本發(fā)明涉及生物酶活性檢測，特別涉及一種快速檢測原料乳中脂肪酶酶活力的方法。

背景技術(shù)：

1、uht滅菌乳一般有長達6個月的貨架期，在貯藏期間會出現(xiàn)脂肪上浮、蛋白凝固、酸包、漲包等問題，其中脂肪上浮是?uht滅菌乳在貨架期內(nèi)的普遍現(xiàn)象，對產(chǎn)品品質(zhì)造成嚴重影響。uht滅菌乳脂肪上浮現(xiàn)象與乳的物理化學成分、脂肪酶的殘留、均質(zhì)條件、乳化劑等因素有關(guān)。近年來，生牛乳中脂肪酶含量uht滅菌乳品質(zhì)影響越來越受到乳品加工企業(yè)廣泛關(guān)注。研究表明，乳中的脂肪酶主要由內(nèi)源性（脂蛋白脂肪酶）和外源性（微生物產(chǎn)生的脂肪酶）兩種。內(nèi)源性的脂蛋白脂肪酶由乳腺細胞分泌，其水平依賴于品種、泌乳階段和營養(yǎng)狀況，脂蛋白脂肪酶熱不穩(wěn)定，巴氏殺菌可使其完全滅活；外源性的脂肪酶主要由嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱脂肪酶，即使經(jīng)過uht處理仍有部分殘留。殘留的脂肪酶能分解脂肪釋放出游離的脂肪，這些游離的脂肪在脂肪球的相互碰撞中，能起到粘合劑的作用，從而產(chǎn)生脂肪球簇，對脂肪出現(xiàn)上浮的現(xiàn)象。同時，脂肪酶破壞脂肪球膜后，導致脂肪更加容易被氧化或水解，不飽和脂肪酸增加，使牛乳酸度更高，產(chǎn)生不良風味，由于乳脂肪中含低級脂肪酸比較多，即使稍微水解也會產(chǎn)生刺激性的酸敗味。

2、因此，為了控制生牛乳中脂肪酶對uht滅菌乳脂肪上浮、風味裂變等品質(zhì)的影響，亟需對生牛乳中的脂肪酶活力進行快速檢測?，F(xiàn)有的脂肪酶活力的檢測方法主要有平板法、酸堿滴定法、對硝基苯酚法、熒光法、色譜法等。平板法，多適用于外源性脂肪酶的快速粗略測定；酸堿滴定法，多適用于乳中內(nèi)源性和外源性脂肪酶的定性測定，但該方法檢測過程存在滴定終點不易判斷，人為誤差大，測得結(jié)果準確度不高、穩(wěn)定性差等問題；對硝基苯酚法的應用十分普遍，該法穩(wěn)定性好，測得酶活數(shù)據(jù)準確度高，但操作較為復雜，藥品價格昂貴，且試驗中用到了一些有毒物質(zhì),易對人體和環(huán)境造成危害；熒光法和色譜法，所需底物試劑或設備價格昂貴，一般只用于外源性脂肪酶的定性和定量測定。可見，亟需提供一種速度快、結(jié)果準確性好、成本低、操作方便的檢測原料乳中脂肪酶酶活性的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中測定原料乳中脂肪酶活力的方法存在操作過程復雜、誤差大、成本高的問題，提出了一種快速檢測原料乳中脂肪酶酶活力的方法。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種快速檢測原料乳中脂肪酶酶活力的方法，包括以下步驟：

3、s1、將原料乳在不低于90℃的溫度下滅活處理不低于10s后，冷卻至2~6℃，得到滅活原料乳；在滅活原料乳中加入脂肪酶標準品配制得到至少5種不同活力值的脂肪酶標準工作液；量取適量原料乳作為待測樣品；

4、s2、用乳成分分析儀測定水解前后脂肪酶標準工作液中脂肪和/或游離脂肪酸的含量，并計算得到水解前后脂肪酶標準工作液中脂肪和/或游離脂肪酸的含量變化值；用乳成分分析儀測定水解前后待測樣品中脂肪和/或游離脂肪酸的含量，并計算得到水解前后待測樣品中脂肪和/或游離脂肪酸的含量變化值；

5、s3、利用脂肪酶標準工作液的脂肪酶活力值（u/ml）為橫坐標，以水解前后脂肪酶標準工作液中脂肪（g/100g）和/或游離脂肪酸（mevk/l）的含量變化值為縱坐標，繪制對應的工作曲線，并得到對應工作曲線的回歸方程；

