本說(shuō)明書(shū)提供了包含靶蛋白結(jié)合部分和e3泛素連接酶結(jié)合部分的雙官能化合物，以及相關(guān)的使用方法。雙官能化合物可用作靶向泛素化的調(diào)節(jié)劑，尤其是關(guān)于迅速加速性纖維肉瘤(raf)蛋白，它們被根據(jù)本公開(kāi)的雙官能化合物降解和/或以其他方式抑制。

背景技術(shù)：

1、大多數(shù)小分子藥物在緊密和明確界定的口袋中結(jié)合酶或受體。另一方面，由于其大接觸表面以及所牽涉的淺溝或平坦界面，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用眾所周知難以使用小分子靶向。e3泛素連接酶(其中數(shù)百種在人中已知)賦予關(guān)于泛素化的底物特異性，并且因此，由于其對(duì)于某些蛋白質(zhì)底物的特異性，是比一般蛋白酶體抑制劑更有吸引力的治療靶。e3連接酶配體的開(kāi)發(fā)已證明是挑戰(zhàn)性的，部分是由于它們必須破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的事實(shí)。然而，最近的發(fā)展已提供了與這些連接酶結(jié)合的特異性配體。例如，自從發(fā)現(xiàn)第一個(gè)小分子e3連接酶抑制劑nutlin以來(lái)，已報(bào)道了靶向e3連接酶的另外化合物，但該領(lǐng)域仍是發(fā)展不完全的。例如，自從發(fā)現(xiàn)第一個(gè)小分子e3連接酶小鼠雙微體2同源物(mdm2)抑制劑nutlin以來(lái)，已報(bào)道了靶向mdm2(即人雙微體2或hdm2)e3連接酶的另外化合物(j.di等人，current?cancer?drug?targets(2011),11(8),987-994)。

2、腫瘤抑制基因p53在響應(yīng)于dna損傷或應(yīng)激的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡中起重要作用(a.vazquez等人，nat.rev.drug.dis.(2008),7,979-982)，并且p53的失活被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞存活的主要途徑之一(a.j.levine等人，nature(2000),408,307-310)。在癌癥患者中，約50％發(fā)現(xiàn)具有p53突變((m.hollstein等人，science(1991),233,49-53)，而在具有野生型p53的患者中常常發(fā)現(xiàn)mdm2通過(guò)p53和mdm2的蛋白質(zhì)相互作用下調(diào)p53(p.chene等人，nat.rev.cancer(2003),3,102-109)。在沒(méi)有致癌應(yīng)激信號(hào)的正常細(xì)胞條件下，mdm2使p53保持在低濃度。響應(yīng)于dna損傷或細(xì)胞應(yīng)激，p53水平增加，并且由于來(lái)自p53/mdm2自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的反饋回路，這也導(dǎo)致mdm2的增加。換句話講，p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)mdm2，并且mdm2在其活性水平調(diào)節(jié)p53(a.j.levine等人，genes?dev.(1993)7,1126-1132)。

3、若干機(jī)制可以解釋mdm2對(duì)p53的下調(diào)作用。首先，mdm2與p53的n-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并阻斷p53響應(yīng)基因的表達(dá)(j.momand等人，cell(1992),69,1237-1245)。其次，mdm2將p53從細(xì)胞核運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)以促進(jìn)蛋白降解(j.roth等人，embo?j.(1998),17,554-564)。最后，mdm2具有將泛素綴合至p53的內(nèi)在e3連接酶活性以通過(guò)泛素依賴(lài)性26s蛋白酶體系統(tǒng)(ups)進(jìn)行降解(y.haupt等人，nature(1997)387,296-299)。這樣，因?yàn)閙dm2起e3連接酶的作用，將mdm2募集到引起疾病的蛋白質(zhì)并實(shí)現(xiàn)其泛素化和降解是用于藥物發(fā)現(xiàn)的受到高度關(guān)注的方法。

