺乳動物細(xì)胞的mrna干擾通路機(jī)制(rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合物risc)的相互作用來誘導(dǎo)mrna降解)、或其它任意機(jī)制或通路發(fā)揮作用。雖然認(rèn)為本發(fā)明所用的術(shù)語rnai藥物主要通過rna干擾機(jī)制發(fā)揮作用，但所述rnai藥物并不受限于或局限于任何特定的作用通路或機(jī)制。rnai藥物包括但不限于：單鏈寡核苷酸、單鏈反義寡核苷酸、短干擾rna(sirna)、雙鏈rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短發(fā)夾rna(shrna)和dicer酶底物。本發(fā)明所述的rnai藥物由具有與作為靶標(biāo)的mrna至少部分互補(bǔ)的寡核苷酸鏈構(gòu)成。在一些實施方式中，本發(fā)明所述的rnai藥物是雙鏈的，且由反義鏈和與該反義鏈至少部分互補(bǔ)的正義鏈構(gòu)成。

27、如本發(fā)明所用，術(shù)語“反義鏈”是指sirna的這樣一條鏈，所述鏈包含與靶序列完全、充分或基本互補(bǔ)的區(qū)域。術(shù)語“正義鏈”是指sirna的這樣一條鏈，所述鏈包括與作為在此定義的術(shù)語反義鏈的區(qū)域完全、充分或基本互補(bǔ)的區(qū)域。

28、如本發(fā)明所用，術(shù)語“互補(bǔ)區(qū)域”是指反義鏈上與靶mrna序列完全、充分或基本互補(bǔ)的區(qū)域。在互補(bǔ)區(qū)域與靶序列不完全互補(bǔ)的情況下，錯配可以位于分子的內(nèi)部或末端區(qū)域中。通常，最耐受的錯配位于末端區(qū)域中，例如在5’-和/或3’-端的5、4、3、2或1個核苷酸內(nèi)。對錯配最敏感的反義鏈部分被稱為“種子區(qū)”。例如，在包含19nt的鏈的sirna中，第19個位置(從5’向3’)可以耐受一些錯配。

29、如本發(fā)明所用，術(shù)語“互補(bǔ)”在用于描述第一核苷酸序列(例如rnai藥物正義鏈或靶標(biāo)mrna)和第二核苷酸序列(例如單鏈反義寡核苷酸或雙鏈rnai藥物反義鏈)之間的關(guān)系，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸在某些條件下雜交(在哺乳動物生理條件下或類似的體外條件下)形成堿基配對并形成雙鏈體或雙螺旋結(jié)構(gòu)的能力?；パa(bǔ)序列包含沃森-克里克堿基配對或非沃森-克里克堿基配對，且包含天然或修飾的核苷酸或核苷酸類似物，其程度至少能滿足上述雜交的要求。例如，就確定相同性或互補(bǔ)性的目的而言，單體a和af與u(或t)互補(bǔ)，并且等同于a。

30、如本發(fā)明所用，術(shù)語“沉默”、“減少”、“抑制”、“下調(diào)”、或“敲減”指給定的基因表達(dá)時，用本發(fā)明所述的rnai藥物分子處理細(xì)胞、組織、器官或動物體內(nèi)直接給藥時，與未經(jīng)如此處理的細(xì)胞、組織、器官或動物體內(nèi)給藥相比，基因的表達(dá)水平有所減少或降低。

31、如本發(fā)明所用，術(shù)語“序列”或“核苷酸序列”是指核堿基或核苷酸的順序或次序，使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法以字母順序表示。

32、如本發(fā)明所用，術(shù)語“核苷”是由核苷酸堿基或核堿基、以及核糖或脫氧核糖兩種物質(zhì)組成的化合物；術(shù)語“核苷酸”則是由核苷酸堿基或核堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物，“寡核苷酸”是指例如少于100個核苷酸長度的核酸分子。