6、s4、根據(jù)對應工作曲線的回歸方程，利用水解前后待測樣品中脂肪和/或游離脂肪酸的含量變化值，計算得到待測樣品中的脂肪酶活力值。

7、本發(fā)明一種快速檢測原料乳中脂肪酶酶活力的方法，根據(jù)原料乳中的脂肪酶能夠在一定溫度條件下將脂肪水解并產(chǎn)生游離脂肪酸，從而使原料乳中脂肪含量減少，游離脂肪酸含量增加的原理；不僅利用乳成分分析儀來測定水解前后原料乳中脂肪和/或游離脂肪酸的變化量，還通過設置脂肪酶標準工作液進行對照和繪制工作曲線以及求出回歸方程，從而可根據(jù)待測樣品中脂肪和/或游離脂肪酸的變化量，結(jié)合回歸方程準確計算出原料乳中脂肪酶活力；本發(fā)明方法采用的乳成分分析儀是乳企業(yè)常規(guī)的儀器，因而無需再外購專用檢測設備，成本低、操作方便；同時，利用乳成分分析儀可快速準確的得出原料乳中成分的變化值，檢測速度快、結(jié)果準確性好，更適合在原料乳中脂肪酶活力檢測中大規(guī)推廣應用。

8、其中，步驟s1中，優(yōu)選的，所述滅活處理的溫度為92-95℃；溫度過低，細菌和外源性脂肪酶滅活不徹底，會分解乳成分，導致測試結(jié)果不準確；而溫度過高會導致乳成分變質(zhì)，影響水解效果，從而導致測試結(jié)果不準確。

9、優(yōu)選的，所述滅活處理時間為10-15s；時間過短，細菌和外源性脂肪酶滅活不徹底，會分解乳成分，導致測試結(jié)果不準確；時間過長，會導致乳成分變質(zhì)，影響水解效果，從而導致測試結(jié)果不準確。

10、優(yōu)選的，所述滅活處理有效性的判斷標準為：40±3℃的條件下保溫1h，脂肪變化＜0.02g/100g。

11、優(yōu)選的，所述不同脂肪酶標準工作液的活力值成等比數(shù)列；優(yōu)選的肪酶標準工作液要求，能使工作曲線更平滑，特征更明顯，獲得的回歸方程更準確，測試結(jié)果準確性更好。

12、其中，步驟s2中，優(yōu)選的，所述乳成分分析儀的重復性(%cv)2)≤0.25?%；準確度(%cv)2)≤1.0?%；優(yōu)選的儀器精度和準確性要求，能顯著提高檢測結(jié)果的準確性。

13、優(yōu)選的，在采用乳成分分析儀進行測定之前，需要對乳成分分析儀進行校準；通過校準，能使乳成分分析儀的測試結(jié)果更準確，降低不必要的誤差。

14、優(yōu)選的，所述水解方法包括：將脂肪酶標準工作液和待測樣品置于40±3℃的條件下水解1h，取出，在10min內(nèi)冷卻至2~6℃。

15、優(yōu)選的，所述水解方法中，采用水浴加熱；水浴加熱更均勻，水解條件可控性更好。

16、優(yōu)選的，所述水解方法中，在5min內(nèi)冷卻至2-6℃；冷卻速度越快，越能降低脂肪酶對脂肪的水解作用，從而避免脂肪在水解結(jié)束后被脂肪酶水解，才能保證測試結(jié)果更準確。

17、其中，優(yōu)選的，步驟s4，根據(jù)對應工作曲線的回歸方程，利用水解前后待測樣品中脂肪和游離脂肪酸的含量變化值，分別計算得到待測樣品中的脂肪酶活力值；將通過待測樣品中脂肪的含量變化值計算得到的脂肪酶活力值與通過游離脂肪酸的含量變化值計算得到的脂肪酶活力值進行差值運算，如果兩者的絕對差值大于兩者算術(shù)平均值的10%，則調(diào)整脂肪酶標準工作液的活力值，重新進行檢測；如果兩者的絕對差值小于等于兩者算數(shù)平均值的10%，則以兩者的算術(shù)平均值作為最終的測量結(jié)果；利用原料乳中脂肪和游離脂肪酶酸變化的對應性關(guān)系，將通過不同物質(zhì)測量的結(jié)果進行相互校對，可有效避免檢測過程中的誤差和失誤，減小儀器精度等導致的結(jié)果偏差，顯著提高了檢測結(jié)果的準確性。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

19、1、本發(fā)明方法利用乳成分分析儀來測定水解前后原料乳中脂肪和/或游離脂肪酸的變化量，檢測成本低、操作方便、檢測速度快，更適合在原料乳中脂肪酶活力檢測中大規(guī)推廣應用。

20、2、本發(fā)明方法通過設置脂肪酶標準工作液進行對照和繪制工作曲線以及求出回歸方程，從而可根據(jù)待測樣品中脂肪和/或游離脂肪酸的變化量，結(jié)合回歸方程準確計算出原料乳中脂肪酶活力，檢測結(jié)果準確性高。

21、3、本發(fā)明方法利用原料乳中脂肪和游離脂肪酶酸變化的對應性關(guān)系，將通過不同物質(zhì)測量的結(jié)果進行相互校對，可有效避免檢測過程中的誤差和失誤，減小儀器精度等導致的結(jié)果偏差，顯著提高了檢測結(jié)果的準確性。