4、具有令人興奮的治療潛力的一種e3連接酶是希佩爾-林道(von?hippel-lindau,vhl)腫瘤抑制因子，e3連接酶復(fù)合物vcb的底物識(shí)別亞基，其也由延伸蛋白b和c、cul2和rbx1組成。vhl的主要底物是缺氧誘導(dǎo)因子1(hif-1α)，其是響應(yīng)低氧水平上調(diào)基因例如促血管生成生長(zhǎng)因子vegf和紅血細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子促紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)錄因子。生成針對(duì)e3連接酶的底物識(shí)別亞基的希佩爾-林道(vhl)的第一個(gè)小分子配體，并且獲得晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)該化合物模擬轉(zhuǎn)錄因子hif-1α(vhl的主要底物)的結(jié)合模式。

5、人小腦蛋白(cereblon)是人體中由crbn基因編碼的蛋白質(zhì)。crbn直向同源物從植物到人都是高度保守的，這強(qiáng)調(diào)了它的生理重要性。人小腦蛋白與受損的dna結(jié)合蛋白1(ddb1)、cullin-4a(cul4a)和cullin調(diào)節(jié)劑1(roc1)形成e3泛素連接酶復(fù)合物。這種復(fù)合物使許多其他蛋白質(zhì)泛素化。通過(guò)尚未完全闡明的機(jī)制，靶蛋白的人小腦蛋白泛素化導(dǎo)致成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(fgf8)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10(fgf10)的水平增加。fgf8依次又調(diào)節(jié)許多發(fā)育過(guò)程，例如肢體和聽(tīng)泡形成。凈結(jié)果是這種泛素連接酶復(fù)合物對(duì)于胚胎中的肢體生長(zhǎng)是重要的。在不存在人小腦蛋白的情況下，ddb1與ddb2形成復(fù)合物，所述ddb2充當(dāng)dna損傷結(jié)合蛋白。

6、凋亡抑制蛋白(iap)是參與抑制細(xì)胞凋亡(即細(xì)胞死亡)的蛋白質(zhì)家族。人類(lèi)iap家族包括8名成員，許多其他生物具有iap同源物。iap包含e3連接酶特異性結(jié)構(gòu)域以及識(shí)別底物并促進(jìn)其泛素化的桿狀病毒iap重復(fù)(bir)結(jié)構(gòu)域。iap促進(jìn)泛素化并且可以直接結(jié)合和抑制半胱天冬酶。半胱天冬酶是實(shí)施細(xì)胞凋亡的蛋白酶(例如半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7和半胱天冬酶-9)。因此，通過(guò)半胱天冬酶的結(jié)合，iap抑制細(xì)胞死亡。然而，促凋亡刺激可導(dǎo)致線粒體蛋白diablo(也稱(chēng)為第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑或smac)和htra2(也稱(chēng)為omi)的釋放。diablo和htra2的結(jié)合似乎阻斷了iap活性。

7、smac與基本上所有已知的iap相互作用，包括xiap、c-iap1、c-iap2、nil-iap、bruce和存活蛋白。成熟smac的前四個(gè)氨基酸(avpi)與iap的一部分結(jié)合，這被認(rèn)為是阻斷iap的抗凋亡作用所必需。

8、雙官能化合物(諸如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布2015-0291562和2014-0356322(以引用方式并入本文)中描述的那些)用于將內(nèi)源蛋白質(zhì)募集到e3泛素連接酶上以進(jìn)行降解。確切地說(shuō)，本公布提供了雙官能或蛋白分解靶向嵌合(protac)化合物，其適用作多種多肽和其他蛋白質(zhì)的靶向泛素化調(diào)節(jié)劑，所述多肽和其他蛋白質(zhì)在靶向泛素化之后被雙官能化合物降解和/或以其他方式抑制。