33、如本發(fā)明所用，“核苷酸堿基”或“核堿基”是雜環(huán)嘧啶或嘌呤化合物，其中常規(guī)核酸的標(biāo)準(zhǔn)組分，包括腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)常規(guī)核苷酸的堿基。核堿基可以被修飾或被新型非常規(guī)核堿基替代。

34、如本發(fā)明所用，術(shù)語“雜環(huán)堿基部分”是本發(fā)明所定義的新型核堿基或修飾核堿基。在一些實施方式中，雜環(huán)堿基部分是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤以及含氮雜環(huán)。在一些實施方式中，雜環(huán)堿基部分是非常規(guī)的嘌呤或取代的嘌呤。在一些實施方式中，雜環(huán)堿基部分是非常規(guī)的嘧啶或取代的嘧啶。在一些實施方式中，雜環(huán)堿基部分含有非天然五元含氮雜環(huán)。在一些實施方式中，尤其是當(dāng)本發(fā)明所述的5’-修飾核苷酸是亞磷酰胺化合物時，雜環(huán)堿基部分可以包含一個或多個保護(hù)基團(tuán)。

35、如本發(fā)明所用，“核糖基替代性基團(tuán)”是指能夠取代天然存在的核糖核苷酸的五元呋喃糖環(huán)的結(jié)構(gòu)，例如嗎啉基、環(huán)己烯基、環(huán)己六醇、或開環(huán)的結(jié)構(gòu)等。

36、如本發(fā)明所用，“反應(yīng)性磷基團(tuán)”是指包含在核苷酸單元中或核苷酸類似物單元中的活性含磷基團(tuán)，其可以通過親核攻擊反應(yīng)，與另一個分子中、尤其是另一個核苷酸單元中或另一個核苷酸類似物中的羥基或者胺基反應(yīng)。通常，這樣的反應(yīng)產(chǎn)生將所述第一個核苷酸單元或所述第一個核苷酸類似物單元與所述第二個核苷酸單元或所述第二個核苷酸類似物單元連接的酯型核苷間鍵。反應(yīng)性磷基團(tuán)可選自亞磷酰胺，h-膦酸酯，烷基-膦酸酯，磷酸酯或磷酸酯模擬物，包括但不限于：天然磷酸酯、硫代磷酸脂、雙硫代磷酸脂、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸脂、膦酸酯、鹵素取代的膦酸酯和磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、二磷酸酯和三磷酸酯，優(yōu)選-p(och2ch2cn)(n(ipr)2)。

37、如本發(fā)明所用，“保護(hù)基團(tuán)”是指本領(lǐng)域已知的用于防止反應(yīng)性基團(tuán)(例如羥基、氨基、羧基和巰基)在合成過程中發(fā)生不希望反應(yīng)的不穩(wěn)定的化學(xué)部分。保護(hù)基團(tuán)通常選擇性和/或正交地用于在反應(yīng)中的其它反應(yīng)性位點保護(hù)位點，并且隨后被除去而釋放出未保護(hù)的基團(tuán)，使其能夠用于進(jìn)一步反應(yīng)。在一些實施方式中，“取代的”基團(tuán)或取代基包含保護(hù)基團(tuán)。

38、“羥基保護(hù)基”是指能夠避免羥基遭受化學(xué)反應(yīng)，又可以在特定條件下脫除以恢復(fù)羥基的基團(tuán)。主要包括硅烷型保護(hù)基、?；捅Ｗo(hù)基或醚類保護(hù)基，優(yōu)選如下：三甲基硅基(tms)、三乙基硅基(tes)、二甲基異丙基硅基(dmips)、二乙基異丙基硅基(deips)、叔丁基二甲基硅基(tbdms)、叔丁基二苯基硅基(tbdps)、三異丙基硅基(tips)、乙?；?ac)、氯乙?；?、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基(tfa)、苯甲?；?bz)、對甲氧基苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、烯丙氧羰基(alloc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(troc)、芐氧羰基(cbz)、叔丁氧羰基(boc)、苯甲基(bn)、對甲氧芐基(pmb)、烯丙基、三苯基甲基(tr)、對甲氧基三苯基甲基(mmtr)、雙對甲氧基三苯基甲基(dmtr)、甲氧基甲基(mom)、苯氧基甲基(bom)、2，2，2-三氯乙氧羰基、2-甲氧基乙氧基甲基(mem)、甲硫基甲基(mtm)、對甲氧基芐氧基甲基(pmbm)。

