本發(fā)明屬于獸用生物制品，具體涉及一株nadc34-like?prrsv-2疫苗候選株及其應用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟損失。prrsv感染可引起母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸系統(tǒng)綜合征。最新研究將prrsv-2分為prrsv-1和prrsv-2。我國主要流行的是prrsv-2，其中以高致病性prrsv-2(hp-prrsv-2)、nadc30-like?prrsv-2和nadc34-like?prrsv-2為主。目前，nadc34-like?prrsv-2是流行范圍最廣的毒株之一。

2、prrsv-2是一種單股正鏈rna病毒，屬于動脈炎病毒科，其基因組大小約為15kb，包含10個開放閱讀框(orf)。orf1a和orf1b編碼至少16個非結(jié)構(gòu)蛋白，orf2-7編碼8個結(jié)構(gòu)蛋白。其中，由orf2-4基因編碼的三種小囊膜蛋白(gp2a，gp3和gp4)在病毒囊膜上形成異源三聚體。前人報道，gp2a-gp3-gp4決定動脈炎病毒的細胞嗜性。

3、目前，尚未有nadc34-like?prrsv-2毒株特異性疫苗株的報道。此外，nadc34-likeprrsv-2野毒株無法適應marc-145細胞體外培養(yǎng)，是阻礙其特異性疫苗研制的重要障礙。

4、在前期研究中，我們建立了一株nadc34-like?prrsv-2rbj1805-2株的感染性克隆病毒(發(fā)明名稱：一株nadc34-like豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作平臺的構(gòu)建與應用，專利公開號為cn115992100a)，該感染性克隆病毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為位于中國武漢的武漢大學，保藏號為cctcc?no:v202250，保藏日期為2022.06.29。在上述的前期發(fā)明中，我們將rbj1805-2感染性克隆的orf2-4整體替換為orf2-4con后，使其適應了marc-145細胞培養(yǎng)。然而，目前尚未精確解析orf2-4中使nadc34-like?prrsv-2野毒株適應marc-145細胞的關鍵氨基酸位點，更沒有nadc34-like?prrsv-2特異性疫苗培育的相關報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種能夠進行轉(zhuǎn)染細胞獲得病毒株的rbj-vvl質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。

2、針對我國近年來出現(xiàn)并廣泛流行的nadc34-like?prrsv-2毒株，本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了一種nadc34-like?prrsv-2突變型毒株或其傳代毒株或其獲得方法。傳代病毒的豬體免疫攻毒試驗證明，該改造毒株對nadc34-like?prrsv-2野毒株攻毒具有完全臨床保護效果。

3、本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供了一種nadc34-like?prrsv-2特異性疫苗。

4、技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種rbj-vvl質(zhì)粒，所述rbj-vvl質(zhì)粒是將pacyc177-rbj1805-2反向遺傳平臺的質(zhì)粒為模板，設計針對rbj1805-2病毒的gp2a蛋白第91位、第97位和第98位氨基酸突變?yōu)関、v和l的引物對，采用pcr擴增方法擴增得到突變型片段后與線性化載體連接起來即得。

5、其中，所述引物對包括rbj-xbai-f3和rbj-vvl-r組合以及rbj-vvl-f和rbj-not1-2fu-1組合，分別pcr擴增得到rbj-vvl突變體前段和后段，所述rbj-vvl質(zhì)粒是將突變體前段和后段與線性化載體通過同源重組連接得到，所述引物對序列如下表所示：

6、

7、本發(fā)明還提供了一種nadc34-like?prrsv-2突變型毒株，所述突變型毒株為將nadc34-like?prrsv-2分離株bj1805-2的gp2a蛋白的第91位、第97位和第98位氨基酸由t、m、f分別突變?yōu)関、v和l。

8、其中，所述突變型毒株是將所述的突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后獲得。

9、本發(fā)明一方面提供了一種將nadc34-like?prrsv-2分離株bj1805-2的gp2a-91/97/98位氨基酸由t/m/f模式突變?yōu)関/v/l模式，從而使其適應marc-145細胞培養(yǎng)的精確氨基酸突變改造方法。具體是基于nadc34-like?prrsv-2反向遺傳平臺，通過大量嵌合病毒構(gòu)建與篩選，明確了將nadc34-like?prrsv-2gp2a中91/97/98位氨基酸突變?yōu)関/v/l模式，可使其適應marc-145細胞傳代培養(yǎng)。獲得marc-145細胞適應株rbj-vvl。此外，將v/v/l模式三個點分別回復突變的改造病毒rbj-tvl、rbj-vml和rbj-vvf均無法適應marc-145培養(yǎng)。證明該三個點突變模式為能使nadc34-like?prrsv-2獲得marc-145細胞嗜性的最精確突變模式。

