本發(fā)明屬于熒光探針，具體涉及一種芘基席夫堿熒光衍生物、熒光探針及其制備方法和生物成像的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鋅，是僅次于鐵元素的第二大必需微量元素，對人體內(nèi)多種生理反應(yīng)調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的意義。鋅穩(wěn)態(tài)失衡將會影響生物體的健康，研究表明，鋅缺乏會導(dǎo)致生殖功能障礙、免疫系統(tǒng)功能障礙、生長遲緩及內(nèi)分泌等各種臨床疾病的發(fā)生；鋅過量會引發(fā)腹瀉、惡心、中毒等癥狀，也會引發(fā)冠心病、動脈硬化癥等疾??；此外，帕金森病和阿爾茨海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病也是鋅失衡所致。因此，鋅對生物體的健康具有很大的影響，有效監(jiān)測生物體中鋅離子的濃度，對相關(guān)疾病的診療及預(yù)防具有重要的應(yīng)用價值。

2、檢測zn2+的傳統(tǒng)技術(shù)主要有原子吸收光譜法、分光光度法、色譜分析法、電化學(xué)分析法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。這些方法雖然可以選擇性檢測zn2+且具有較高的靈敏度，但是仍然存在許多問題，如：儀器設(shè)備成本高、操作過程復(fù)雜、檢測耗時長等，無法滿足實時原位在線監(jiān)測的需求，進而限制了其在眾多領(lǐng)域中的應(yīng)用。然而，相較上述方法，熒光探針不僅具有傳統(tǒng)檢測技術(shù)選擇性好、靈敏度高、空間分辨率高的優(yōu)勢，而且兼具操作簡單、微型化且便于攜帶、響應(yīng)速度快及便于生物成像和觀察等優(yōu)點，可彌補傳統(tǒng)檢測技術(shù)方法的不足。基于zn2+熒光探針的優(yōu)良性能，其在化學(xué)分析、生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。

3、據(jù)文獻統(tǒng)計與調(diào)研發(fā)現(xiàn)，關(guān)于zn2+熒光探針的合成雖已有報道，但當(dāng)前市場無國產(chǎn)試劑，購買困難；已商品化的國外zn2+熒光探針存在一定的局限性，其價格昂貴且有效時間短；此外，大量已報道熒光探針在生物成像及檢測方面效果不夠理想，故在實際應(yīng)用中受到一定的限制。綜合上述分析，有效檢測人體內(nèi)zn2+的含量及其分布是至關(guān)重要的。因此，設(shè)計合成具有合成簡單、離子選擇性強、靈敏度好、響應(yīng)迅速、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性強、細胞毒性低等特點的zn2+熒光探針，并將其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是至關(guān)重要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種芘基席夫堿熒光衍生物、熒光探針及其制備方法和生物成像的應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有檢測方法存在的選擇性差、檢測成本高、生物成像效果不理想等難以滿足鋅離子識別監(jiān)測的問題。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種芘基席夫堿熒光衍生物，其中，所述芘基席夫堿熒光衍生物的結(jié)構(gòu)通式如下所示：

4、

5、其中，r為取代或未取代的鄰羥基芳香醛，所述的取代或未取代的鄰羥基芳香醛為如下結(jié)構(gòu)式中的一種：

6、

7、上述結(jié)構(gòu)式中：r1、r2、r3和r4可各自獨立地選自氫、羥基、烷基、烷氧基、鹵素、取代或未取代的c6～c60的芳香環(huán)基、取代或未取代的c3～c60的芳雜環(huán)基中的一種。

8、本發(fā)明的第二方面，提供一種芘基席夫堿熒光衍生物的制備方法，包括如下步驟：

9、1)在氮氣氛圍中，向裝有磁力攪拌和冷凝回流裝置的容器中加入1-溴芘、2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯、碳酸鉀水溶液、四(三苯基膦)鈀和1,4-二氧六環(huán)，加熱至100～110℃(如100℃)，攪拌回流24～36小時(如24小時)后反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液緩慢倒入含飽和氯化鈉的水溶液中，攪勻后靜置，抽濾，水洗并干燥濾餅。用洗脫劑經(jīng)柱色譜法分離純化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，得中間體py-nh2。

10、2)在氮氣氛圍中，向裝有磁力攪拌和冷凝回流裝置的容器中加入中間體py-nh2、原料x、冰醋酸和無水乙醇，升溫至78～85℃(如80℃)，攪拌回流2～4小時(如3小時)，3小時后反應(yīng)液內(nèi)有大量固體析出，趁熱抽濾，并用無水乙醇洗滌，得目標(biāo)產(chǎn)物粗品，用無水乙醇加熱溶解，趁熱抽濾，對其進行進一步純化，制得所述目標(biāo)產(chǎn)物芘基席夫堿熒光衍生物。

11、其中，所述原料x的結(jié)構(gòu)式為r＝o，r為取代或未取代的鄰羥基芳香醛，所述的取代或未取代的鄰羥基芳香醛為如下結(jié)構(gòu)式中的一種：