39、當(dāng)本發(fā)明所述的化合物(例如在烯烴或亞胺)含有雙鍵時，旨在表示該化合物同時包含e和z幾何異構(gòu)體或者順式和反式異構(gòu)體。同樣地，也旨在包括所有互變異構(gòu)形式，其為分子中某一原子在兩個位置迅速移動而產(chǎn)生的官能團(tuán)異構(gòu)體。在不同的互變異構(gòu)形式存在的化合物，一個所述化合物并不局限于任何特定的互變異構(gòu)體，而是旨在涵蓋所有的互變異構(gòu)形式。本發(fā)明中出現(xiàn)的任何鍵的構(gòu)型圖示只是出于方便而選擇的，不旨在限制特定的構(gòu)型，除非文中另有說明。

40、本發(fā)明化合物可包括一個或者多個不對稱中心，且因此可以存在多種立體異構(gòu)形式，例如對映異構(gòu)體和/或非對映異構(gòu)體。例如，本發(fā)明化合物可為單獨的對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體(如順式和反式異構(gòu)體)，或者可為立體異構(gòu)體的混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一種或者多種立體異構(gòu)體的混合物。異構(gòu)體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從混合物中分離，所述方法包括：手性高壓液相色譜法(hplc)以及手性鹽的形成和結(jié)晶；或者優(yōu)選的異構(gòu)體可通過不對稱合成來制備。

41、本發(fā)明所述的化合物和組合物可以具有處于質(zhì)子化或脫質(zhì)子化狀態(tài)的某些原子(例如n、o或s原子)，這取決于該化合物或組合物所處的環(huán)境。因此，如本發(fā)明所用，本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)考慮到某些官能團(tuán)、例如oh、sh或nh可以質(zhì)子化或脫質(zhì)子化。本發(fā)明的公開內(nèi)容旨在涵蓋上述的化合物和組合物，而無論它們的基于環(huán)境ph的質(zhì)子化狀態(tài)如何，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解的。

42、術(shù)語“藥物組合物”表示含有一種或多種本發(fā)明所述化合物或其生理條件下可藥用的鹽或前體藥物與其他化學(xué)組分的混合物，以及其他組分例如生理條件下可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。

43、本發(fā)明還包括同位素標(biāo)記的化合物(同位素變體)，它們等同于式(i)所述的那些，但一個或多個原子被原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界常見的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子取代?？梢砸氡景l(fā)明化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別例如2h、3h、13c、11c、14c、15n、18o、17o、31p、32p、35s、18f、36cl。含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的本發(fā)明化合物、其前體藥物和所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽都屬于本發(fā)明的范圍。某些同位素標(biāo)記的本發(fā)明化合物、例如引入放射性同位素(例如3h和14c)的那些可用于藥物和/或底物組織分布測定。氚、即3h和碳-14、即14c同位素是優(yōu)選的，它們?nèi)菀字苽浜蜋z測。進(jìn)而，被更重的同位素取代，例如氘、即2h(d)，由于代謝穩(wěn)定性更高可以提供治療上的益處，例如延長體內(nèi)半衰期或減少劑量需求，因而在某些情況下是優(yōu)選的。同位素標(biāo)記的本發(fā)明式(i)化合物及其前體藥物一般可以這樣制備，在進(jìn)行下述流程和/或?qū)嵤├c制備例所公開的工藝時，用容易得到的同位素標(biāo)記的試劑代替非同位素標(biāo)記的試劑。

