本發(fā)明屬于生物檢測，具體涉及定量檢測基質(zhì)金屬蛋白酶7(mmp-7)的熒光層析試紙條、試劑盒及應用。

背景技術(shù)：

1、基質(zhì)金屬蛋白酶7(mmp-7)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中重要的一員，以酶原形式分泌，正常生理條件下，mmp-7聯(lián)合其特異的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物共同維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。mmp-7在正常健康肝臟組織中存在較少，但在膽道閉鎖(biliary?atresia，ba)和肝纖維化的肝組織中表達水平大大增加，主要分布在ba患兒的膽管上皮kuffer細胞及內(nèi)皮細胞。當膽管受梗阻或炎癥損傷時，膽管上皮細胞向管腔內(nèi)釋放mmp-7，此時血清學可檢測到mmp-7水平的升高。最新多項研究已經(jīng)證實，將血液中的mmp-7作為標志物，用于ba的診斷具有良好的準確性和臨床應用前景。

2、ba是嚴重威脅嬰兒生命的膽道梗阻性疾病，2023年9月被列入國家衛(wèi)生健康委員會、國家藥品監(jiān)督管理局等6部門聯(lián)合發(fā)布的《關于公布第二批罕見病目錄》。葛西手術(shù)是目前治療膽道閉鎖的有效手段，但手術(shù)時患兒的年齡起關鍵作用，早期明確診斷并且施行手術(shù)可顯著改善患兒預后，否則預后大多不良，因此膽道閉鎖的早期診斷尤為重要。我國2022年發(fā)布的《膽道閉鎖診斷與治療循證實踐指南》推薦膽汁淤積患兒行基質(zhì)金屬蛋白酶7(mmp-7)診斷膽道閉鎖。對于膽道閉鎖患兒而言，手術(shù)后的定期隨訪也具有非常重要的意義，可及早發(fā)現(xiàn)康復過程中出現(xiàn)的問題，提高自體肝生存率。

3、由于ba是一種進行性肝內(nèi)、外膽管纖維化疾病，該病表現(xiàn)為黃疸、肝腫大、膽汁性便，這些臨床癥狀與其它非ba的膽汁淤積性肝病非常相似，國際上尚無可靠的無創(chuàng)診斷方法將ba與其它原因引起的膽汁淤積癥區(qū)分開來。目前，臨床上用于ba診斷的金標準確診方法為術(shù)中膽管造影和肝活檢，均屬于侵入性檢測，該檢測手段易使病人遭受痛苦，且需由臨床經(jīng)驗非常豐富的專家醫(yī)師結(jié)合醫(yī)療影像等輔助設備手工操作，對于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，由于醫(yī)療設施資源相對落后，診療水平有限的醫(yī)療單位，將難以開展上述醫(yī)療診斷工作，不利于ba患者的及時確診，容易錯過施行葛西手術(shù)的最佳窗口期。為此，開發(fā)一種安全、有效、快捷的可無創(chuàng)診斷ba的方法，將會讓非ba的膽汁淤積性肝病患者避免侵入性手術(shù)檢查等過度診療，減輕病人痛苦，并且可盡早識別ba患者，及時施行葛西手術(shù)，改善患兒預后提高自體肝生存率。

4、中國申請cn108267585a公開了一種基于血清標志物mmp-7的膽道閉鎖診斷試劑盒，其中包含抗人單克隆抗體包被的酶標板、陰性對照液、陽性對照液、酶標試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液。所述試劑盒能定量測定人血清中mmp-7水平，有助于早期診斷ba。但是，該試劑盒僅適用于檢測血清樣本類型，不能用于檢測血漿和全血樣本。其次，該試劑盒基于酶聯(lián)免疫吸附實驗方法(elisa)，該方法操作步驟繁瑣，涉及多次的加樣孵育反應和洗滌操作，如果洗滌不徹底極易造成假陽性結(jié)果，并且每次檢測都需同時設置校準品孔和制備標準曲線，增加了檢測操作者的工作負擔，降低了試劑盒的使用效率。另外，操作費時，不包含樣本預處理時間，僅完成1份樣本的檢測時間，至少需要耗費3.5小時以上，且需要專業(yè)檢測人員在實驗室借助酶標儀等設備進行操作，不適合床旁即時診斷(poct)的推廣使用。