10、本發(fā)明還提供了一種rbj-vvl質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

11、(1)設計針對rbj1805-2病毒的gp2a蛋白第91位、第97位和第98位氨基酸的突變型引物對；所述引物對序列如下表所示；

12、

13、(2)以pacyc177-rbj1805-2反向遺傳平臺的質(zhì)粒為模板，以rbj-xbai-f3和rbj-vvl-r組合，rbj-vvl-f和rbj-not1-2fu-1組合，分別pcr擴增得到rbj-vvl突變體前段和后段，將線性載體片段、突變體前段和后段進行同源重組即得rbj-vvl質(zhì)粒。

14、本發(fā)明還提供了一種nadc34-like?prrsv-2突變型毒株或其傳代毒株的獲得方法，包括以下步驟：

15、其包括所述的步驟(1)和(2)，還包括步驟(3)將rbj-vvl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞即得；或?qū)⑵溥M一步傳代獲得傳代毒株。

16、其中，所述細胞包括pam細胞或marc-145細胞。

17、在本發(fā)明的另一個方面，提供了nadc34-like?prrsv-2高度適應marc-145細胞的體外傳代毒株。具體是將rbj-vvl進行marc-145細胞體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，并對傳代十代、三十代和五十代的傳代毒株進行marc-145細胞的tcid50生長曲線測定，獲得了有極高產(chǎn)量的nadc34-like?prrsv-2體外傳代病毒。

18、本發(fā)明所述的rbj-vvl質(zhì)粒、所述的毒株或其傳代毒株在制備預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗中的應用。

19、本發(fā)明還提供了一種nadc34-like?prrsv-2特異性疫苗，所述nadc34-likeprrsv-2特異性疫苗包括所述的毒株或其傳代毒株或其滅活毒株。

20、其中，所述疫苗為注射劑、滴劑、噴霧劑或其他劑型制劑。

21、本發(fā)明的最后一個方面，提供了無法適應marc-145細胞的rbj1805-2親本毒株以及rbj-vvl第十代和第三十代體外傳代毒株的免疫保護效果評估結(jié)果。具體是將rbj1805-2、rbj-vvl第十代和第三十代毒株進行豬體免疫接種，并在免疫后42天進行nadc34-likeprrsv-2野毒株攻毒試驗。在此期間進行體溫、體重和病毒血癥的監(jiān)測，并在試驗完成后觀察豬體肺部病變，進行he染色和免疫組化試驗。證實基于rbj-vvl培育的傳代毒株不僅安全，還可為豬體提供抗nadc34-like?prrsv-2野毒攻毒的完全臨床保護。因此，可用于創(chuàng)制首個nadc34-like?prrsv-2特異性疫苗。

22、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點：本發(fā)明基于nadc34-likeprrsv-2反向遺傳操作平臺，獲得了一株通過精確突變gp2a中91/97/98氨基酸位點而獲得marc-145細胞嗜性的改造毒株rbj-vvl；本發(fā)明所構(gòu)建的改造病毒接種marc-145細胞傳代培育可引起細胞病變(cpe)并形成空斑；以rbj-vvl第一代適應毒為親本毒株，通過marc-145細胞體外連續(xù)傳代，培育了marc-145細胞適應型nadc34-like?prrsv-2毒株rbj-vvl-p10、rbj-vvl-p30和rbj-vvl-p50；本發(fā)明獲得的marc-145細胞傳代病毒具有極高的病毒載量，能夠在短時間內(nèi)獲得大量新子代病毒(達到106.9tcid50/ml)；本發(fā)明獲得的marc-145細胞傳代病毒具有良好的安全性，接種豬體后不引起發(fā)熱(體外<40℃)，更不會引起仔豬死亡；用nadc34-like?prrsv-2野毒株攻擊時，marc-145細胞傳代病毒均能夠提供完全臨床保護；培育的marc-145細胞適應型改造傳代毒株用于創(chuàng)制首個nadc34-like?prrsv-2疫苗。