本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的，涉及一種修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法、由該方法制備得到的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、免疫療法已經(jīng)成為包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的有效治療方法。免疫療法能夠通過靶向疾病靶點發(fā)揮作用，從而特異、有效的實現(xiàn)治療目的。但是，在向受試者施用靶向與疾病或病癥相關(guān)的抗原的免疫療法(例如car-t細胞療法)時，該免疫療法不僅可以耗盡意圖靶向的病理性細胞，還存在耗盡可以表達靶向抗原的非病理性細胞的風險。一些car-t細胞療法(例如針對靶點cd19或cd33的療法)已報道了這種情況。這無疑會成為向患者使用免疫療法時的消極因素。因為如果靶向抗原表達在受試者生存所需的正常細胞表面上，或者表達在若消耗則會明顯損害受試者身體健康的細胞表面上，則受試者可能無法接受該免疫療法，或需要承受一旦施用這種療法則可能出現(xiàn)的嚴重的副作用。另一種情況下，當需要施用的免疫療法所使用的免疫效應(yīng)細胞上也表達同樣的抗原時，例如靶抗原也表達在car-t細胞的細胞表面上時，就可能導(dǎo)致免疫效應(yīng)細胞的自相殘殺，并使得相應(yīng)細胞療法無法實現(xiàn)預(yù)期的效果甚至完全不產(chǎn)生作用?？尚械慕鉀Q方案例如可以采用基因修飾的方法來制備相關(guān)抗原表達缺失的細胞，以降低或彌補這些問題帶來的不良后果。例如，若受試者的健康造血細胞表達抗原，則可以制備工程化的造血細胞，使得所述細胞的相關(guān)抗原的表達缺失，再向受試者施用這類工程化造血細胞(如造血干細胞或祖細胞)，這些造血干細胞或祖細胞能夠重新補強受試者體內(nèi)的造血能力，并且經(jīng)增殖重建各種造血譜系，包括可能已被靶向治療藥物清除的造血譜系。又例如，當向受試者施用的工程化免疫效應(yīng)細胞(如car-t細胞)表面上表達相同的靶抗原時，則可以通過基因修飾方法將所述免疫效應(yīng)細胞的相關(guān)抗原的表達缺失，以避免免疫效應(yīng)細胞的自相殘殺。

2、cd7(t細胞抗原7)，又稱作gp40、tp41、leu-9，是一種分子量為40kda的單鏈跨膜糖蛋白，包含有240個氨基酸。cd7通常表達于85％的外周血t細胞和nk細胞及其前體細胞，在早期淋巴發(fā)育過程中起到激活t細胞和nk細胞的作用，并且能夠介導(dǎo)t細胞之間、t細胞和b細胞之間的相互作用，是一種輔助t細胞活化以及與其他免疫亞群細胞相互作用的共刺激受體蛋白。cd7在大多數(shù)的t細胞、nk細胞、髓細胞、t細胞急性淋巴細胞白血病/淋巴瘤、急性粒細胞性白血病和慢性粒細胞白血病的腫瘤細胞中均有表達，尤其在大多數(shù)的t細胞急性淋巴細胞白血病和部分的t細胞急性髓系白血病的腫瘤細胞中高表達，這使得cd7有望成為治療白血病和淋巴瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有潛力的治療靶點。

3、為了保證cd7靶向的免疫治療方法的效果，避免消耗表達cd7的健康細胞或表達cd7的工程化的免疫效應(yīng)細胞，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾使內(nèi)源性cd7基因表達降低的細胞，所述細胞不會成為靶向免疫治療藥物的目標，也就不會產(chǎn)生被藥物“意外”清除的問題。所述細胞能夠施用于接受靶向抗原治療的受試者，例如，通過施用所述細胞從而以便于替換可能已被靶向治療藥物靶向并殺死的健康細胞，或是提供對靶向治療藥物有抗性的健康細胞群。

