本發(fā)明涉及生物工程，尤其涉及一種基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、d-丙氨酸(d-ala)是一種重要的手性氨基酸，在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，d-丙氨酸是合成維生素b6的重要原料，也是氨基酸輸液的成分之一。在食品領(lǐng)域，d-丙氨酸可作為調(diào)味劑和增香劑，改善食品的口感和風(fēng)味。在化工領(lǐng)域，d-丙氨酸可以合成新型甜味劑如阿力甜。在其他領(lǐng)域，d-丙氨酸可用于化妝品的添加劑，具有優(yōu)良的消泡性能，屬于非離子型表面活性劑。

2、目前，d-丙氨酸合成方法主要為化學(xué)法與生物法結(jié)合。(1)化學(xué)合成法，工業(yè)上生產(chǎn)dl-丙氨酸的方法主要是由乙醛為原料與氰化鈉、氯化銨、氨作用合成2-氨基丙腈，再經(jīng)過水解后制得dl-丙氨酸。隨后采用化學(xué)拆分法制得d-丙氨酸包括種晶拆分法和層析拆分法。該方法對環(huán)境污染極大，逐漸被社會淘汰。(2)生物發(fā)酵法，該方法利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)d-丙氨酸，具有成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點。但周期長、產(chǎn)物濃度低。目前，國內(nèi)采用這種方法制備d型丙氨酸的研究很少。(3)酶轉(zhuǎn)化法；①酶拆分法；酶具有很嚴(yán)格的專一性，當(dāng)它作用于dl-氨基酸及其衍生物時，只能和其中的一種構(gòu)型發(fā)生反應(yīng)，從而獲得所需要的光學(xué)活性的氨基酸。目前，工業(yè)上普遍采用l-氨基酸?；覆鸱址▉砩a(chǎn)d-丙氨酸，先利用化學(xué)法制備dl-丙氨酸的?；苌?，然后l-氨基?；缸饔糜趌-ala?；苌锷蒷-ala和d-丙氨酸?；苌?，后者通過水解得到d-丙氨酸。另外，有個別d-氨基酰化酶也可以直接作用于?；膁-丙氨酸，水解生成d-丙氨酸。②轉(zhuǎn)氨酶法；利用d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶與d構(gòu)型的氨基酸反應(yīng)生成d-丙氨酸，由于d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶在轉(zhuǎn)氨酶類別中屬于比較小的一部分，用轉(zhuǎn)氨酶來制備d-丙氨酸的研究不多，而且普遍制備成本較高。而且酶的成本相對較高，且對酶的純度要求高，不能引入與底物或產(chǎn)物反應(yīng)的雜酶，導(dǎo)致底物利用率低或副產(chǎn)物生成。

3、因此，如何實現(xiàn)生產(chǎn)高純度的d-丙氨酸已成為目前亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌及其制備方法和應(yīng)用，通過crispr-cas9技術(shù)對大腸桿菌宿主菌進行改造，敲除了菌株自身表達的d-丙氨酸消旋酶，使其無法對催化產(chǎn)物d-丙氨酸進行消旋生成副產(chǎn)物l-丙氨酸，大大降低極難分離的副產(chǎn)物l-丙氨酸生成。

2、為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌，所述大腸桿菌被部分敲除了alr基因與dadx基因。

4、本發(fā)明中，通過crispr-cas9技術(shù)對大腸桿菌宿主菌進行改造，敲除了菌株自身表達的d-丙氨酸消旋酶，使其無法對催化產(chǎn)物d-丙氨酸進行消旋生成副產(chǎn)物l-丙氨酸，大大降低極難分離的副產(chǎn)物l-丙氨酸生成。

