本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種長效胰島素類似物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胰島素是第一個被測序的蛋白質(zhì)分子，胰島素一直是專家和學(xué)者研究的熱點。胰島素突變體的研究是現(xiàn)代蛋白質(zhì)工程的一個重要研究方向，特別是胰島素藥用突變體的研究已成為一個研究熱點。

2、胰島素是一種由人體胰腺分泌的調(diào)節(jié)血糖的激素。它的功能是將血液中多余的葡萄糖轉(zhuǎn)移到細胞，為細胞提供能量，并將血糖水平維持在正常水平。胰島素能夠?qū)⑻悄虿』颊叩难撬娇刂圃谡Ｋ健?/p>

3、隨著重組蛋白制造技術(shù)的發(fā)展，多種胰島素產(chǎn)品已被投放市場?，F(xiàn)有胰島素產(chǎn)品具有短效的缺陷，且施用后半小時后才可以進食，嚴重造成不便。因此，改造胰島素分子對糖尿病治療藥物的研發(fā)意義重大。

4、胰島素包括胰島素a鏈和胰島素b鏈，目前想要延長作用時間，就需要對胰島素a鏈和胰島素b鏈同時進行改造，獲得長效的胰島素類似物，但工作量大。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為開發(fā)一種作用時間延長且制備工藝簡單的長效胰島素類似物，本發(fā)明提供了一種長效胰島類似物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過僅將胰島素b鏈進行位點突變獲得胰島素b鏈突變體，從而獲得長效胰島類似物，在分子的水平上消除了酶降解的敏感位點，特別是消除了胰蛋白酶的酶切位點，使得胰島素分子的活性能夠最大程度的保持，從而達到長效的目的，制備工藝簡單。

2、本發(fā)明提供了一種長效胰島素類似物，所述長效胰島類似物包括胰島素a鏈和胰島素b鏈突變體；

3、所述胰島素b鏈突變體由seq?id?no.8所示的胰島素b鏈突變所得，突變位點為所述胰島素b鏈上的第二十二位精氨基和第二十九位的賴氨酸替換為非堿性氨基酸；

4、所述非堿性氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺中的任意一種。

5、本發(fā)明通過僅將胰島素b鏈進行位點突變獲得胰島素b鏈突變體，從而獲得長效胰島類似物，在分子的水平上消除了酶降解的敏感位點，特別是消除了胰蛋白酶的酶切位點，使得胰島素分子的活性能夠最大程度的保持，從而達到長效的目的，且制備工藝簡單。

6、進一步地，所述胰島素a鏈的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，也可以替換為其他現(xiàn)有的胰島素a鏈的突變體。本發(fā)明通過僅突變胰島素b鏈獲得胰島素b鏈突變體，然后與已知的胰島素a鏈或胰島素a鏈的突變體連接獲得長效胰島素類似物，在實現(xiàn)長效的同時還簡化了長效胰島素類似物的制備過程。

7、進一步地，所述胰島素a鏈和胰島素b鏈突變體之間的連接關(guān)系為：胰島素a鏈位于第6位的半胱氨酸與胰島素a鏈位于第11位的半胱氨酸以二硫鍵的形式相連；胰島素a鏈位于第7位的半胱氨酸與胰島素b鏈突變體位于第7位的半胱氨酸以二硫鍵的形式相連；胰島素a鏈位于第20位的半胱氨酸與胰島素b鏈突變體位于第19位的半胱氨酸以二硫鍵的形式相連。

8、本發(fā)明還提供了一種長效胰島素類似物的制備方法，包括如下步驟：

9、以seq?id?no.6所示的人胰島素基因序列為模板設(shè)計pcr引物和突變引物，pcr引物包括seq?id?no.10所示的正向引物f和seq?id?no.11所示的反向引物r；

10、以正向引物f和突變引物為引物，以seq?id?no.6所示的胰島素基因為模板進行第一輪pcr反應(yīng)；

11、第一輪pcr反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入反向引物r進行第二輪pcr反應(yīng)；

12、第二輪pcr擴增產(chǎn)物連接到載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)表達獲得產(chǎn)物，然后進行酶切水解分離純化獲得長效胰島類似物；

13、所述突變引物含有突變位點。

14、進一步地，當(dāng)突變位點為所述胰島素b鏈上的第二十二位精氨基由丙氨酸替代，所述胰島素b鏈上的第二十九位的賴氨酸由纈氨酸替代時，突變引物序列如seq?id?no.12所示；