44、一方面，本發(fā)明提供了一種化合物作為修飾核苷酸單體的應(yīng)用，所述應(yīng)用為修飾rnai分子；

45、所述化合物具有通式i的結(jié)構(gòu)：

46、

47、其中：

48、x選自o或s或-ch2-，優(yōu)選為o；

49、y選自o或s或-ch2-，優(yōu)選為o或-ch2-；

50、r1和r2獨立地選自h、d、鹵素、-cn、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、-ora、-c(o)ra、-c(o)ora、-oc(o)ra、-nrarb、-c(o)nrarb、-nrac(o)rb、-nrac(o)orb；

51、ra和rb獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

52、b1是h或p1、或是連接至另一核苷酸或寡核苷酸核糖2’或3’端的磷酸磷原子的化學(xué)鍵，優(yōu)選為p1；

53、p1為羥基保護(hù)基，例如：三甲基硅基(tms)、三乙基硅基(tes)、二甲基異丙基硅基(dmips)、二乙基異丙基硅基(deips)、叔丁基二甲基硅基(tbdms)、叔丁基二苯基硅基(tbdps)、三異丙基硅基(tips)、乙酰基(ac)、氯乙酰基、二氯乙?；?、三氯乙?；?、三氟乙?；?tfa)、苯甲?；?bz)、對甲氧基苯甲?；?-芴基甲氧基羰基(fmoc)、烯丙氧羰基(alloc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(troc)、芐氧羰基(cbz)、叔丁氧羰基(boc)、苯甲基(bn)、對甲氧芐基(pmb)、烯丙基、三苯基甲基(tr)、對甲氧基三苯基甲基(mmtr)、雙對甲氧基三苯基甲基(dmtr)、甲氧基甲基(mom)、苯氧基甲基(bom)、2，2，2-三氯乙氧羰基、2-甲氧基乙氧基甲基(mem)、甲硫基甲基(mtm)、對甲氧基芐氧基甲基(pmbm)。優(yōu)選為4,4’-二甲氧基三苯甲基(dmtr)；

54、b2是h或p2、或是連接至另一核苷酸或寡核苷酸核糖2’或3’端的磷酸磷原子的化學(xué)鍵，優(yōu)選為p2；

55、p2為反應(yīng)性磷基團(tuán)，例如亞磷酰胺，h-膦酸酯，烷基-膦酸酯，磷酸酯或磷酸酯模擬物，例如天然磷酸酯、硫代磷酸脂、雙硫代磷酸脂、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸脂、膦酸酯、鹵素取代的膦酸酯和磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、二磷酸酯和三磷酸酯，優(yōu)選-p(och2ch2cn)(n(ipr)2)。

56、base選自h、修飾或者未修飾的雜環(huán)堿基或離去基，優(yōu)選修飾或未修飾的尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)、腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)和胞嘧啶(c)；

57、n獨立地選自0-2；優(yōu)選為0或1；

58、一種雙鏈rna分子或者其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體，其包括正義鏈和反義鏈，其中各鏈具有14至30個核苷酸，并且所述反義鏈的特定位置包含一個或者多個式(iv)或者式(v)所示的核苷酸單體：

59、

60、其中，

61、所示核苷酸單體以5’→3’的順序從到---連接；

62、各基團(tuán)如權(quán)利要求1-9中任一項所定義；

63、優(yōu)選地，所述核苷酸單體選自：

64、

65、其中，base選自

66、x

67、在一個實施方案中，x為o；在另一個實施方案中，x為s；在另一個實施方案中，x為-ch2-。

68、y

69、在一個實施方案中，y為o；在另一個實施方案中，y為s；在另一個實施方案中，y為-ch2-。

70、r1

71、在一個實施方案中，r1為h；在另一個實施方案中，r1為d；在另一個實施方案中，r1為鹵素；在另一個實施方案中，r1為-cn；在另一個實施方案中，r1為c1-6烷基；在另一個實施方案中，r1為c1-6鹵代烷基；在另一個實施方案中，r1為c2-6烯基；在另一個實施方案中，r1為c2-6炔基；在另一個實施方案中，r1為-ora；在另一個實施方案中，r1為-c(o)ra；在另一個實施方案中，r1為-c(o)ora；在另一個實施方案中，r1為-oc(o)ra、-nrarb；在另一個實施方案中，r1為-c(o)nrarb；在另一個實施方案中，r1為-nrac(o)rb；在另一個實施方案中，r1為-nrac(o)orb；