9、本領(lǐng)域一直需要有效治療與迅速加速性纖維肉瘤(raf)過(guò)表達(dá)或聚集或者raf(例如組成型活性raf)過(guò)度激活相關(guān)的疾病。例如，當(dāng)前的braf抑制劑(例如，維莫非尼和達(dá)拉非尼)可以靶向v600突變型braf。因此，始終需要具有對(duì)當(dāng)前市售的藥劑不敏感的不同braf突變的疾病或病癥(例如，黑素瘤、肺癌、胰腺癌和/或結(jié)直腸癌)。此外，可能會(huì)響應(yīng)于braf/mek抑制劑治療而出現(xiàn)抗性突變。例如，p61剪接變體可能在用braf/mek抑制劑療法治療的黑素瘤患者中出現(xiàn)，這使得這些患者沒(méi)有臨床選擇。當(dāng)前市售的藥劑也結(jié)合野生型braf并引起其反常激活，從而導(dǎo)致臨床并發(fā)癥。此外，通過(guò)與craf異源二聚化發(fā)出信號(hào)的低活性iii類(lèi)braf突變家族占非小細(xì)胞肺癌(nsclc)中braf突變的40％，并且偶爾出現(xiàn)在其他癌癥中，不能被任何當(dāng)前批準(zhǔn)的或臨床階段的braf抑制劑所靶向。i類(lèi)braf突變體(v600e、v600k、v600d)具有高激酶活性，不依賴(lài)于ras和二聚化，并且對(duì)威羅菲尼(vemurafenib)敏感。ii類(lèi)braf突變體具有高至中等的激酶活性，不依賴(lài)于ras和二聚化，并且對(duì)威羅菲尼不敏感。iii類(lèi)braf突變體具有大量至無(wú)激酶活性，不依賴(lài)于ras和二聚化，并且對(duì)威羅菲尼不敏感。

10、因此，非特異性作用以及不能靶向和調(diào)節(jié)raf仍然是有效治療發(fā)展的障礙。所以，有效靶向raf(例如，有效抑制和/或降解braf的突變形式，同時(shí)保留野生型braf)并且利用或加強(qiáng)vhl、人小腦蛋白、mdm2和iap的底物特異性的小分子治療劑將是非常有用的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開(kāi)描述了雙官能化合物及其使用方法，所述雙官能化合物用于將內(nèi)源蛋白質(zhì)募集到e3泛素連接酶上以進(jìn)行降解。確切地說(shuō)，本公開(kāi)提供了雙官能或蛋白分解靶向嵌合(protac)化合物，其適用作多種多肽和其他蛋白質(zhì)的靶向泛素化調(diào)節(jié)劑，所述多肽和其他蛋白質(zhì)在靶向泛素化之后被如本文所述的雙官能化合物降解和/或以其他方式抑制。本文所提供化合物的優(yōu)勢(shì)在于，與來(lái)自幾乎任何蛋白質(zhì)類(lèi)別或家族的靶向多肽的降解/抑制一致，可以存在廣譜藥理學(xué)活性。此外，本說(shuō)明書(shū)提供了使用有效量的如本文所述的化合物治療或改善疾病病癥(例如，癌癥(例如，腎細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、前列腺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌和黑素瘤)、心面皮膚綜合征、1型神經(jīng)纖維瘤病、costello綜合征、noonan綜合征、leopard(黑子、心電圖異常、眼距過(guò)寬、肺動(dòng)脈狹窄、生殖器異常、生長(zhǎng)遲緩、耳聾)綜合征)的方法。

2、因此，在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了雙官能或protac化合物，該化合物包含e3泛素連接酶結(jié)合部分(即，e3泛素連接酶的配體或“ulm”基團(tuán))和靶蛋白結(jié)合部分(即，蛋白質(zhì)/多肽靶向配體或“ptm”基團(tuán))，使得靶蛋白/多肽被置于泛素連接酶附近以實(shí)現(xiàn)該蛋白的降解(和抑制)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，ulm(泛素化連接酶調(diào)節(jié)劑)可以是希佩爾-林道e3泛素連接酶(vhl)結(jié)合部分(vlm)，或人小腦蛋白e3泛素連接酶結(jié)合部分(clm)，或小鼠雙微體2同源物(mdm2)e3泛素連接酶結(jié)合部分(mlm)，或iap?e3泛素連接酶結(jié)合部分(即“ilm”)。例如，雙官能化合物的結(jié)構(gòu)可以描繪為：

3、

4、如本文所示的ptm和ulm部分(例如，vlm、clm、mlm或ilm)的相應(yīng)位置以及其數(shù)目?jī)H為了舉例而提供，并非旨在以任何方式限制所述化合物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以合成如本文所述的雙官能化合物，使得各個(gè)官能部分的數(shù)目和位置可以根據(jù)需要而變。