4、在細胞的基因編輯/修飾領(lǐng)域中常用的基因編輯系統(tǒng)包括，例如zfns、talens、crispr/cas系統(tǒng)等。crispr基因編輯系統(tǒng)是一種快速、有效的基因編輯方法，其中的crispr/cas9系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的crispr/cas系統(tǒng)之一，其能夠高效、精確地對目標dna序列進行刪除、替換和插入，在許多生物學應(yīng)用中顯示出巨大的潛力。crispr/cas9系統(tǒng)進行基因編輯的機制包括：與特定靶序列(原間隔序列)同源的crispr陣列被轉(zhuǎn)錄為許多前crispr?rna(pre-crrna)，這些pre-crrna與更小的反式激活crrna(tracrrna)通過堿基配對形成復(fù)合物。這種復(fù)合物可以與cas9蛋白結(jié)合，導(dǎo)致較長的pre-crrna被rna酶iii切割，分離成單獨的crrna/tracrrna復(fù)合物。當crrna/tracrrna將cas9復(fù)合物引導(dǎo)至目標序列時，crrna結(jié)合原間隔序列相鄰基序(pam)后的目標序列，靶序列解旋，并被cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域(ruvc和hnh)切割，造成雙鏈斷裂，進而激活細胞的非同源末端連接(non-homologous?end?joining,nhej)或同源定向修復(fù)(homology?directed?repair,hdr)兩種修復(fù)機制，從而實現(xiàn)基因的刪除、替換或插入。通過將crrna和tracrrna進行生物工程改造，組合成為一個具備crrna和tracrrna功能的向?qū)na(guide?rna，grna)分子。grna分子與目標dna序列互補匹配，并決定了cas9蛋白定向切割的特異性。grna分子的一部分序列可以與cas核酸酶結(jié)合，另外一部分序列可以與靶基因的部分序列互補，借助grna分子的識別作用使得cas核酸酶可以在靶基因特定位點形成單鏈或雙鏈切口，從而實現(xiàn)對靶基因的編輯。

5、近年來，基于crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)高效精準的基因編輯功能，其在哺乳動物細胞的基因編輯中得到了廣泛應(yīng)用，這也促進了腫瘤免疫治療的極大進步，尤其是極大促進了嵌合抗原受體t細胞(car-t細胞)的制備和應(yīng)用。

6、嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor,car)修飾的t細胞作為一種免疫治療策略，在許多實體腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤，尤其是淋巴細胞腫瘤的治療中受到廣泛的應(yīng)用。嵌合抗原受體是一種重組多肽構(gòu)建體，其代表性結(jié)構(gòu)由細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(通常為具有抗原識別功能的單鏈抗體)、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域四部分組成。通常根據(jù)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是否加入共刺激分子以及加入的數(shù)量，將經(jīng)典的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)分為第一代(無共刺激分子)、第二代(包含一種共刺激分子)和第三代(包含兩種共刺激分子)。截止目前，第二代嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)設(shè)計在上市產(chǎn)品和臨床研究階段中應(yīng)用最多。嵌合抗原受體的原理為通過基因工程修飾，使t細胞表達可以特異性識別腫瘤細胞表面抗原的受體結(jié)構(gòu)(例如，單鏈抗體)，并在該受體與腫瘤細胞表面抗原特異性結(jié)合后，激活其下游的免疫共刺激分子和t細胞，突破主要組織相容性復(fù)合體(mhc)的限制，直接特異性識別并殺傷腫瘤細胞，實現(xiàn)靶向清除惡性腫瘤的目的。

7、由于cd7抗原表達在成熟的t細胞表面，因此在制備靶向cd7的car-t細胞的過程中存在car-t細胞識別自身抗原而導(dǎo)致自相殘殺的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象導(dǎo)致car-t細胞存續(xù)時間很短和殺傷能力顯著降低。為解決該“自殺”現(xiàn)象帶來的問題，本發(fā)明采用crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)預(yù)先對t細胞進行基因修飾，使得細胞表面cd7的表達顯著降低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了修飾內(nèi)源性cd7基因的方法以及由該方法制備的細胞，如造血細胞、免疫細胞、淋巴細胞(例如t細胞)。所述細胞具有降低的cd7抗原表達，使其能夠不被cd7特異性免疫療法識別。本發(fā)明還提供了向受試者施用該細胞或包含其的組合物，以解決免疫治療中的脫靶問題的方法，所述細胞或包含其的組合物對cd7特異性免疫療法的殺傷具有抗性。本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞還能夠解決靶向cd7的免疫效應(yīng)細胞的自相殘殺問題，例如當所述細胞是靶向cd7的car-t細胞時，其具有降低的cd7抗原表達，因此可以減弱或不發(fā)生靶向cd7的car-t細胞的自相殘殺現(xiàn)象，從而提高car-t細胞治療的持續(xù)性，保證治療的有效性。