5、中國申請cn115561458a公開了一種用于診斷膽道閉鎖的膠體金快速檢測卡，所述檢測卡包括順次搭接于底板上的樣品墊、金標結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊等組分。所述檢測卡可用于對人血清/血漿或全血樣本中mmp-7的快速檢測，適用于現(xiàn)場對膽道閉鎖患者的快速篩查和輔助診斷。但是，該申請中的檢測方法只能做為膽道閉鎖的定性檢測，系采用雙抗體夾心法原理檢測樣本中mmp-7抗原，涉及的檢測抗體和捕獲抗體，均為利用傳統(tǒng)小鼠雜交瘤細胞融合技術(shù)制備得到的鼠源單克隆抗體，而應用雙鼠單克隆抗體建立的夾心檢測抗原的方法，待檢樣本中可能會存在人抗小鼠抗體的干擾反應(hama)，導致產(chǎn)生假陽或假陰性的檢測結(jié)果。另外，由于本技術(shù)中的試劑盒檢測方法僅用于定性檢測，因此對處于ba診斷臨界值附近的灰區(qū)樣本，診斷結(jié)果難以判定，容易出現(xiàn)假陰或假陽結(jié)果，造成誤診。

6、熒光免疫層析檢測方法，相校于現(xiàn)有的用于診斷ba的臨床金標準方法，如術(shù)中膽管造影、肝活檢方法，克服了需侵入性檢測，需配備昂貴的儀器設備，需專業(yè)臨床醫(yī)師進行檢測操作等弊端。同時，相較于基于免疫學原理的其它檢測方法，如酶聯(lián)免疫法、膠體金法，克服了檢測過程操作步驟繁瑣，需專業(yè)檢測人員進行檢驗操作，以及臨界值灰區(qū)樣本的檢測準確度不高和檢測結(jié)果難以判讀等不足。另外，由于mmp-7屬于mmp大家族成員，與其它主要家族成員具有類似的結(jié)構(gòu)和特性，容易產(chǎn)生交叉反應性。因此，對用于建立夾心法檢測mmp-7抗原所使用的抗體，就要求具有較高的靈敏度和特異性，且抗干擾能力強，而兔子相較于其它常用動物模型如小鼠擁有更強大的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生的抗體具有更高的靈敏度、特異性、親和力以及多樣性。

7、目前，獲取較高靈敏度和特異性好的抗人mmp-7兔單克隆抗體，并能夠應用到雙抗夾心熒光免疫層析方法，制備成抗干擾能力強、特異性好、線性范圍寬、準確度高，可用于膽道閉鎖輔助診斷用途的熒光免疫層析試紙條和試劑盒，還存在技術(shù)上的難題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于雙抗體夾心法可定量檢測人血清/血漿或全血樣本中mmp-7的熒光免疫層析法試劑盒及其應用。本發(fā)明成功開發(fā)了一對高親和力的抗人mmp-7兔單克隆抗體，進一步開發(fā)出雙抗夾心可定量檢測mmp-7的熒光免疫層析法檢測試劑盒，用于對人血清/血漿或全血樣本中mmp-7的快速定量檢測，基于該試劑盒的檢測方法具有抗干擾能力強、特異性好、線性范圍寬、批間差小，與臨床金標準診斷方法的檢測結(jié)果一致性高等優(yōu)點，并且檢測過程簡便、快速，可應用于對臨床膽道閉鎖疾病的輔助診斷，具有廣闊的市場應用價值。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種定量檢測mmp-7的熒光層析試紙條，所述試紙條包括依序搭接在pvc底板上的樣本墊、結(jié)合墊、包被膜和吸水墊；所述結(jié)合墊包被有熒光微球標記抗人mmp-7兔單克隆抗體?。凰霭荒ど显O置有劃線的檢測區(qū)(t線)和質(zhì)控區(qū)(c線)；所述檢測區(qū)(t線)包被有抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ，質(zhì)控區(qū)(c線)包被有羊抗兔igg；檢測時，待檢樣本通過樣本墊上樣，樣本中的mmp-7與結(jié)合墊中的熒光微球標記抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ結(jié)合形成免疫復合物，該復合物隨著膜的毛細管作用向上遷移到達檢測區(qū)(t線)，與膜上的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ發(fā)生免疫反應，經(jīng)特定波長激發(fā)光源激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號，信號的強弱與樣本中的mmp-7含量成正比。