15、當(dāng)突變位點為所述胰島素b鏈上的第二十二位精氨基由亮氨酸替代，所述胰島素b鏈上的第二十九位的賴氨酸由絲氨酸替代時，突變引物序列如seq?id?no.14所示；

16、當(dāng)突變位點為所述胰島素b鏈上的第二十二位精氨基由苯丙氨酸替代，所述胰島素b鏈上的第二十九位的賴氨酸由異亮氨酸替代時，突變引物序列如seq?id?no.16所示；

17、當(dāng)突變位點為所述胰島素b鏈上的第二十二位精氨基由天冬酰胺替代，所述胰島素b鏈上的第二十九位的賴氨酸由丙氨酸替代時，突變引物序列如seq?id?no.18所示；

18、當(dāng)突變位點為所述胰島素b鏈上的第二十二位精氨基由蘇氨酸替代，所述胰島素b鏈上的第二十九位的賴氨酸由異亮氨酸替代時，突變引物序列如seq?id?no.20所示。以上為本發(fā)明實施例優(yōu)選的胰島素b鏈的突變方式，獲得的長效胰島素類似物與胰蛋白酶一起保溫時，在相同測定環(huán)境下突變體胰島素的半衰期比與胰島素分子的半衰期延長了至少7倍。

19、進一步地，第一輪pcr反應(yīng)體系為：正向引物f?25pmol?2μl，突變引物1，50pmol?1μl，模板dna?10ng?0.5μl，dntp?200μmol，10×pcr?buffer?5μl，ddh2o?40.5μl；

20、進一步地，第一輪pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，擴增30個循環(huán)，最后1個循環(huán)為72℃10min。

21、進一步地，第二輪pcr反應(yīng)條件為94℃變性60s，退火60s，72℃延伸60s，擴增30個循環(huán)，最后1個循環(huán)為72℃10min。

22、本發(fā)明還提供了一種所述的長效胰島素類似物在制備胰島素藥物中的應(yīng)用。

23、進一步地，所述胰島素藥物以所述的長效胰島素類似物為唯一有效成分。

24、本發(fā)明利用蛋白質(zhì)工程的手段突變了胰島素分子易于被降解的堿性氨基酸b鏈第22位的精氨酸和第29位的賴氨酸，同時替代為非堿性氨基酸。本發(fā)明突變的依據(jù)是：胰島素b鏈的第22位的精氨酸和第29位的賴氨酸位于胰島素空間結(jié)構(gòu)的表面，替代突變不易引起胰島素空間結(jié)構(gòu)發(fā)生太大的變化，且對于胰島素分子之間形成二聚體的三對氫鍵有一定的影響，可以較好的破壞胰島素分子二聚體之間形成的氫鍵，從而更利于形成單體胰島素而起到速效的功效，同時替代這兩個堿性氨基酸，在分子的水平上消除了酶降解的敏感位點，特別是消除了胰蛋白酶的酶切位點，使得胰島素分子的活性能夠最大程度的保持，從而達到長效的目的。由于該胰島素突變體的氨基酸極性和形成氫鍵空間位阻的變化，也使胰島素分子之間不易形成氫鍵(胰島素分子以單體的分子形式存在)而起到速效的功效。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

26、本發(fā)明通過對胰島素b鏈上第二十二位精氨基和第二十九位的賴氨酸的突變獲得了一種新的胰島素b鏈突變體，在分子的水平上消除了酶降解的敏感位點，特別是消除了胰蛋白酶的酶切位點，使得利用該胰島素b鏈突變體制備的胰島素類似物分子的活性能夠最大程度的保持。解決了胰島素短效的問題。

27、本發(fā)明有效地規(guī)避了胰島素分子在體內(nèi)蛋白水解酶的降解特別是胰蛋白酶的水解，從而延長了胰島素分子在體內(nèi)存活的時間，達到了持續(xù)保持活性的目的，顯著起到了胰島素長效的作用。同時達到了改變其空間結(jié)構(gòu)表面的結(jié)構(gòu)的目的，沒有破壞胰島素分子內(nèi)部的螺旋結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域，改變了b鏈末端氨基酸的空間結(jié)構(gòu)，在保障消除胰蛋白酶水解位點達到長效目的的同時，又較好的消除了胰島素分子二聚體的形成，從而增加了單體胰島素分子的分子個數(shù)，進而起到相應(yīng)速效的作用。

28、進一步降低了胰島素分子對酶特別是胰蛋白酶的敏感性，使其長效的效果更加明顯。在體內(nèi)具有明顯增加的半衰期，并且因此可以為直接施用胰島素作為注射劑的糖尿病患者提供便利。