2、根據(jù)本公開的第一方面，本發(fā)明提供一種修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法，所述方法包括：

3、提供一種待基因修飾的細胞；

4、將試劑引入待基因修飾的細胞中，所述試劑包含：(i)靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna或用于表達所述grna的表達載體，其中所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如

5、seq?id?no:1、seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?idno:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10、seq?id?no:11、seq?id?no:12、seq?id?no:13、seq?id?no:14、seq?id?no:15、seq?id?no:16、seq?id?no:17或seq?id

6、no:18任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性變體、或表達所述cas9蛋白或其功能性變體的表達載體；

7、收獲經(jīng)基因修飾的細胞；

8、使得所述經(jīng)基因修飾的細胞中的cd7抗原的表達減少。

9、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法使得所述經(jīng)基因修飾的細胞中的cd7抗原的表達減少至少50％、減少至少60％或減少至少70％。

10、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法使得所述經(jīng)基因修飾的細胞中的cd7抗原的表達減少至少50％、減少至少60％、減少至少70％、減少至少80％、減少至少90％或減少至少95％。

11、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法中將所述試劑引入待基因修飾的細胞的方式包括電穿孔、核轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)納米粒轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些實施方案中，將所述試劑引入待基因修飾的細胞的方式為電穿孔。

12、本發(fā)明提供的方法中所述的grna分子與cas9蛋白一起使用，以實現(xiàn)對細胞內(nèi)源性cd7基因的基因編輯。cas9蛋白表現(xiàn)出核酸酶活性，其在靶位點中或直接鄰近靶位點引入雙鏈dna斷裂。各種cas核酸酶(例如cas9)是本領(lǐng)域已知的并且可以從各種來源獲得和/或被改造/修飾以調(diào)節(jié)酶的一種或多種活性或特異性。合適的cas9核酸酶(例如spcas9和sacas9)的pam序列和特異性是本領(lǐng)域已知的。

13、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的待基因修飾的細胞為干細胞。

14、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的干細胞可以選自胚胎干細胞(esc)、誘導(dǎo)多能干細胞(ipsc)、間充質(zhì)干細胞或組織特異性干細胞或它們的任何組合。

15、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的待基因修飾的細胞為造血細胞。

16、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的造血細胞為造血干細胞或造血祖細胞。

17、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的待基因修飾的細胞為免疫效應(yīng)細胞。

18、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的免疫效應(yīng)細胞可以選自t細胞、b細胞、nk細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、由誘導(dǎo)性多能干細胞(ipsc)分化而成的免疫效應(yīng)細胞或它們的任何組合。

19、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的免疫效應(yīng)細胞為t細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的t細胞可以選自cd4+/cd8+t細胞、cd4+/cd8-t細胞、cd4-/cd8+t細胞、cd4-/cd8-t細胞、cd4+輔助t細胞(例如th1和th2細胞)、cd8+t細胞(例如，細胞毒性t細胞)、腫瘤浸潤細胞、記憶t細胞、幼稚t細胞、γδ-t細胞、αβ-t細胞、nkt細胞、dnt細胞(雙陰性t細胞)。

20、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的t細胞是cd4+/cd8-t細胞、cd4-/cd8+t細胞、cd4+/cd8+t細胞、cd4-/cd8-t細胞或它們的任何組合。