12、

13、上述結(jié)構(gòu)式中：r1、r2、r3和r4可各自獨立地選自氫、羥基、烷基、烷氧基、鹵素、取代或未取代的c6～c60的芳香環(huán)基、取代或未取代的c3～c60的芳雜環(huán)基中的一種。

14、進一步的，步驟(1)中，1-溴芘、2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯、碳酸鉀水溶液、四(三苯基膦)鈀和1,4-二氧六環(huán)的摩爾比為1:(1.1～1.3):(3～5):(0.05～0.15):(80～120)。

15、進一步的，所述柱色譜分離的洗脫劑為二氯甲烷-甲醇體系，其體積比為(90～110):1。

16、更進一步的，洗脫劑二氯甲烷與甲醇的體積比為100:1。

17、進一步的，步驟(2)中，中間體py-nh2、原料x和無水乙醇的摩爾比為1:(1.1～1.3):(20～30)。

18、更進一步的，中間體py-nh2、原料x和無水乙醇的摩爾比為1:1.1:20。

19、本發(fā)明的第三方面，提供一種芘基席夫堿熒光衍生物制備熒光探針的方法，其中，包括以下步驟：

20、(1)將上述芘基席夫堿熒光衍生物溶解在有機溶劑(如二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺等)中，制備成1×10-2mol/l～5×10-2mol/l(如1×10-2mol/l)的熒光探針母液，備用；

21、(2)向3μl的熒光探針母液中加入2997μl的有機溶劑(如二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺等)、超純水、緩沖溶液(如pbs緩沖溶液、tris-hcl緩沖溶液)中的一種，將熒光探針母液稀釋為1×10-5mol/l～5×10-5mol/l(如1×10-5mol/l)的溶液，搖勻后，將其置于室溫環(huán)境中避光靜置2小時，制得熒光探針。

22、本發(fā)明的第四方面，采用上述制備方法制得熒光探針。

23、將醋酸鋅溶解在超純水中，配制成1mol/l的醋酸鋅母液，再將醋酸鋅母液稀釋為1×10-3～5×10-3mol/l的醋酸鋅溶液；

24、將不同的金屬干擾離子(mn2+，na+，cd2+，k+，pb2+，ba2+，li+，mg2+，al3+，ca2+，ag+，hg2+，sr2+，cu+等金屬離子)溶解在超純水中，配制成1mol/l的離子母液，再將離子母液稀釋為5×10-3mol/l的金屬干擾離子溶液。

25、將本發(fā)明的第三方面制得的熒光探針，準(zhǔn)確移取3ml?1×10-5mol/l～5×10-5mol/l(如1×10-5mol/l)于石英比色皿中，依次加入3μl?1×10-3～5×10-3mol/l(如1×10-5mol/l)的醋酸鋅溶液，分別測試其紫外可見滴定和熒光滴定光譜，直至其紫外或熒光光譜不再發(fā)生變化，探究熒光探針對鋅離子傳感的光學(xué)性能。

26、將本發(fā)明的第三方面制得的熒光探針，準(zhǔn)確移取3ml?1×10-5mol/l～5×10-5mol/l(如1×10-5mol/l)于石英比色皿中，分別加入3eq.上述不同種類的金屬干擾離子溶液，對其熒光發(fā)射光譜進行測試；再向其加入3eq.醋酸鋅溶液，并對其熒光發(fā)射光譜進行測試，探究熒光探針對鋅離子的選擇性和抗干擾能力。

27、本發(fā)明采用上述熒光探針溶液及離子溶液進行實驗，經(jīng)實驗結(jié)果證明，zn2+加入后，熒光探針溶液的熒光強度迅速增加，是一種典型的“turn-on”型熒光探針，且對鋅離子具有良好的選擇性和離子抗干擾性。

28、本發(fā)明的第五方面，提供一種如上所述的熒光探針對外源性/內(nèi)源性鋅離子進行生物成像的應(yīng)用。

29、采用本發(fā)明的第三方面制得的熒光探針避光孵育待處理對象30～50min(如35min)，經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡進行活細胞成像。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

31、本發(fā)明公開了一種芘基席夫堿熒光衍生物，該衍生物的結(jié)構(gòu)設(shè)計使得其能夠作為熒光探針使用，特別是通過引入不同的分子結(jié)構(gòu)的鄰羥基芳香醛，可以調(diào)整其光學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)的熒光檢測提供基礎(chǔ)。此外，該衍生物通過吡啶中的氮原子、席夫堿中的氮原子和鄰羥基中的氧原子共同作用，可與zn2+特異性螯合，形成配位分子；同時，熒光基團芘與其他基團由于共軛的產(chǎn)生，進而改變熒光探針的基本光物理性質(zhì)，與zn2+結(jié)合后，能夠產(chǎn)生特定的熒光現(xiàn)象，因此，可達到對zn2+特異性識別的目的。這種特性使得該衍生物成為檢測zn2+的潛在有力工具，具有高選擇性和靈敏度。