5、優(yōu)選的，所述部分敲除后alr基因的核酸序列包括如seq?id?no.1所示的序列。

6、seq?id?no.1：

7、atgcaagcggcaactgttgtgattaaccgccgcgctctgcgacacaacctgcaacgtcttcgtgaactggcccctgccagtaaaatggttgcggtggtgaaagcgaacgcttatggtcacggtcttcttgagaccgcgcgaacgctccccgatgctgacgcctttggcgtagcccgtctcgaagaagctaggcgttttatcatcgcctgacccagtgcaaaaacgttcgtcagccggtgaatatcgtcagccattttgcgcgcgcggatgaaccaaaatgtggcgcaaccgagaaacaactcgctatctttaataccttttgcgaaggcaaacctggtcaacgttccattgccgcgtcgggtggcattctgctgtggccacagtcgcattttgactgggtgcgcccgggcatcattctttatggcgtctcgccgctggaagatcgctccaccggtgccgattttggctgtcagccagtgatgtcactaacctccagcctgattgccgtgcgtgagcataaagccggagagcctgttggttatggtggaacctgggtaagcgaacgtgatacccgtcttggcgtagtcgcgatgggctatggcgatggttatccgcgcgccgcgccgtccggtacgccagtgctggtgaacggtcgcgaagtaccgattgtcgggcgcgtggcgatggatatgatctgcgtagacttaggtccacaggcgcaggacaaagccggggatccggtcattttatggggcgaaggtttgcccgtagaacgtatcgctgaaatgacgaaagtaagcgcttacgaacttattacgcgcctgacttcaagggtcgcgatgaaatacgtggattaa

8、優(yōu)選的，所述部分敲除后dadx基因的核酸序列包括如seq?id?no.2所示的序列。

9、seq?id?no.2：

10、atgacccgtccgatacaggccagcctcgatctgcaggcattaaaacagaatctgtccattgtccgccaggccgcgacgcacgcgcgcgtctggtcggtggtaaaagcgaacgcttacgggcatggtattgagcgtatctggagcgcgatcggggccaccgatggctttgcattgcttaacctggaagcggaacatcctgatggaatttccggcgcgatggcgcgtattgagcaggcggcggaggggctggagtgtcggcgttcgttgtccaattcggcggcgactctgtggcacccggaagcgcattttgactgggttcggcctggcattattttgtatggcgcttcgccgtccggtcagtggcgtgatatcgccaataccggattacgtccggtgatgacgctaagcagtgagattattggtgtccagacgctaaaagcgggcgagcgtgtgggctacggcggtcgctatactgcgcgcgatgaacagcgaatcggcattgtcgccgcagggtacgccgacggttatccgcgccacgcgcctaccggtacccctgttttagtggacggcgtgcgcaccatgacggtggggaccgtctcgatggatatgctagcggtcgatttaacgccttgcccgcaggcgggtattggtacgccggttgagctgtggggcaaggagatcaaaattgatgatgtcgccgccgctgccggaacggtgggctatgagttgatgtgcgcgctggcgctacgcgtcccggttgtgacggtgtaa

11、第二方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)第一方面所述的基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：所述制備方法的步驟包括：將將alr-ptargetf質(zhì)粒、dadx-ptargetf質(zhì)粒、alr-donor?dna、dadx-donor?dna和pcas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，經(jīng)過鑒定后消除質(zhì)粒制得。

12、本發(fā)明中，采用crispr-cas9技術(shù)，能夠有效敲除將alr基因和dadx基因，并進一步對殘留質(zhì)粒進行消除，降低質(zhì)粒對后續(xù)實驗的影響。

13、優(yōu)選的，所述制備方法包括以下步驟：

14、(1)設(shè)計alr與dadx基因?qū)?yīng)的n20序列，并將alr與dadx基因與對應(yīng)的n20序列連接；

15、(2)將步驟(1)獲得的序列分別與質(zhì)粒連接；

16、(3)構(gòu)建alr-donor?dna和dadx-donor?dna；

17、(4)將步驟(2)構(gòu)建的質(zhì)粒、步驟(3)中的dna片段和pcas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中；

