本發(fā)明涉及害蟲抗藥性機(jī)理與防治領(lǐng)域，具體涉及一種褐飛虱基因nlcyp303a1及其納米核酸農(nóng)藥。

背景技術(shù)：

1、農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)全球農(nóng)作物生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。化學(xué)殺蟲劑在害蟲防治和保障糧食安全方面做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，殺蟲劑的不當(dāng)使用導(dǎo)致許多害蟲迅速產(chǎn)生抗藥性，使得許多現(xiàn)有殺蟲劑失效，因此，亟需開發(fā)新型高效的害蟲防治技術(shù)。近年來，靶向害蟲致死基因的核酸農(nóng)藥作為新興技術(shù)得到逐步的推廣。rna干擾(rnai)是一種進(jìn)化上普遍存在的基因調(diào)控機(jī)制，通過rnai沉默害蟲中的關(guān)鍵基因可導(dǎo)致其死亡或繁殖能力下降等表型，具有高效害蟲防治的潛力?；趓nai技術(shù)生產(chǎn)的納米核酸農(nóng)藥具有高效性和精確性的特點(diǎn)，優(yōu)于包括化學(xué)殺蟲劑在內(nèi)的傳統(tǒng)方法。

2、確定最佳靶標(biāo)基因是利用rnai技術(shù)進(jìn)行害蟲防治的關(guān)鍵。先前的研究表明，沉默免疫相關(guān)基因會(huì)導(dǎo)致昆蟲抵抗細(xì)菌感染的能力下降，從而增加昆蟲在細(xì)菌感染后的死亡率。例如，敲低酚氧化酶原(ppo)基因顯著增加了豌豆蚜蟲(acyrthosiphon?pisum)中細(xì)菌和真菌的感染率，導(dǎo)致其死亡率升高。此外，研究表明，沉默昆蟲消化和排泄系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因可以顯著降低其存活率。例如，沉默飛蝗(locusta?migratoria)中維持消化器官正常功能所必需的dead-box(ddx)基因會(huì)導(dǎo)致致死表型。沉默褐飛虱(nilaparvata?lugens)排泄器官中高表達(dá)的atp1a1和aqp基因可導(dǎo)致明顯的致死表型并極大少蜜露的產(chǎn)生。除此之外，昆蟲蛻皮過程的基因受到了最廣泛的關(guān)注。將靶向過氧化物酶基因(pxd)的dsrna注射到稻縱卷葉螟(chilo?suppressalis)的末齡幼蟲中，會(huì)破壞幼蟲到蛹變態(tài)過程中表皮的硬化，最終導(dǎo)致幼蟲和蛹的死亡。包括spook(cyp307a1)、phantom(cyp306a1)、disembodied(cyp302a1)、shadow(cyp315a1)和shade(cyp314a1)在內(nèi)的halloween基因參與蛻皮激素20-羥基蛻皮酮(20e)的生物合成，在煙粉虱(bemisia?tabaci)中沉默上述基因可顯著增加其死亡率。由此可知，靶向調(diào)控蛻皮和變態(tài)過程關(guān)鍵基因的核酸農(nóng)藥具有廣闊的應(yīng)用前景。

3、rnai技術(shù)在害蟲防治方面表現(xiàn)出較大潛力，但由于dsrna持久性和穩(wěn)定性較差等因素限制了rnai技術(shù)在害蟲防治中應(yīng)用。目前，納米顆粒介導(dǎo)的dsrna遞送系統(tǒng)展現(xiàn)出克服這一瓶頸的優(yōu)勢(shì)?；诩{米載體的基因遞送系統(tǒng)在制藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。例如，基因可以通過納米載體到達(dá)靶標(biāo)并調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)化療藥物的治療效果。在農(nóng)業(yè)中，納米顆粒已被證明在遞送dsrna方面非常有效，例如，為了提高dsrna的穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)了嵌段共聚物聚乙二醇-聚賴氨酸用于保護(hù)dsrna避免過早降解，促進(jìn)了dsrna在腸道系統(tǒng)中的持久性，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)飛蝗的有效控制。研究發(fā)現(xiàn)，沉默cscyp15c1可顯著增加稻縱卷葉螟的死亡率，進(jìn)一步將該dsrna包裹在dmaema基聚陽離子納米材料中可進(jìn)一步提升幼蟲的死亡率。上述研究表明，基于納米載體的基因遞送系統(tǒng)用于遞送dsrna以控制害蟲是可行的。