72、每個ra獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

73、每個rb獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

74、r2

75、在一個實施方案中，r2為h；在另一個實施方案中，r2為d；在另一個實施方案中，r2為鹵素；在另一個實施方案中，r2為-cn；在另一個實施方案中，r2為c1-6烷基；在另一個實施方案中，r2為c1-6鹵代烷基；在另一個實施方案中，r2為c2-6烯基；在另一個實施方案中，r2為c2-6炔基；在另一個實施方案中，r2為-ora；在另一個實施方案中，r2為-c(o)ra；在另一個實施方案中，r2為-c(o)ora；在另一個實施方案中，r2為-oc(o)ra、-nrarb；在另一個實施方案中，r2為-c(o)nrarb；在另一個實施方案中，r2為-nrac(o)rb；在另一個實施方案中，r2為-nrac(o)orb；

76、每個ra獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

77、每個rb獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

78、b1和b2

79、在一個實施方案中，b1為h；在另一個實施方案中，b1為p1；在另一個實施方案中，b1為連接至另一核苷酸或寡核苷酸核糖2’或3’端的磷酸磷原子的化學(xué)鍵；

80、在一個實施方案中，b2為h；在另一個實施方案中，b2為p2；在另一個實施方案中，b2為連接至另一核苷酸或寡核苷酸核糖2’或3’端的磷酸磷原子的化學(xué)鍵；

81、p1和p2

82、在一個實施方案中，p1為保護(hù)基；在另一個實施方案中，p1為羥基保護(hù)基，例如三甲基硅基(tms)、三乙基硅基(tes)、二甲基異丙基硅基(dmips)、二乙基異丙基硅基(deips)、叔丁基二甲基硅基(tbdms)、叔丁基二苯基硅基(tbdps)、三異丙基硅基(tips)、乙酰基(ac)、氯乙酰基、二氯乙?；⑷纫阴；?、三氟乙?；?tfa)、苯甲酰基(bz)、對甲氧基苯甲?；?-芴基甲氧基羰基(fmoc)、烯丙氧羰基(alloc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(troc)、芐氧羰基(cbz)、叔丁氧羰基(boc)、苯甲基(bn)、對甲氧芐基(pmb)、烯丙基、三苯基甲基(tr)、對甲氧基三苯基甲基(mmtr)、雙對甲氧基三苯基甲基(dmtr)、甲氧基甲基(mom)、苯氧基甲基(bom)、2，2，2-三氯乙氧羰基、2-甲氧基乙氧基甲基(mem)、甲硫基甲基(mtm)、對甲氧基芐氧基甲基(pmbm)、-p(och2ch2cn)(n(ipr)2)，優(yōu)選dmtr。

83、在一個實施方案中，p2為反應(yīng)性磷基團(tuán)，例如例如亞磷酰胺，h-膦酸酯，烷基-膦酸酯，磷酸酯或磷酸酯模擬物，例如天然磷酸酯、硫代磷酸脂、雙硫代磷酸脂、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸脂、膦酸酯、鹵素取代的膦酸酯和磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、二磷酸酯和三磷酸酯，優(yōu)選-p(och2ch2cn)(n(ipr)2)。

84、base

85、在一個實施方案中，base為h；在另一個實施方案中，base為修飾或者未修飾的雜環(huán)堿基或離去基，例如優(yōu)選修飾或未修飾的u、t、a、g、c。