18、(5)鑒定；

19、(6)消除質(zhì)粒。

20、優(yōu)選的，步驟(1)中alr-n20序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

21、seq?id?no.3-f：ctgttcttcgttatgcacgg；

22、seq?id?no.4-r：ccgtgcataacgaagaacag。

23、優(yōu)選的，步驟(1)中dadx-n20序列如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示。

24、seq?id?no.5-f：tcaaagcactgcaaaatgcg；

25、seq?id?no.6-r：cgcattttgcagtgctttga。

26、優(yōu)選的，步驟(2)中所述質(zhì)粒包括ptargetf質(zhì)粒。

27、優(yōu)選的，步驟(3)中所述alr-donor?dna序列如seq?id?no.7所示。

28、seq?id?no.7：

29、cgactacctgcaactgatgcgcgtaccggcgctttccgataaccgtacgctggaaattgcagaaatctctcgctcgctgaaagcactggcgaaagaactgaacgtgccggtggtggcgctgtcccagttgaaccgttctctggaacaacgtgccgacaaacgcccggtcaactccgacctgcgtgaatctggctctatcgagcaggatgcggacttgatcatgtttatctatcgtgatgaggtgtatcacgaaaacagtgatttaaaaggcatcgcggaaattattatcggtaaacaacgtaacggcccaatcgggacggtacgcctgacctttaacggtcaatggtcgcgcttcgacaactatgcggggccgcagtacgacgacgaataataattattttatgaattaggtaattaaagcaaacacttatcaaggaacacaaatgcaagcggcaactgttgtgattaaccgccgcgctctgcgacacaacctgcaacgtcttcgtgaactggcccctgccagtaaaatggttgcggtggtgaaagcgaacgcttatggtcacggtcttcttgagaccgcgcgaacgctccccgatgctgacgcctttggcgtagcccgtctcgaagaagctaggcgttttatcatcgcctgacccagtgcaaaaacgttcgtcagccggtgaatatcgtcagccattttgcgcgcgcggatgaaccaaaatgtggcgcaaccgagaaacaactcgctatctttaataccttttgcgaaggcaaacctggtcaacgttccattgccgcgtcgggtggcattctgctgtggccacagtcgcattttgactgggtgcgcccgggcatcattctttatggcgtctcgccgctggaagatcgctccaccggtgccgattttggctgtcagccagtgatgtcactaacctccagcctgattgccgtgcgtgagcataaagccggagagcctgttggttatggtggaacctgggtaagcgaacgtgatacccgtcttggcgtagtcgcgatgggctatggcgatggttatccgcgcgccgcgccgtccggtacgccagtgctggtgaacggtcgcgaagtaccgattgtcgggcgcgtggcgatggatatgatctgcgtagacttaggtccacaggcgcaggacaaagccggggatccggtcattttatggggcgaaggtttgcccgtagaacgtatcgctgaaatgacgaaagtaagcgcttacgaacttattacgcgcctgacttcaagggtcgcgatgaaatacgtggattaatcgttctgtaatatttgattgtctgtgccggatgcggcgtgaatgccttatccggccaataaaatcctaaaaattcaataagttgatgttctttcatgctcttataaaggtcgtgcctctggcggatgtacgtttgtcatgagtctcactctgttgctaattgccgttcgctcctgaacatccactcgatcttcgccttcttccggtttattgtgttttaaccacctgcccgtaaacctggagaaccatcgcgtgtttcaaaaagttgacgcctacgctggcgacccgattcttacgcttatggagcgttttaaagaagaccctcgcagcgacaaagtgaatttaagtatcggtctgtactacaacgaagacggaattattccacaactgcaagccgtggcggaggcggaagcgcgcctgaatgcgcagcctcatggcgcttcgctttatttaccgatggaagggcttaactgctatcgccatgcc