3、本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合人mmp-7的單克隆抗體，為如下a)-c)中任一：

4、a)抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列如seq?id?no:5，seq?id?no:6及seq?id?no:7所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列seq?id?no:8，seq?id?no:9及seq?id?no:10所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；

5、b)抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列如seq?id?no:15，seq?id?no:16及seq?id?no:17所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列seq?id?no:18，seq?id?no:19及seq?idno:20所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；

6、c)上述a)和b)的組合。

7、進一步地，所述抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ的輕鏈可變區(qū)序列為seq?id?no:3所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)序列為seq?id?no:4所示的氨基酸序列；所述抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ的輕鏈可變區(qū)序列為seq?id?no:13所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)序列為seq?idno:14所示的氨基酸序列。

8、進一步地，所述抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ的輕鏈序列為seq?id?no:1所示的氨基酸序列，重鏈氨基酸序列為seq?id?no:2；所述抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ的輕鏈序列為seqid?no:11所示氨基酸，重鏈氨基酸序列為seq?id?no:12所示氨基酸。

9、本發(fā)明還提供了一種生物材料，所述生物材料為下述d1)至d5)中的任一種：

10、d1)編碼權(quán)利要求1-3中任一所述單克隆抗體的核酸分子；

11、d2)含有d1)所述核酸分子的表達盒；

12、d3)含有d1)所述核酸分子的重組載體、或含有d2)所述表達盒的重組載體；

13、d4)含有d1)所述核酸分子的重組微生物、或含有d2)所述表達盒的重組微生物、或含有d3)所述重組載體的重組微生物；

14、d5)含有d1)所述核酸分子的細胞系、或含有d2)所述表達盒的細胞系、或含有d3)所述重組載體的細胞系。

15、本發(fā)明還提供了上述任一所述單克隆抗體或含有其的組合物或試劑盒或生物材料在制備定量檢測樣本中mmp-7含量或診斷、輔助診斷膽道閉鎖疾病產(chǎn)品中的用途。

16、進一步地，所述產(chǎn)品為試劑盒，所述試劑盒為熒光層析試紙條，所述產(chǎn)品的樣本取自血清、血漿或全血。

17、本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測mmp-7的試劑盒，包含權(quán)利要求1-3任一所述的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ和抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ或二者的抗原結(jié)合部分，以及配套的檢測試劑。

18、進一步地，所述試劑盒為熒光層析試紙條，所述試紙條包括依序搭接在pvc底板上的樣本墊、結(jié)合墊、包被膜和吸水墊；所述結(jié)合墊包被有熒光微球標記抗人mmp-7兔單克隆抗體??；所述包被膜上設置有劃線的檢測區(qū)(t線)和質(zhì)控區(qū)(c線)；所述檢測區(qū)(t線)包被有抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ，質(zhì)控區(qū)(c線)包被有羊抗兔igg，其中，檢測抗體為熒光微球標記的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ，捕獲抗體為抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ。

19、本發(fā)明還提供了上述定量檢測mmp-7的熒光層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

20、1)樣本墊的制備：將樣本墊用處理液浸泡0.5～1h，置于濕度＜25％，溫度為45℃～60℃的烘箱，干燥12～24h，密封后置于室溫條件下保存；

21、2)結(jié)合墊的制備：將熒光微球標記的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ偶聯(lián)物，用微球保存液稀釋至濃度為0.05～0.1mg/ml噴涂在結(jié)合墊上，噴量為3～5μl/cm，噴涂完成后，將結(jié)合墊置于濕度＜25％的45℃～60℃的烘箱，干燥12～24h，密封保存；

22、3)包被膜的制備：將抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ、羊抗兔igg分別用包被液稀釋至濃度為0.5～1.0mg/ml,然后分別噴涂到包被膜的檢測區(qū)(t線)和質(zhì)控區(qū)(c線)，噴涂量均為1.0μl/cm，t線和c線的間隔為5-7mm，噴涂完成后，將包被膜置于濕度＜25％的45℃～60℃的烘箱，干燥12～24h，密封保存；