32、本發(fā)明公開了一種芘基席夫堿熒光衍生物的制備方法，通過suzuki偶聯(lián)反應(yīng)和醛胺縮合反應(yīng)合成了含有亞胺基的席夫堿熒光衍生物，可以與zn2+形成配位分子，產(chǎn)生特定的熒光現(xiàn)象。首先，選用1-溴芘作為鹵代烴，2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯作為芳基硼酸酯，四(三苯基膦)鈀作為過渡金屬催化劑通過suzuki偶聯(lián)反應(yīng)制備中間體py-nh2。其中：(1)1-溴芘分子結(jié)構(gòu)中的溴原子是suzuki偶聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵位點，溴原子的存在使得1-溴芘在過渡金屬催化劑四(三苯基膦)鈀的存在下，能夠與芳基硼酸酯(如2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯)發(fā)生交叉偶聯(lián)反應(yīng)，形成c-c鍵，從而構(gòu)建目標(biāo)產(chǎn)物的骨架結(jié)構(gòu)；(2)2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯除參與偶聯(lián)反應(yīng)外，還向目標(biāo)產(chǎn)物中引入了氨基吡啶基團，這一基團對產(chǎn)物的熒光性質(zhì)、生物活性產(chǎn)生重要影響。(3)碳酸鉀水溶液的加入為反應(yīng)提供了必要的堿性環(huán)境。在suzuki偶聯(lián)反應(yīng)中，堿性條件一方面有助于促進芳基硼酸酯的去質(zhì)子化，形成更易于反應(yīng)的硼酸根離子，從而加速偶聯(lián)反應(yīng)的進行，另一方面還能促進催化劑的活性，降低反應(yīng)的活化能，使得反應(yīng)在更溫和的條件下進行，并提高反應(yīng)速率和產(chǎn)率。(4)四(三苯基膦)鈀是該制備方法中的關(guān)鍵催化劑。一方面，它能夠在反應(yīng)體系中形成活性催化中心，促進1-溴芘與2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯之間的交叉偶聯(lián)反應(yīng)。另一方面，它能夠在復(fù)雜的反應(yīng)體系中準(zhǔn)確地識別并催化目標(biāo)反應(yīng)，同時抑制副反應(yīng)的發(fā)生，提高反應(yīng)的選擇性和產(chǎn)物的純度。(5)采用1,4-二氧六環(huán)作為溶劑，1,4-二氧六環(huán)的化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定。在制備過程中，它不僅能夠保持反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，提供一個適宜的反應(yīng)環(huán)境，避免不必要的副反應(yīng)發(fā)生，還能夠促進反應(yīng)物之間的接觸和碰撞，加速反應(yīng)的進行，從而有利于目標(biāo)產(chǎn)物的生成。中間體py-nh2在制備方法中也發(fā)揮著重要作用：一方面，py-nh2中的氨基官能團具有較強的反應(yīng)活性，可以參與縮合反應(yīng)。另一方面，吡啶環(huán)的存在使得py-nh2類化合物具有較好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。其次，通過將中間體py-nh2、原料x、冰醋酸和無水乙醇混合，經(jīng)加熱、抽濾等處理，制得目標(biāo)產(chǎn)物芘基席夫堿熒光衍生物。在這個步驟中，中間體py-nh2中的氨基與原料x中的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，生成了含有亞胺基(-c＝n-)的席夫堿結(jié)構(gòu)，即目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)實驗證實，上述所制備的芘基席夫堿熒光衍生物光化學(xué)穩(wěn)定性好且成功避免了光漂白現(xiàn)象，具有離子選擇性好、離子抗干擾能力強等優(yōu)勢。本發(fā)明所制備的芘基席夫堿熒光衍生物可對鋅離子進行特異性識別檢測，且表現(xiàn)出響應(yīng)速度快、檢測限低、可回復(fù)性好和斯托克斯(stokes)位移大等優(yōu)異性能。解決了已有檢測方法中存在的選擇性差、檢測成本高、生物成像效果不理想等問題。

33、進一步的，本發(fā)明通過suzuki偶聯(lián)反應(yīng)和醛胺縮合反應(yīng)兩步化學(xué)反應(yīng)制備了可特異性檢測鋅離子的芘基席夫堿熒光探針，其可實現(xiàn)對鋅離子的快速、可視化檢測效果且具有良好的可回復(fù)性和較低的細胞毒性，實用性高、成本低，優(yōu)勢巨大且在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。本發(fā)明利用金屬離子螯合配位作用及熒光開啟效應(yīng)制得的的熒光探針，具有優(yōu)異的光化學(xué)穩(wěn)定性、極高的靈敏度及良好的離子選擇性，將該系列熒光探針與熒光儀器結(jié)合使用可實現(xiàn)對溶液、生物體中鋅離子的高效快速識別檢測。

34、進一步的，本發(fā)明采用上述芘基席夫堿熒光衍生物對活細胞、組織中的內(nèi)源性鋅離子和外源性鋅離子均進行生物成像應(yīng)用，實驗結(jié)果表明上述芘基席夫堿熒光衍生物均可對生物系統(tǒng)中的活細胞及組織中的內(nèi)源性鋅離子和外源性鋅離子進行可視化檢測，解決了現(xiàn)有生物成像效果不理想等方面存在的不足，為鋅離子熒光探針的設(shè)計合成及生物成像應(yīng)用提供了新的研究思路。