86、在一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為在另一個更具體地實施方案中，base為

87、n

88、在一個實施方案中，n為0；在另一個實施方案中，n為1；在另一個實施方案中，n為2。

89、以上任一具體實施方案中的任一技術(shù)方案或其任意組合，可以與其他具體實施方案中的任一技術(shù)方案或其任意組合進(jìn)行組合。本發(fā)明旨在包括所有這些技術(shù)方案的組合，

90、本發(fā)明具體涉及以下技術(shù)方案：

91、1.一種化合物作為修飾核苷酸單體的應(yīng)用，其特征在于，

92、用于修飾rnai分子；

93、所述化合物具有通式i的結(jié)構(gòu)：

94、

95、其中：

96、x選自o或s或-ch2-，優(yōu)選為o；

97、y選自o或s或-ch2-，優(yōu)選為o或-ch2-；

98、r1和r2獨立地選自h、d、鹵素、-cn、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、-ora、-c(o)ra、-c(o)ora、-oc(o)ra、-nrarb、-c(o)nrarb、-nrac(o)rb、-nrac(o)orb；

99、ra和rb獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

100、b1是h或p1、或是連接至另一核苷酸或寡核苷酸核糖2’或3’端的磷酸磷原子的化學(xué)鍵，優(yōu)選為p1；

101、p1為羥基保護(hù)基，優(yōu)選為4,4’-二甲氧基三苯甲基(dmtr)；

102、b2是h或p2、或是連接至另一核苷酸或寡核苷酸核糖2’或3’端的磷酸磷原子的化學(xué)鍵，優(yōu)選為p2；

103、p2為反應(yīng)性磷基團(tuán)，優(yōu)選-p(och2ch2cn)(n(ipr)2)；

104、base選自h、修飾或者未修飾的雜環(huán)堿基或離去基，優(yōu)選修飾或未修飾的尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)、腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)和胞嘧啶(c)；

105、n獨立地選自0-2；優(yōu)選為0或1；

106、2.技術(shù)方案1所述的應(yīng)用，其為式(ii)或式(iii)的結(jié)構(gòu)或其立體異構(gòu)體

107、

108、其中，各基團(tuán)如權(quán)利要求1所定義；

109、3.技術(shù)方案所述的化合物，x選自o或s或-ch2-，優(yōu)選為o；

110、4.技術(shù)方案2-3所述的化合物，y選自o或s或-ch2-，優(yōu)選為o或-ch2-；

111、5.技術(shù)方案2-4所述的化合物，n獨立地選自0-2；優(yōu)選為0或1；

112、6.技術(shù)方案2-5所述的化合物，r1選自h、d、鹵素、-cn、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、-ora、-c(o)ra、-c(o)ora、-oc(o)ra、-nrarb、-c(o)nrarb、-nrac(o)rb、-nrac(o)orb；

113、ra和rb獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

114、優(yōu)選地，r1為h；

115、7.技術(shù)方案2-6所述的化合物，r2選自h、d、鹵素、-cn、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、-ora、-c(o)ra、-c(o)ora、-oc(o)ra、-nrarb、-c(o)nrarb、-nrac(o)rb、-nrac(o)orb；

116、ra和rb獨立地選自h、d、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c2-6烯基、c2-6炔基；

117、優(yōu)選地，r2為h；

118、8.技術(shù)方案2-7所述的化合物，base為h、修飾或者未修飾的雜環(huán)堿基或離去基。

119、優(yōu)選地，

120、base選自其中pg為氨基保護(hù)基團(tuán)；

121、更優(yōu)選地，base選自

122、9.技術(shù)方案1-8所述的化合物，選自：

123、

124、其中，base如技術(shù)方案1-8中任一項定義，優(yōu)選為

125、10.一種雙鏈rna分子或者其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體，其包括正義鏈和反義鏈，其中各鏈具有14至30個核苷酸，并且所述反義鏈的特定位置包含一個或者多個式(iv)或者式(v)所示的核苷酸單體：