21、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法，還包括以下步驟：在將所述試劑引入待基因修飾的細胞之前進行配制試劑的步驟，該步驟包括：將crrna和tracrrna混合以形成grna復(fù)合物，以及將grna復(fù)合物與cas9蛋白混合，從而得到試劑。

22、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法，還包括以下步驟：在將所述試劑引入待基因修飾的細胞之前進行配制試劑的步驟，該步驟包括：將crrna和tracrrna按照比例1:1加入至nuclease-free?duplex?buffer中，總體積為100μl，在95℃的溫度下退火5min，得到的grna復(fù)合物，以及將grna復(fù)合物與cas9蛋白混合，從而得到試劑。

23、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法，還包括以下步驟：在將所述試劑引入待基因修飾的細胞之前進行配制試劑的步驟，該步驟包括：將crrna和tracrrna按照比例1:1加入至nuclease-free?duplex?buffer中，總體積為100μl，在95℃的溫度下退火5min，得到的grna復(fù)合物，以及在opti-mem中分別加入grna復(fù)合物、cas9蛋白和1μm電穿孔增強子，從而得到試劑。

24、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法，還包括在將所述試劑引入待基因修飾的細胞之前將細胞活化。

25、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的修飾細胞內(nèi)源性cd7基因的方法，還包括在收獲經(jīng)基因修飾的細胞后，擴增獲得的細胞。

26、根據(jù)本公開的第二方面，本發(fā)明提供了一種將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入本公開第一方面制備得到的細胞的方法。

27、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入本公開第一方面制備得到的細胞的方法包括：在將所述試劑引入待基因修飾的細胞之前將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入本公開第一方面制備得到的細胞的方法包括：在將所述試劑引入待基因修飾的細胞之后將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞。

28、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的能夠特異性識別抗原的靶向配體可以選自嵌合抗原受體(car)、t細胞抗原受體(tcr)或b細胞抗原受體(bcr)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的能夠特異性識別抗原的靶向配體為嵌合抗原受體(car)。

29、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的載體為病毒載體或非病毒載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的病毒載體可以選自慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法所述的病毒載體為慢病毒載體。

30、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入第一方面制備得到的細胞的方法，包括如下步驟：按照本公開的第一方面所述的方法制備內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞；將包含表達能夠特異性識別抗原的靶向配體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞。

31、在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種將包含表達能夠特異性識別cd7抗原的嵌合抗原受體的核酸分子的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入按照本公開第一方面所述的方法制備得到的細胞的方法。

32、在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種制備內(nèi)源性cd7基因修飾的嵌合抗原受體t細胞的方法，其中所述方法包括如前所述的細胞制備方法，所述細胞為人t細胞。

33、根據(jù)本公開的第三方面，本發(fā)明提供一種靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:1-18任一所示的核酸序列。

34、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:1所示的核酸序列。

35、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:2所示的核酸序列。

36、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:3所示的核酸序列。

37、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:4所示的核酸序列。

38、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:5所示的核酸序列。

39、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:6所示的核酸序列。

40、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:7所示的核酸序列。

41、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:8所示的核酸序列。

42、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:9所示的核酸序列。

43、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:10所示的核酸序列。

44、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:11所示的核酸序列。

45、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:12所示的核酸序列。

46、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:13所示的核酸序列。

47、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:14所示的核酸序列。

48、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:15所示的核酸序列。

49、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:16所示的核酸序列。

50、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:17所示的核酸序列。

51、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna，所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:18所示的核酸序列。

52、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，其中，seq?id?no:1-18所示的具體核酸序列信息如表1中所示。

53、表1

54、

55、

56、本發(fā)明提供的grna能夠用于制備內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞。本發(fā)明提供的grna能夠結(jié)合至細胞內(nèi)源性cd7基因組中的靶位點，可以實現(xiàn)基因組的有效、甚至更高效的修飾，導(dǎo)致細胞的cd7抗原表達降低，或不被靶向cd7的免疫治療藥物識別，從而使得經(jīng)基因修飾的細胞具備醫(yī)療應(yīng)用前景。

57、根據(jù)本公開的第四方面，本發(fā)明提供一種用于制備內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞的試劑，所述試劑包含：