30、優(yōu)選的，步驟(3)中所述dadx-donor?dna序列如seq?id?no.8所示。

31、seq?id?no.8：

32、ccggtatccaccattcttgatgaaacctacaaaatcgccattacccgtttcgataaccgcattcgtgttggcggaatggcggagattgttggttttaataccgagctgttgcaaccgcgtcgtgaaacgctggagatggtggttcgcgatctctatccacgcggcggtcatgtcgagcaggcgactttctggactggtctgcgcccgatgacgccagacggcacgccggttgtcgggcgtacacgctttaaaaatctgtggctgaataccggtcacggcacgctcggctggacgatggcttgcggttccggtcagttgttaagcgatctgctctctggtcgcacgccagcgatcccatatgaggatctaagcgtagcgcgctacagccgtggatttacgccatcacgtccgggccatttacatggcgcacacagctaaggaaacgagatgacccgtccgatacaggccagcctcgatctgcaggcattaaaacagaatctgtccattgtccgccaggccgcgacgcacgcgcgcgtctggtcggtggtaaaagcgaacgcttacgggcatggtattgagcgtatctggagcgcgatcggggccaccgatggctttgcattgcttaacctggaagcggaacatcctgatggaatttccggcgcgatggcgcgtattgagcaggcggcggaggggctggagtgtcggcgttcgttgtccaattcggcggcgactctgtggcacccggaagcgcattttgactgggttcggcctggcattattttgtatggcgcttcgccgtccggtcagtggcgtgatatcgccaataccggattacgtccggtgatgacgctaagcagtgagattattggtgtccagacgctaaaagcgggcgagcgtgtgggctacggcggtcgctatactgcgcgcgatgaacagcgaatcggcattgtcgccgcagggtacgccgacggttatccgcgccacgcgcctaccggtacccctgttttagtggacggcgtgcgcaccatgacggtggggaccgtctcgatggatatgctagcggtcgatttaacgccttgcccgcaggcgggtattggtacgccggttgagctgtggggcaaggagatcaaaattgatgatgtcgccgccgctgccggaacggtgggctatgagttgatgtgcgcgctggcgctacgcgtcccggttgtgacggtgtaacttgttgtaagccggatcggaggcaacgtcttctgggtgcaaaaaaatcatccatccggctggtcagcaactgtagttgttaatgtgacagagccattgcccatgatagtgtccattaaaaggatggacactatttccccggaacctgaactcaccgcacaggcgttctacataaaacgcttacgcttcattgttgactcgaactcgacttcagataaatcacgctttacccttgatggagcctgtacatagatttgtgtaattgcctgattttgatatgttcaattcaacatcaaatgaaggttaaattatggacgacaaacaattgcaggctcaggctgcgttcagcaaagcatcgcaaccggcgatagatgcttcattaaatttaagattcagcttcctcttcagccacccgtacgccaatcttcaacacttcattatcttctttctcggccaccgtccagatcatcccggcaaactctacctggtcaccgacaa優(yōu)選的，步驟(4)中所述轉(zhuǎn)入的方法電轉(zhuǎn)化法、熱激法或顆粒轟擊法中的任意一種。

33、優(yōu)選的，步驟(4)中所述大腸桿菌的菌株包括dh5α、bl21(de3)、jm109、top10或hb101中的任意一種。

34、優(yōu)選的，步驟(5)中所述鑒定的方法包括菌落pcr和/或全基因組測序。

35、優(yōu)選的，步驟(6)中所述消除質(zhì)粒的方法的步驟包括：在步驟(5)鑒定后的大腸桿菌加入iptg進行孵育。

36、優(yōu)選的，所述iptg的終濃度為0.1-1mm，例如可以是0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm或1mm等。

37、優(yōu)選的，所述孵育的時間為12-36h，溫度為35-40℃。所述12-36h，例如可以是12h、15h、20h、25h、30h、35h或36h等。所述35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。

