本發(fā)明涉及一種產(chǎn)β-果糖呋喃苷酶的重組畢赤酵母菌株及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、低聚果糖(fructooligosaccharides，簡(jiǎn)寫(xiě)為fos)是在水果、蔬菜、大麥、蜂蜜等中少量存在的天然成分。它多為蔗果三糖(gf2)、蔗果四糖(gf3)和蔗果五糖(gf4)的混合物，由蔗糖通過(guò)β-(2，1)糖苷鍵與其它分子中的果糖基團(tuán)連接組成。fos被認(rèn)為是食品中公認(rèn)安全(gras)成分，能夠促進(jìn)腸道中雙歧桿菌生長(zhǎng)，抑制外源致病菌和腸內(nèi)固有腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，提高機(jī)體免疫等功效。其中蔗果三糖是低聚果糖中益生功效含量較為豐富的成分。

2、目前低聚果糖規(guī)?；a(chǎn)主要由蔗糖的通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用合成。在轉(zhuǎn)糖基過(guò)程中，將高濃度蔗糖作為原料，利用具有果糖基轉(zhuǎn)移活性的β-果糖呋喃苷酶(β-fructofuranosidase，fopa)催化合成，fopa主要來(lái)自真菌，如aspergillus?niger、a.japonicus、aureobasidium?pullulans和penicillium?expansum等。如黑曲霉atcc20611是低聚果糖合成的主要工業(yè)菌株，1988年，該菌株由hidaka等人篩選得到(hidaka?het?al,agricultural?and?biological?chemistry,1988,52(5):1181-1187)，其產(chǎn)生的β-果糖呋喃苷酶主要以胞內(nèi)酶形式存在。

3、然而，上述技術(shù)中存在β-果糖呋喃苷酶位于胞內(nèi)導(dǎo)致酶純化步驟較為繁瑣，且產(chǎn)物中蔗果三糖的含量占比偏低的缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種產(chǎn)β-果糖呋喃苷酶的重組畢赤酵母菌株及其制備方法和應(yīng)用，目的在于解決β-果糖呋喃苷酶位于胞內(nèi)且生成的低聚果糖中蔗果三糖含量占比偏低的技術(shù)問(wèn)題。

2、本發(fā)明提供的第一個(gè)技術(shù)方案為一種產(chǎn)β-果糖呋喃苷酶的重組畢赤酵母菌，以畢赤酵母為宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞的基因組上整合有β-果糖呋喃苷酶的編碼基因fopa和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶編碼基因pdi。

3、在某些實(shí)施方式中，所述β-果糖呋喃苷酶由pgap啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，所述β-果糖呋喃苷酶的n端連接所述α-factor信號(hào)肽。

4、在某些實(shí)施方式中，所述β-果糖呋喃苷酶源于黑曲霉(aspergillus?niger)，β-果糖呋喃苷酶的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

5、在進(jìn)一步，fopa基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

6、某些實(shí)施方式中，α-factor信號(hào)肽的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:6所示。

7、在某些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶由paox啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)

8、在某些實(shí)施方式中，pdi基因的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

9、在某些實(shí)施方式中，pgap啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?id?no:4所示。

10、在某些實(shí)施方式中，paox啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

11、在某些實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母x33。

12、在某些實(shí)施方式中，所述β-果糖呋喃苷酶以pgapzαa質(zhì)粒為表達(dá)載體。

13、在某些實(shí)施方式中，所述β-果糖呋喃苷酶整合在畢赤酵母基因組的gap位點(diǎn)。

14、在某些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶以ppic9k質(zhì)粒為表達(dá)載體。

15、在某些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶整合在畢赤酵母基因組的aox位點(diǎn)。

16、本發(fā)明提供的第二個(gè)技術(shù)方案為一種產(chǎn)β-果糖呋喃苷酶的重組畢赤酵母菌的構(gòu)建方法，所述方法為β-果糖呋喃苷酶的編碼基因fopa和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶編碼基因pdi整合至畢赤酵母菌的基因組上，所述β-果糖呋喃苷酶整合在畢赤酵母基因組的gap位點(diǎn)；蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶整合至畢赤酵母菌的基因組aox。

17、在某些實(shí)施方式中，包括如下步驟：

18、(1)將fopa基因亞克隆至pgapzαa載體上α-factor信號(hào)肽下游ecor?i和sal?i酶切位點(diǎn)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆子，提取重組質(zhì)粒pgapzαa-fopa；

19、(2)利用限制性?xún)?nèi)切酶avr?ii對(duì)步驟(1)中的重組質(zhì)粒pgapzαa-fopa進(jìn)行單酶切，將線性化的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母x33中，重組畢赤酵母菌，命名為x33-fopa菌株。

20、(3)將pdi基因亞克隆至ppic9k載體上bamh?i和not?i位點(diǎn)之間，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆子，提取重組質(zhì)粒ppic9k-pdi；

21、(4)以x33-fopa為出發(fā)菌株，制備感受態(tài)，利用限制性?xún)?nèi)切酶sac?i對(duì)步驟3中的重組質(zhì)粒ppic9k-pdi單酶切，將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母x33-fopa中，重組畢赤酵母菌命名為x33-fopa-pdi

22、本發(fā)明提供的第三個(gè)技術(shù)方案為一種β-果糖呋喃苷酶的制備方法，所述方法為利用第一個(gè)技術(shù)方案所述的重組畢赤酵母菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。

23、在某些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為bmmy培養(yǎng)基。

24、在某些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵的溫度為28～30℃，發(fā)酵的時(shí)間為60～80h。

25、本發(fā)明提供的第四個(gè)技術(shù)方案為一種蔗果三糖的制備方法，所述方法為以蔗糖為底物，利用第一個(gè)技術(shù)方案所述的重組畢赤酵母菌發(fā)酵后的上清液作為催化劑組成催化系統(tǒng)，催化生成蔗果三糖。

26、在某些實(shí)施方式中，在所述催化體系中，催化劑的添加量為6u/g蔗糖。

27、在某些實(shí)施方式中，在所述催化體系中，所述底物的濃度為55％。

28、在某些實(shí)施方式中，催化反應(yīng)的溫度為50～55℃，催化反應(yīng)的ph為7.0～7.5。

29、本發(fā)明提供的第五個(gè)技術(shù)方案為第一個(gè)技術(shù)方案所述的重組畢赤酵母菌，或者第二個(gè)技術(shù)方案所述的方法，或者第三個(gè)技術(shù)方案所述的方法，或者第四個(gè)技術(shù)方案所述的方法在生產(chǎn)β-果糖呋喃苷酶、蔗果三糖或含蔗果三糖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

30、本發(fā)明的技術(shù)效果如下：

31、選擇畢赤酵母x33菌株并利用gap啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和α-factor信號(hào)肽分泌表達(dá)fopa基因，同時(shí)利用aox啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)分子伴侶pdi，產(chǎn)生的β-果糖呋喃苷酶位于發(fā)酵上清液中，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的純化步驟即可得到β-果糖呋喃苷酶目標(biāo)蛋白，將其作用于蔗糖生產(chǎn)蔗果三糖，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。具體地為，根據(jù)aspergillus?niger中fopa的氨基酸序列，對(duì)其堿基序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上表達(dá)了分子伴侶蛋白pdi，得到的陽(yáng)性克隆搖瓶發(fā)酵72h，測(cè)定發(fā)酵上清液催化蔗糖生成蔗果三糖的酶活為694.83u/ml，產(chǎn)物中蔗果三糖的占比最高，為45.5％，低聚果糖占總糖比例為63.84％