本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)研究，特別涉及動脈血管的疾病研究模型的構(gòu)建，具體是一種用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、流行病學(xué)調(diào)查顯示，動脈血管病變所引起的動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、右心衰竭等疾病的發(fā)病率連年上升，而環(huán)境污染物是其常見的危險因素之一。動脈血管病變的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其最基礎(chǔ)的病理表現(xiàn)是內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間交流紊亂。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的交流分為自分泌與旁分泌和細(xì)胞連接兩種，交流紊亂主要表現(xiàn)為分泌物水平改變和縫隙連接通道狀態(tài)改變。因此研究環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用對于防治動脈血管病變所引起的各種疾病，提供新的治療靶點有重要意義。

2、現(xiàn)有對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道的研究多選擇其中一種細(xì)胞研究其膜上縫隙連接蛋白的結(jié)構(gòu)和表達(dá)變化，對于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)所形成的縫隙連接研究較少。已報道有關(guān)共培養(yǎng)所形成的縫隙連接的研究通過在transwell小室兩側(cè)分別接種內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，模擬血管的組織解剖結(jié)構(gòu)。此種以transwell小室為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的模型，雖然在結(jié)構(gòu)上模擬了血管組織，但兩種細(xì)胞只能通過產(chǎn)生少量縫隙連接蛋白穿過transwell膜孔形成交流，且縫隙連接蛋白取材觀測其形態(tài)難度較大。

3、目前微流控領(lǐng)域提出了多種通道微芯片作為血管平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)模型構(gòu)建載體，用于血流動力學(xué)作用研究。例如，公告號為cn114149923b的發(fā)明專利公開了“一種內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)的單流道微芯片模型的構(gòu)建方法”，該方法以動脈血管為原型建模，建立內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞分層培養(yǎng)的單流道微芯片模型，用于動態(tài)監(jiān)測同一流動刺激下內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和功能變化。這種模型雖然解決了兩種細(xì)胞在同一微流道內(nèi)直接物理接觸的問題，但并未提出內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道的檢測方法，其流體輸入方式所產(chǎn)生的流體切力所致的混雜效應(yīng)會影響對單一環(huán)境污染物刺激的研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞無法直接物理接觸、兩種細(xì)胞間縫隙連接通道無法直接觀測、環(huán)境污染物干預(yù)研究中存在混雜因素等問題，而提供了一種用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、一種用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法，包括以下步驟：

4、a.原代動脈小鼠平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)，得到平滑肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液。

5、b.原代動脈小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，得到內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液。

6、c.構(gòu)建原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞體外分層共培養(yǎng)模型。

7、a.硬件系統(tǒng)的準(zhǔn)備：硬件系統(tǒng)包括液體輸入系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和液體回收池。

8、液體輸入系統(tǒng)包括機(jī)械式流量控制器，其安裝有針筒。

9、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括底板、第一蓋板、第二蓋板和第三蓋板，底板分別與第一蓋板、第二蓋板、第三蓋板拼接組合成不同的對流式雙通道微芯片；底板與第一蓋板拼接組合成第一對流式雙通道微芯片，第一對流式雙通道微芯片內(nèi)部形成有第一培養(yǎng)通道，第一蓋板上設(shè)有與第一培養(yǎng)通道相通的第一液體輸入口和第一液體輸出口，第一液體輸入口用于通過液體輸入管與針筒連接，第一液體輸出口用于通過液體輸出管與液體回收池連接；底板與第二蓋板拼接組合構(gòu)成第二對流式雙通道微芯片，第二對流式雙通道微芯片內(nèi)部形成有第二培養(yǎng)通道，第二蓋板上設(shè)有與第二培養(yǎng)通道相通的第二液體輸入口和第二液體輸出口，第二液體輸入口用于通過液體輸入管與針筒連接，第二液體輸出口用于通過液體輸出管與液體回收池連接；底板與第三蓋板拼接組合構(gòu)成第三對流式雙通道微芯片，第三對流式雙通道微芯片內(nèi)部形成有第三培養(yǎng)通道，第三蓋板上設(shè)有與第三培養(yǎng)通道相通的第三液體輸入口和第三液體輸出口，第三液體輸入口用于通過液體輸入管與針筒連接，第三液體輸出口用于通過液體輸出管與液體回收池連接；第三蓋板上設(shè)有擴(kuò)散池，擴(kuò)散池與第三培養(yǎng)通道之間通過半透膜間隔設(shè)置，底板與第三蓋板組合后形成無動力學(xué)因素混雜的干預(yù)通道，當(dāng)擴(kuò)散池加入環(huán)境污染物溶液時，污染物分子能夠穿過半透膜且不產(chǎn)生流體切力。