58、(i)靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna或用于表達所述grna的表達載體，其中所述grna包含間隔序列，所述間隔序列為如seq?id?no:1、seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?idno:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10、seq?id?no:11、seq?id?no:12、seq?id?no:13、seq?id?no:14、seq?id?no:15、seq?idno:16、seq?id?no:17或seq?id?no:18任一所示的核酸序列，和(ii)cas9蛋白或其功能性變體、或表達所述cas9蛋白或其功能性變體的表達載體。

59、將本發(fā)明提供的試劑引入細胞能夠使細胞表面的cd7抗原表達降低，從而獲得cd7抗原表達低、甚至不表達的修飾的細胞。因此，本發(fā)明提供的試劑能夠用于制備內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞。

60、根據(jù)本公開的第五方面，本發(fā)明提供一種內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，所述細胞為通過本公開的第一方面所述的方法制備獲得。

61、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞中的cd7抗原表達減少至少50％、減少至少60％或減少至少70％。

62、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞中的cd7抗原表達減少至少50％、減少至少60％、減少至少70％、減少至少80％、減少至少90％或減少至少95％。

63、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，還包含能夠特異性識別抗原的靶向配體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，還包含能夠特異性識別抗原的靶向配體可以選自嵌合抗原受體(car)、t細胞抗原受體(tcr)、b細胞抗原受體(bcr)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，還包含能夠特異性識別抗原的靶向配體為嵌合抗原受體(car)。

64、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中所述嵌合抗原受體(car)包含能夠特異性識別cd7抗原的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中所述嵌合抗原受體還進一步包含共刺激結(jié)構(gòu)域。

65、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中能夠特異性識別cd7抗原的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含特異性識別cd7抗原的單鏈抗體、單域抗體、重鏈抗體或納米抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中能夠特異性識別cd7抗原的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含特異性識別cd7抗原的單鏈抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中能夠特異性識別cd7抗原的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含特異性識別cd7抗原的單域抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中能夠特異性識別cd7抗原的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含特異性識別cd7抗原的重鏈抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中能夠特異性識別cd7抗原的細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含特異性識別cd7抗原的納米抗體。

66、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中跨膜結(jié)構(gòu)域來源于cd8α和/或cd28。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來源于cd3ζ。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中共刺激信號結(jié)構(gòu)域來源于cd28、cd27、4-1bb(cd137)、ox40和/或cd278(icos)。

67、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中嵌合抗原受體進一步包含位于細胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域c端和跨膜結(jié)構(gòu)域n端之間的鉸鏈區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中鉸鏈區(qū)來源于cd8α。

68、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中嵌合抗原受體進一步包含位于嵌合抗原受體多肽n端的信號肽。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，其中信號肽來源于hla-a和/或cd8α。

69、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞為造血細胞。

70、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的造血細胞為造血干細胞或造血祖細胞。

71、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞為免疫效應(yīng)細胞。

72、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的免疫效應(yīng)細胞可以選自t細胞、b細胞、nk細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、由誘導(dǎo)性多能干細胞(ipsc)分化而成的免疫效應(yīng)細胞或它們的任何組合。

73、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的免疫效應(yīng)細胞為t細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的t細胞可以選自cd4+/cd8+t細胞、cd4+/cd8-t細胞、cd4-/cd8+t細胞、cd4-/cd8-t細胞、cd4+輔助t細胞(例如th1和th2細胞)、cd8+t細胞(例如，細胞毒性t細胞)、腫瘤浸潤細胞、記憶t細胞、幼稚t細胞、γδ-t細胞、αβ-t細胞、nkt細胞、dnt細胞(雙陰性t細胞)。

74、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的t細胞可以選自cd4+/cd8-t細胞、cd4-/cd8+t細胞、cd4+/cd8+t細胞、cd4-/cd8-t細胞或它們的任何組合。

75、根據(jù)本公開的第六方面，本發(fā)明提供一種基因編輯系統(tǒng)，所述基因編輯系統(tǒng)包含本公開第三方面所述的grna或第四方面所述的試劑。