4、褐飛虱是最重要的水稻害蟲之一，每年對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p害。褐飛虱是一種不完全變態(tài)昆蟲，需要經(jīng)歷多次蛻皮才能完成發(fā)育。先前的研究表明，與蛻皮相關(guān)的基因在褐飛虱的生長發(fā)育中非常重要。因此，確定對(duì)蛻皮過程至關(guān)重要的基因?qū)τ谑褂胷nai技術(shù)控制褐飛虱至關(guān)重要，并且使用納米材料封裝dsrna以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和持久性是控制褐飛虱的一種實(shí)用方法。

5、目前，同時(shí)包裹dsrna及殺蟲劑的共遞送體系，在一定程度上提升了殺蟲劑的防治效果，但是仍未解決殺蟲劑的施放問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種褐飛虱基因nlcyp303a1及其納米核酸農(nóng)藥。本發(fā)明鑒定了與褐飛虱蛻皮過程密切相關(guān)的基因nlcyp303a1，沉默該基因可導(dǎo)致褐飛虱蛻皮失敗并降低其存活率。本發(fā)明通過zif-8保護(hù)dsnlcyp303a1不被降解，提高了dsnlcyp303a1的遞送效率，提高rnai技術(shù)在褐飛虱防治中的應(yīng)用效果，為褐飛虱防治提供新策略的同時(shí)，為害蟲抗藥性治理提供新方向和新思考。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種褐飛虱基因nlcyp303a1，所述基因nlcyp303a1的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

4、本發(fā)明還提供了一種用于獲得所述褐飛虱基因nlcyp303a1的引物對(duì)，所述引物對(duì)為nlcyp303a1-f2和nlcyp303a1r2，其核苷酸序列分別如seq?id?no：2和3所示。

5、本發(fā)明還提供了一種重組載體l4440-nlcyp303a1，所述重組載體為含有權(quán)利要求1所述基因nlcyp303a1的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體為l4440。

6、本發(fā)明還提供了一種含有所述重組載體l4440-nlcyp303a1的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為ht115感受態(tài)細(xì)胞。

7、本發(fā)明還提供了一種所述宿主細(xì)胞誘導(dǎo)提取dsnlcyp303a1的方法，所述方法是將含有重組載體l4440-nlcyp303a1的宿主細(xì)胞培養(yǎng)至od600＝0.40左右加入iptg，使其終濃度為1mm，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃振蕩培養(yǎng)4h，提取細(xì)菌總rna，純化后得到的dsrna，即為dsnlcyp303a1。

8、本發(fā)明還提供了一種所述制備方法制備得到的dsnlcyp303a1在防治褐飛虱中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明還提供了一種納米核酸農(nóng)藥，按重量份數(shù)計(jì)，所述納米核酸農(nóng)藥的原料包括1份的六水合硝酸鋅、13～15份的2-甲基咪唑和0.06～0.1份的所述制備方法制備得到的dsnlcyp303a1。

10、進(jìn)一步地，按重量份數(shù)計(jì)，所述納米核酸農(nóng)藥的原料包括1份的六水合硝酸鋅、13.86份的2-甲基咪唑和0.08份的dsnlcyp303a1。

11、本發(fā)明還提供了一種納米核酸農(nóng)藥的制備方法，包括以下步驟：

12、(1)按重量份數(shù)計(jì)，稱取1份的六水合硝酸鋅、13～15份的2-甲基咪唑和0.06～0.1份的所述制備方法制備得到的dsnlcyp303a1；

13、(2)將六水合硝酸鋅和2-甲基咪唑分別溶于水中，分別得到六水合硝酸鋅溶液和2-甲基咪唑溶液；

14、(3)將dsnlcyp303a1溶于六水合硝酸鋅溶液中，并與2-甲基咪唑溶液混合，室溫?cái)嚢?，得到混合溶液?/p>

15、(4)將混合溶液離心，棄廢液，加入無水乙醇洗滌沉淀3次，收集沉淀，真空干燥，得到納米核酸農(nóng)藥。

16、本發(fā)明還提供了一種所述納米核酸農(nóng)藥在防治褐飛虱中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、1、本發(fā)明的基因nlcyp303a1及其納米核酸農(nóng)藥可顯著抑制褐飛虱的蛻皮行為，進(jìn)而達(dá)到高效致死的作用，為褐飛虱防控提供新的思路，有助于減少化學(xué)農(nóng)藥在害蟲防治中的應(yīng)用，同時(shí)推動(dòng)了rnai技術(shù)在害蟲防治中的普及，為實(shí)現(xiàn)褐飛虱的高效精準(zhǔn)防控提供了新策略。

19、2、本發(fā)明的dsnlcyp303a1@zif-8納米核酸農(nóng)藥制備方法能夠提高dsnlcyp303a1的遞送效率，解決dsrna持久性和穩(wěn)定性差的問題，從而提高田間防治效率。

20、3、利用ht115-l4440體系誘導(dǎo)表達(dá)得到dsrna，大大降低了dsrna的合成成本。