38、第三方面，本發(fā)明提供一種用于d丙氨酸生產(chǎn)的雙酶共表達大腸桿菌，所述雙酶共表達大腸桿菌為在第一方面所述的基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌中進行天冬氨酸消旋酶與d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的共表達。

39、本發(fā)明中，在第一方面所述的大腸桿菌的基礎(chǔ)上構(gòu)建多酶催化系統(tǒng)，引入天冬氨酸消旋酶，實現(xiàn)以l-天冬氨酸為底物無需對酶純化直接全細胞催化生產(chǎn)d-丙氨酸，相對與單酶催化系統(tǒng)，多酶催化系統(tǒng)采用的底物l-天冬氨酸成本遠低于d-天冬氨酸。

40、優(yōu)選的，所述天冬氨酸消旋酶的核酸序列如seq?id?no.9所示。

41、seq?id?no.9：

42、atggagaattttttcagtattttaggcggaatgggcacgatggcgacagaaagttttgttcgcttgatcaaccaccgaacgaaagctacaaaagatcaagaatatttgaattatgtcttattcaatcatgcaacagttcctgatcgtacagcttatattttagatcgatcagaagaaaatccaatgccgtttctgctggatgatattgagaaacaaaatttattgcgaccaaacttcattgtgttgacttgtaacacagcacattacttttttgaagaattacaagcggcaacggatattcctatcctgcatatgccaagagaagcagcaaatgaacttgtccgtcagcatacgacagggagagtagcgattctaggaacagaaggaagtatgaaagctggaatctatgaacgcgaagtcaaaaatcttggattcgaaacagtgattcctgatactgcgcttcaagaaaaaatcaattatttgatctatcatgaaatcaaagagtcagatcacttgaatcaagaactctactatgagattttggaagaagcggtagagcgattaaactgtgaaaaagttatcctaggttgcacggaattatctttgatgaatgaatttgctgaagataatcattacccagtgatcgatgctcaatctattttagcggatcggacgatcgaacgagcattagctgaaagaaacgaagcattagatacagtatctgaaaagtag

43、優(yōu)選的，所述d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的核酸序列如seq?id?no.10所示。

44、seq?id?no.10：

45、atgggctacaccctgtggaacgatcagattgtgaaagatgaagaagttaaaatcgacaaagaagatcgtggctaccaattcggtgacggtgtgtacgaagtagttaaagtttataacggtgaaatgttcacagttaatgaacacatcgaccgcctgtacgcgtccgctgaaaaaatccgcatcaccatcccgtacaccaaagataaattccaccagctgctgcacgaactggttgagaaaaacgaactgaacaccggccacatctatttccaggttacccgtggcacctctccgcgtgcgcaccagttcccggaaaacaccgttaaaccggttatcatcggttacaccaaagaaaacccgcgtccgttagaaaacctggaaaaaggtgttaaagcgacctttgttgaagatatccgttggctgcgttgtgatatcaaatctctgaatctgctgggtgctgttctggctaaacaggaagcgcacgaaaaaggctgctacgaagcgatcctgcaccgtaacaacaccgttaccgagggctctagcagcaacgttttcggcatcaaagatggtatcctgtacacccacccggcgaacaacatgatcctgaaaggcatcacccgtgatgttgttattgcgtgcgcgaacgaaatcaacatgccggtaaaagaaatcccgttcaccacccacgaagcgctgaaaatggatgaactgttcgtgaccagcaccaccagcgaaatcaccccggtgatcgaaatcgatggcaaactgatccgtgatggtaaagttggtgaatggacccgtaaactgcagaaacagttcgaaactaaaatcccgaaaccgctgcacatctaa

46、第四方面，本發(fā)明提供一種第三方面所述的用于d丙氨酸生產(chǎn)的雙酶共表達大腸桿菌的制備方法，所述制備方法的步驟包括將天冬氨酸消旋酶和d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的核酸序列與質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)入第一方面所述的基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌中。