126、

127、其中，

128、所示核苷酸單體以5’→3’的順序從到---連接；

129、各基團(tuán)如技術(shù)方案1-9中任一項所定義；

130、優(yōu)選地，所述核苷酸單體選自：

131、

132、其中，base選自

133、11.技術(shù)方案10的雙鏈rna分子，其中所述正義鏈和反義鏈各自具有19至25個核苷酸。

134、12.技術(shù)方案10-11的雙鏈rna分子，其中所述核苷酸單體位于該反義鏈5’-端的2-8位，優(yōu)選5-8位，再優(yōu)選第6或7位，更優(yōu)選第7位。

135、13.技術(shù)方案10-12的任一項雙鏈rna分子，其中所述雙鏈rna相比于具有相同序列但不包含權(quán)利要求10所述核苷酸單體的雙鏈rna分子，顯示降低的熱力學(xué)穩(wěn)定性。

136、14.技術(shù)方案10-13的任一項雙鏈rna分子，其中所述雙鏈rna相比于具有相同序列但不包含權(quán)利要求10所述核苷酸單體的雙鏈rna分子，顯示降低的脫靶毒性。

137、15.技術(shù)方案10-14的任一項雙鏈rna分子，其中所述雙鏈rna相比于具有相同序列但不包含權(quán)利要求10所述核苷酸單體的雙鏈rna分子，顯示增強(qiáng)的有效性。

138、16.技術(shù)方案10-15的任一項雙鏈rna分子，其中所述反義鏈具有與所述正義鏈和靶標(biāo)mrna完全互補(bǔ)的序列，并具有與ago2結(jié)合形成沉默復(fù)合體的能力。

139、17.技術(shù)方案10-16的任一項雙鏈rna分子，其中所述反義鏈具有與所述正義鏈和靶標(biāo)mrna完全互補(bǔ)的序列，并具有誘導(dǎo)正義鏈和靶標(biāo)mrna降解的能力。

140、18.技術(shù)方案10-17的任一項雙鏈rna分子，其中所述正義鏈和反義鏈包含5’-和/或3’-懸端(overhang)。

141、19.技術(shù)方案10-18的任一項雙鏈rna分子，其中雙鏈rna偶聯(lián)至配體，優(yōu)選地，該配體包含一個或多個galnac。

142、20.一種核酸分子，所述核酸分子地核苷酸序列中包含一個或者多個權(quán)利要求10所述的核苷酸單體。

143、21.技術(shù)方案20的核酸分子，所述核酸分子是單鏈或者雙鏈的。

144、22.技術(shù)方案20的核酸分子，所述核酸分子是線性或者環(huán)狀的。

145、23.技術(shù)方案20的核酸分子，其中所述核酸選自dna、rna或者dna/rna雜合體。

146、24.技術(shù)方案20-23中任一項的核酸分子，其中所述核酸分子選自小干擾rna(sirna)或者短發(fā)夾rna(shrna)。

147、25.一種藥物組合，其包含技術(shù)方案10-19所述的雙鏈rna分子，和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

148、26.一種抑制細(xì)胞中靶基因的表達(dá)的方法，其包括權(quán)利要求10-19的任一項所述的雙鏈rna分子和將其引入細(xì)胞的步驟。

149、27.一種用于降低細(xì)胞中脫靶毒性的方法，其包括權(quán)利要求10-19的任一項所述的雙鏈rna分子和將其引入細(xì)胞的步驟。

150、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

151、本發(fā)明在sirna的反義鏈種子區(qū)通過特定的2',5'-磷酸酯鏈接引入所述的核苷酸單體，顯著降低反義鏈種子區(qū)帶來的潛在的脫靶效應(yīng)，從而使sirna對靶基因mrna進(jìn)行更高選擇地沉默，更大sirna治療的安全窗口，從而有效治療因靶基因mrna引起的相關(guān)疾病。