23、4)試紙條的制備：將制備的樣本墊、結(jié)合墊、包被膜，以及吸水墊依序搭接粘貼在pvc底板上，并切割成3～4mm寬度的試紙條，即得所述定量檢測mmp-7的熒光層析試紙條。

24、進一步地，所述處理液包括：0.2～1％的牛血清白蛋白，1％～5％的蔗糖，0.2～1％海藻糖、0.03～0.1％的tween-20，0.02～0.05％的proclin300，ph7.4的0.02m?pbs緩沖液；所述微球保存液包括：0.8～1.2％的牛血清蛋白，1～5％海藻糖，0.05～0.1％的tween-20，0.02～0.05％的proclin300，ph8.5的0.25m?tris緩沖液；所述包被液包括：1％～2％的蔗糖，0.02～0.05％的proclin300，ph7.4的0.1m?pbs緩沖液。

25、本發(fā)明還提供了一種非疾病診斷或治療目的的定量檢測樣本中mmp-7含量的方法，采用上述試劑盒進行檢測，檢測時，待檢樣本通過樣本墊上樣，樣本中的mmp-7與結(jié)合墊中的熒光微球標記抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ結(jié)合形成免疫復合物，該復合物隨著膜的毛細管作用向上遷移到達檢測區(qū)(t線)，與膜上的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ發(fā)生免疫反應，經(jīng)特定波長激發(fā)光源激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號，信號的強弱與樣本中的mmp-7含量成正比。

26、進一步地，所述樣本取自血清、血漿或全血。

27、進一步地，包括以下步驟：

28、(1)將檢測試劑盒和待檢樣本恢復至室溫；

29、(2)使用艾格立特(武漢)科技有限公司生產(chǎn)的熒光免疫層析分析儀(型號：igreat-if-f10)進行測試：打開熒光分析儀，插入與試劑批號相同的id卡，在儀器上正確選擇相應的“樣本類型”和“測試項目”；

30、(3)吸取20μl待檢樣本加入到配套樣本稀釋液中充分混勻，取100μl混勻后的樣本，垂直滴加至檢測卡加樣區(qū)，開始計時；

31、(4)加樣15分鐘后，立即將檢測卡插入熒光分析儀(艾格立特(武漢)科技有限公司生產(chǎn)，型號：igreat-if-f10)卡槽中，按下“快速測試”鍵，儀器會自動測試并顯示結(jié)果

32、本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：

33、(1)本發(fā)明以基質(zhì)金屬蛋白酶7(mmp-7)作為診斷膽道閉鎖的生物標志物，成功開發(fā)了一對高親和力的抗人mmp-7兔單克隆抗體，進一步開發(fā)出雙抗夾心可定量檢測mmp-7的熒光免疫層析法檢測試劑盒。本發(fā)明利用真核哺乳動物細胞表達mmp-7重組蛋白并作為免疫原，免疫新西蘭大白兔，從兔脾臟細胞中分離單個抗原特異性b淋巴細胞，將陽性克隆b淋巴細胞對應的重鏈、輕鏈基因分別構(gòu)建于表達載體，獲得重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293f細胞，從細胞培養(yǎng)物上清中篩選純化出可應用于雙抗夾心熒光免疫層析方法的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ和抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ。

34、(2)本發(fā)明所提供的基于所述的抗人mmp-7兔單克隆抗體所建立的檢測mmp-7的熒光免疫層析檢測方法具有高特異性和抗干擾能力，其中檢測抗體為經(jīng)熒光微球標記的本發(fā)明中的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅰ，捕獲抗體為本發(fā)明中的抗人mmp-7兔單克隆抗體ⅱ。檢測mmp大家族其它成員蛋白，均無交叉反應發(fā)生。檢測驗證明顯存在溶血、脂血、以及黃疸的異常樣本時，與正常對照相比，對檢測結(jié)果無干擾和顯著影響。

35、(3)本發(fā)明熒光免疫層析試紙條、試劑盒，適用于對人血清/血漿或全血樣本中mmp-7的快速定量檢測，可應用于對臨床膽道閉鎖疾病的輔助診斷，檢測過程簡便、快速，試劑盒抗干擾能力強、特異性好、線性范圍寬、批間差小，與臨床金標準診斷方法的檢測結(jié)果一致性高。