10、b.使用75％酒精浸泡、擦拭細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)各組件后，紫外線照射30min消毒備用。

11、c.通過平滑肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液配制平滑肌細(xì)胞--bd-matrixgel基質(zhì)膠溶液；

12、d.將底板與第一蓋板拼接組合成第一對流式雙通道微芯片，將第一蓋板上的第一液體輸入口通過液體輸入管與針筒連接，將第一蓋板上的第一液體輸出口通過液體輸出管與液體回收池連接；將平滑肌細(xì)胞--bd-matrixgel基質(zhì)膠溶液裝入針筒中，打開機(jī)械式流量控制器，以2-10μl/min的速度向第一對流式雙通道微芯片的第一培養(yǎng)通道中灌入平滑肌細(xì)胞--bd-matrixgel基質(zhì)膠溶液，30min后，第一培養(yǎng)通道中的平滑肌細(xì)胞--bd-matrixgel基質(zhì)膠溶液凝固，形成柔韌平整的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)層。

13、將第一蓋板從底板上拆卸下來，再將第二蓋板拼接在底板上組合成第二對流式雙通道微芯片，將第二蓋板上的第二液體輸入口通過液體輸入管與針筒連接，將第二蓋板上的第二液體輸出口通過液體輸出管與液體回收池連接；將內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液裝入針筒中，打開機(jī)械式流量控制器，以1-2μl/min的速度向第二對流式雙通道微芯片的第二培養(yǎng)通道中灌入內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液，12h后，內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液中的內(nèi)皮細(xì)胞貼壁于平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)層上，原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞體外分層共培養(yǎng)模型構(gòu)建完成。

14、d.構(gòu)建用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型。

15、第二天，通過推動針筒產(chǎn)生的氣流將第二培養(yǎng)通道中的殘余培養(yǎng)基液體排盡；將第二蓋板從底板上拆卸下來，再將第三蓋板拼接在底板上組合成第三對流式雙通道微芯片，將第三蓋板上的第三液體輸入口通過液體輸入管與針筒連接，將第三蓋板上的第三液體輸出口通過液體輸出管與液體回收池連接；向針筒內(nèi)裝入含20％胎牛血清的培養(yǎng)基，打開機(jī)械式流量控制器，以2-10μl/min的速度向第三對流式雙通道微芯片的第三培養(yǎng)通道中灌入含20％胎牛血清的培養(yǎng)基，直至含20％胎牛血清的培養(yǎng)基充滿整個第三培養(yǎng)通道；向第三蓋板上的擴(kuò)散池中加入預(yù)先配制好的環(huán)境毒物溶液進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)完成后，用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建完成。

16、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞體外分層共培養(yǎng)模型構(gòu)建完成后，對其進(jìn)行鑒定，具體為：通過推動針筒產(chǎn)生的氣流將第二培養(yǎng)通道中的殘余培養(yǎng)基液體排盡；向針筒內(nèi)裝入滅菌pbs液體，打開機(jī)械式流量控制器，以5μl/min的速度向第二培養(yǎng)通道中灌入滅菌pbs液體，完成對第二培養(yǎng)通道的沖洗；沖洗完成后，向針筒內(nèi)裝入dil-ac-ldl染液，打開機(jī)械式流量控制器，以5μl/min的速度向第二培養(yǎng)通道中灌入dil-ac-ldl染液，直至dil-ac-ldl染液充滿整個第二培養(yǎng)通道，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h；孵育完成后，通過推動針筒產(chǎn)生的氣流將第二培養(yǎng)通道中的殘余dil-ac-ldl染液排盡；向針筒內(nèi)裝入滅菌pbs液體，打開機(jī)械式流量控制器，以5μl/min的速度向第二培養(yǎng)通道中灌入滅菌pbs液體，完成對第二培養(yǎng)通道的沖洗；通過激光共聚焦顯微鏡，在激發(fā)波495nm和發(fā)射波565nm的條件下進(jìn)下觀察，若紅色熒光標(biāo)記整齊規(guī)律排布，則模型構(gòu)建成功；若紅色熒光零星散布，則模型構(gòu)建失敗。