5、在某些實(shí)施方案中，雙官能化合物還包含化學(xué)接頭(“l(fā)”)。在該實(shí)例中，雙官能化合物的結(jié)構(gòu)可以描繪為：

6、

7、其中ptm是蛋白質(zhì)/多肽靶向部分，l是接頭，例如將ptm偶聯(lián)至ulm的鍵或化學(xué)基團(tuán)，并且ulm是iap?e3泛素連接酶結(jié)合部分，或希佩爾-林道e3泛素連接酶(vhl)結(jié)合部分(vlm)，或人小腦蛋白e3泛素連接酶結(jié)合部分(clm)，或小鼠雙微體2同源物(mdm2)e3泛素連接酶結(jié)合部分(mlm)。

8、例如，雙官能化合物的結(jié)構(gòu)可以描繪為：

9、

10、其中：ptm是蛋白質(zhì)/多肽靶向部分；“l(fā)”是偶聯(lián)ptm和vlm、clm、mlm、ilm或它們的組合中的至少一種的接頭(例如鍵或化學(xué)接頭基團(tuán))；vlm是與vhl?e3連接酶結(jié)合的希佩爾-林道(on?hippel-lindau)e3泛素連接酶結(jié)合部分；clm是與人小腦蛋白結(jié)合的人小腦蛋白e3泛素連接酶結(jié)合部分；mlm是mdm2?e3泛素連接酶結(jié)合部分；并且ilm是與iap結(jié)合的iap結(jié)合部分。

11、在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，ilm是avpi四肽片段。因此，在某些另外的實(shí)施方案中，雙官能化合物的ilm分別包含氨基酸丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、脯氨酸(p)和異亮氨酸(i)或它們的非天然模擬物。在另外的實(shí)施方案中，avpi四肽片段的氨基酸通過(guò)酰胺鍵(即，-c(o)nh-或-nhc(o)-))彼此連接。

12、在某些實(shí)施方案中，如本文所述的化合物包含多個(gè)獨(dú)立選擇的ulm、多個(gè)ptm、多個(gè)化學(xué)接頭或它們的組合。

13、在某些實(shí)施方案中，ilm包含化學(xué)部分，例如本文所述的那些。

14、在另外的實(shí)施方案中，vlm可以是羥脯氨酸或其衍生物。此外，其他設(shè)想的vlm包含在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布no.2014/03022523中，如上所述，該申請(qǐng)公布全文并入本文。

15、在一個(gè)實(shí)施方案中，clm包含衍生自酰亞胺、硫代酰亞胺、酰胺或硫代酰胺的化學(xué)基團(tuán)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，化學(xué)基團(tuán)是鄰苯二甲酰亞胺基團(tuán)或其類(lèi)似物或衍生物。在某些實(shí)施方案中，clm是沙利度胺、來(lái)那度胺、泊馬度胺、其類(lèi)似物、其電子等排物或其衍生物。其他設(shè)想的clm在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布no.2015/0291562中有所描述，該申請(qǐng)公布全文并入本文。

16、在某些實(shí)施方案中，mlm可以是nutlin或其衍生物。此外，其他設(shè)想的mlm包含在2016年7月11日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)15/206,497中，如上所述，該專(zhuān)利申請(qǐng)全文并入本文。在某些另外的實(shí)施方案中，雙官能化合物的mlm包含化學(xué)部分，例如取代的咪唑啉、取代的螺-吲哚酮、取代的吡咯烷、取代的哌啶酮、取代的嗎啉酮、取代的吡咯并嘧啶、取代的咪唑并吡啶、取代的噻唑并咪唑啉、取代的吡咯并吡咯烷酮和取代的異喹啉酮。