47、優(yōu)選的，所述制備方法的步驟包括：

48、(a)采用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒酶切后與天冬氨酸消旋酶的核酸序列連接，得到連接產(chǎn)物；

49、(b)采用限制性內(nèi)切酶將步驟(a)得到的連接產(chǎn)物進行酶切后與d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的核酸序列得到共表達載體；

50、(c)將步驟(b)得到的共表達載體轉(zhuǎn)入第一方面所述的基于crispr-cas9基因編輯的大腸桿菌中。

51、優(yōu)選的，步驟(a)中所述的質(zhì)粒包括petduet-1、prsfduet-1、pcoladuet-1、pcdfduet-1、pacycduet-1、pgex或pma中的任意一種。

52、優(yōu)選地，步驟(a)中限制性內(nèi)切酶包括bamhⅰ和/或ecorⅰ。

53、優(yōu)選地，步驟(b)中限制性內(nèi)切酶包括aat?、『?或xhoⅰ。

54、優(yōu)選地，步驟(c)中所述轉(zhuǎn)入的方法包括電轉(zhuǎn)化。

55、第五方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)第三方面所述的用于d丙氨酸生產(chǎn)的雙酶共表達大腸桿菌在d-丙氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。

56、優(yōu)選的，所述應(yīng)用的生產(chǎn)方法包括：在第三方面所述的用于d丙氨酸生產(chǎn)的雙酶共表達大腸桿菌中加入l-天冬氨酸、輔酶和丙酮酸后，調(diào)節(jié)ph，振蕩反應(yīng)。

57、優(yōu)選的，所述大腸桿菌的終濃度為3-10g/l，例如可以是3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l等。

58、優(yōu)選的，所述l-天冬氨酸的終濃度為40-60g/l，例如可以是40g/l、42g/l、44g/l、46g/l、48g/l、50g/l、52g/l、54g/l、56g/l、58g/l或60g/l等。

59、優(yōu)選的，所述輔酶包括磷酸吡哆醛。

60、優(yōu)選地，所述輔酶的濃度為1-4mm，例如可以是1mm、2mm、3mm或4mm等。

61、優(yōu)選的，所述丙酮酸的濃度為6-10g/l，例如可以是6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l等。

62、優(yōu)選的，所述丙酮酸和l-天冬氨酸的摩爾比為1:(2-8)，所述(2-8)，例如可以是2、3、4、5、6、7或8等。

63、優(yōu)選的，所述振蕩反應(yīng)的速度為100-500rpm，例如可以是100rpm、200rpm、300rpm、400rpm或500rpm等。

64、優(yōu)選的，所述振蕩反應(yīng)的溫度為35-45℃，時間為12-36h。所述35-45℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃等。所述12-36h，例如可以是12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h或36h等。

65、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

66、1.本發(fā)明中，通過crispr-cas9技術(shù)對大腸桿菌宿主菌進行改造，敲除了菌株自身表達的d-丙氨酸消旋酶，使其無法對催化產(chǎn)物d-丙氨酸進行消旋生成副產(chǎn)物l-丙氨酸，大大降低極難分離的副產(chǎn)物l-丙氨酸生成。

67、2.本發(fā)明中，采用共表達策略引入天冬氨酸消旋酶和d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，成功實現(xiàn)了“一菌雙酶”的發(fā)酵培養(yǎng)，不僅實現(xiàn)了天冬氨酸消旋酶和d-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的高效表達，還有效降低了酶的生產(chǎn)成本。

68、3.本發(fā)明中，基于雙酶共表達改造菌株建立了d-丙氨酸的酶促轉(zhuǎn)化方法，實現(xiàn)了以l-天冬氨酸為底物，“一菌雙酶”全細胞催化生產(chǎn)d-丙氨酸，進一步降低了d-丙氨酸的工業(yè)生產(chǎn)成本。