17、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，機(jī)械式流量控制器的輸出端與針筒的活塞連接，控制針筒內(nèi)液體流速；針筒的容量為1ml或5ml。

18、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，第一對流式雙通道微芯片中，第一培養(yǎng)通道的高度為30μm、長度為6000μm、寬度為30μm，第一培養(yǎng)通道用于培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞；第二對流式雙通道微芯片中，第二培養(yǎng)通道的高度為60μm、長度為6000μm、寬度為30μm，第二培養(yǎng)通道用于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞；第三對流式雙通道微芯片中，第三培養(yǎng)通道的高度為60μm、長度為6000μm、寬度為30μm，第三培養(yǎng)通道用于含20％胎牛血清的培養(yǎng)基或模型應(yīng)用所需的其它液體的灌入；第三對流式雙通道微芯片中，擴(kuò)散池采用長度為4000μm、寬度為30μm、高度為60μm的立方體池體。

19、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，擴(kuò)散池(13)的材質(zhì)為pdms；半透膜的材質(zhì)為pet，其孔徑為0.4μm。

20、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，原代動脈小鼠平滑肌細(xì)胞及原代動脈小鼠內(nèi)皮細(xì)胞均來自小鼠的二、三級動脈。

21、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，配制平滑肌細(xì)胞--bd-matrixgel基質(zhì)膠溶液的方法為：取平滑肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液，將其制成密度大于1×107個/ml的單細(xì)胞懸液，向其中加入20μl/ml的bd-matrixgel基質(zhì)膠，輕輕搖晃混勻即可。

22、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了上述用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型應(yīng)用，所述應(yīng)用主要包括如下兩個方面的應(yīng)用：

23、第一方面的應(yīng)用是：用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建完成后，收集擴(kuò)散池內(nèi)的液體，使用elisa試劑盒分別檢測il-6、tnf-α等炎癥因子的水平，反映平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞交流是否正常，有助于研究環(huán)境污染物對平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間信息交流的作用。

24、第二方面的應(yīng)用是：用fluo-4/am和rhod-4/am作為熒光染料分別預(yù)染內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察環(huán)境污染物干預(yù)此模型前后平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ca2+的動態(tài)分布情況，具體包括如下步驟：

25、s1.基本同上述用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法中的步驟a，區(qū)別僅在于將培養(yǎng)好的平滑肌細(xì)胞用pbs清洗3次，加入1ml?rhod-4/am染液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min，棄染液，用pbs清洗3次，得到預(yù)染的平滑肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液；

26、s2.基本同上述用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法中的步驟b，區(qū)別僅在于將培養(yǎng)好的內(nèi)皮細(xì)胞用pbs清洗3次，加入1ml?fluo-4/am染液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min，棄染液，用pbs清洗3次，得到預(yù)染的內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液；

27、s3.基本同上述用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法中的步驟c，區(qū)別僅在于用到的平滑肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液由預(yù)染的平滑肌細(xì)胞單細(xì)胞懸液代替，用到的內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液由預(yù)染的內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液代替；

28、s4.基本同上述用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法中的步驟d，區(qū)別僅在于用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建完成后，利用激光共聚焦顯微鏡，在激發(fā)波494nm和發(fā)射波550nm的條件下觀察平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ca2+的動態(tài)分布情況。

29、本發(fā)明中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞所形成的縫隙連接在平滑肌-bd-matrixgel基質(zhì)膠層與內(nèi)皮細(xì)胞交界處，對平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分別預(yù)染紅色和綠色的ca2+熒光探針，環(huán)境污染物干預(yù)后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察縫隙連接通道的動態(tài)變化，即通過ca2+熒光探針可觀察縫隙連接通道狀態(tài)，并且染色后可以直接觀測縫隙連接蛋白的表達(dá)情況，有助于研究縫隙連接通道在環(huán)境暴露有害物質(zhì)致動脈重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用，為動脈血管病變所引起的各種疾病的藥物防治提供新靶點。

30、本發(fā)明所述的用于測試環(huán)境污染物對原代動脈平滑肌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞毒性的模型構(gòu)建方法，解決了血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞間縫隙連接產(chǎn)生較少且無法直接觀測的問題，排除了環(huán)境污染物干預(yù)中混雜因素的影響，實現(xiàn)了對縫隙連接通道狀態(tài)的動態(tài)檢測，有助于研究縫隙連接通道在環(huán)境暴露有害物質(zhì)致動脈重構(gòu)相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。