17、在另外的實(shí)施方案中，mlm包含上述核心結(jié)構(gòu)，其中相鄰的雙芳基取代以順式或反式構(gòu)型定位。

18、在某些實(shí)施方案中，“l(fā)”是鍵。在另外的實(shí)施方案中，接頭“l(fā)”是具有1至20范圍內(nèi)的線性非氫原子數(shù)的連接子。連接子“l(fā)”可包含但不限于官能團(tuán)，例如醚、酰胺、烷烴、烯烴、炔烴、酮、羥基、羧酸、硫醚、亞砜和砜。接頭可包含芳族、雜芳族、環(huán)狀、雙環(huán)和三環(huán)部分。鹵素如cl、f、br和i的取代可包含在接頭中。在氟取代的情況下，可包含單個(gè)或多個(gè)氟。

19、在某些實(shí)施方案中，vlm是反式-3-羥脯氨酸的衍生物，其中反式-3-羥脯氨酸中的氮和羧酸都被官能化為酰胺。

20、在某些實(shí)施方案中，clm是哌啶-2,6-二酮的衍生物，其中哌啶-2,6-二酮可以在3-位被取代，并且3-取代可以是具有c-n鍵或c-c鍵的雙環(huán)雜芳族。clm的實(shí)例可以是但不限于泊馬度胺、來(lái)那度胺和沙利度胺以及它們的衍生物。

21、在另一方面，本說(shuō)明書(shū)提供了治療組合物，其包含有效量的如本文所述化合物或其鹽形式和藥學(xué)上可接受的載體。治療組合物調(diào)節(jié)患者或受試者(例如動(dòng)物，例如人)中的蛋白質(zhì)降解，并且可以用于治療或改善通過(guò)降解的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的疾病狀態(tài)或狀況。在某些實(shí)施方案中，如本文所述的治療組合物可用于實(shí)現(xiàn)所關(guān)注蛋白質(zhì)的降解，以治療或改善疾病，例如癌癥。在又一方面，本公開(kāi)提供了泛素化/降解細(xì)胞中的靶蛋白的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括施用如本文所述的雙官能化合物，該雙官能化合物包含優(yōu)選通過(guò)接頭部分連接的ilm和ptm、ptm和vlm、或ptm和clm、或ptm和mlm，如本文其他地方所述，其中vlm/ilm/clm/mlm通過(guò)接頭偶聯(lián)至ptm以靶向與ptm結(jié)合的蛋白質(zhì)以進(jìn)行降解。類(lèi)似地，ptm可通過(guò)接頭偶聯(lián)至vlm或clm或mlm或ilm以靶向蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行降解。當(dāng)靶蛋白被置于e3泛素連接酶附近時(shí)，將發(fā)生靶蛋白的降解，從而導(dǎo)致靶蛋白的作用的降解/抑制和蛋白質(zhì)水平的控制。通過(guò)本公開(kāi)提供的蛋白質(zhì)水平的控制提供了疾病狀態(tài)或狀況的治療，其通過(guò)降低患者細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的水平而通過(guò)靶蛋白調(diào)節(jié)。

22、在另一方面，本說(shuō)明書(shū)提供了用于治療或改善受試者或患者(例如動(dòng)物，例如人類(lèi))的疾病、病癥或其癥狀的方法，該方法包括向有需要的受試者施用組合物，該組合物包含有效量(例如治療有效量)的本文所述化合物或其鹽形式，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物能夠有效治療或改善受試者的疾病或病癥或其癥狀。

23、在另一方面，本說(shuō)明書(shū)提供了使用根據(jù)本公開(kāi)的化合物鑒別生物系統(tǒng)中的所關(guān)注蛋白質(zhì)降解的影響的方法。

24、前述一般實(shí)用領(lǐng)域僅為了舉例而給出，并且不希望對(duì)本公開(kāi)的范圍和所附權(quán)利要求書(shū)構(gòu)成限制。根據(jù)本權(quán)利要求、說(shuō)明書(shū)和實(shí)例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解與本公開(kāi)的組合物、方法和方法相關(guān)的另外目的和優(yōu)點(diǎn)。例如，本公開(kāi)的各個(gè)方面和實(shí)施方案可以眾多組合利用，所有這些組合都由本說(shuō)明書(shū)明確地加以考慮。這些另外的方面和實(shí)施方案明確地包含在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。本文用于闡明本公開(kāi)的背景并且在特定情況下提供關(guān)于實(shí)踐的另外細(xì)節(jié)的出版物和其他材料以引用方式并入。