76、本發(fā)明的基因編輯系統(tǒng)選自crispr/cas系統(tǒng)。crispr/cas系統(tǒng)包括i型、ii型、iii型、iv型、v型或vi型的crispr/cas系統(tǒng)。其中cas蛋白包括例如cas1、cas2、cas3、cas4、csn2、cas7、cas8、cas9、cas10、cas11、cas12、cas12a(cpf1)、cas13或cas14蛋白。在一些實施方案中，本發(fā)明使用的crispr/cas系統(tǒng)屬于ii型系統(tǒng)的crispr/cas9系統(tǒng)。crispr/cas9系統(tǒng)用于基因編輯中，其中靶向序列與目標基因的dna序列特異性結(jié)合，引導(dǎo)cas9核酸酶切割dna雙鏈，并激活非同源末端連接，達到基因修飾的目的。

77、根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)記載，靶向cd7的car-t細胞存在一定程度的自相殘殺情況，t細胞的自相殘殺限制了car-t細胞的生存能力，導(dǎo)致其在患者體內(nèi)的存續(xù)時間有限。為了解決這一問題，本發(fā)明使用crispr/cas9基因編輯技術(shù)使car-t細胞上的cd7抗原表達降低。本發(fā)明提供的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)使用的試劑包含靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna或用于表達所述grna的表達載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供的crispr/cas9系統(tǒng)使用的試劑包含靶向細胞內(nèi)源性cd7基因的grna或用于表達所述grna的表達載體，以及cas9蛋白或其功能性變體、或表達所述cas9蛋白或其功能性變體的表達載體。

78、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的grna包括crrna和tracrrna，其中crrna由間隔序列和附加序列組成。本發(fā)明提供的grna包含的附加序列和tracrrna序列是本領(lǐng)域所熟知的，例如wo2017093969a中記載的序列。例如，crrna的附加序列為：guuuuagag?cuaugcu，tracrrna序列為：agcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuu。

79、crispr/cas系統(tǒng)涉及的pam序列包括ngg、nag、ngn、nngrrt、nnnrrt、nnagaaw、nggng、nnnngatt、nnnnacac、nnnnryac、ngan、ngng，ngag、ttn、tttn或ngcg，其中n是任意核酸堿基，r是嘌呤，y是嘧啶。在一些實施方案中，本發(fā)明所使用的crispr/cas9系統(tǒng)涉及的pam序列如表1中所示。

80、本發(fā)明提供的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)搭配適合的grna具有較好的細胞內(nèi)源性cd7基因敲除效率，能使靶向cd7的car-t細胞的自殺率降至最低程度，同時不影響car-t細胞的擴增，維持其在患者體內(nèi)的存續(xù)時間以及殺傷能力。

81、根據(jù)本公開的第七方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明第五方面公開的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑和/或載體。

82、賦形劑和/或載體通常也稱為輔料。藥學上可接受的載體是指藥劑學可接受的載體(carrier)，與基因工程中用于插入核酸的載體(vector)通常并不是同一物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識到，藥學上可接受的賦形劑和/或載體在所采用的劑量和濃度下對接受者無毒或基本上無毒，在藥理學和/或生理學上和本發(fā)明的活性成分相容，例如不影響其存活力或功效。在一些實施方案中，藥物組合物可含有用于改善、維持或保留例如組合物的ph、滲透性、粘度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、釋放速率、吸收或滲透的物質(zhì)?？梢曨A(yù)期的施用途徑、遞送方式和所需的劑量來確定最佳的藥物組合物。藥學上可接受的賦形劑和/或載體的示例描述于remington和gennaro，remington’s?pharmaceuticalsciences(第18版，1990)中。藥學上可接受的賦形劑和/或載體是指任何賦形劑、填充劑、鹽、穩(wěn)定劑、增溶劑、油脂、脂質(zhì)、含脂質(zhì)的囊泡、微球體、脂質(zhì)體封裝、吸附劑、抗氧化劑、溶劑、共溶劑、緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、潤濕劑、乳化劑、包覆劑、等滲劑、吸收延遲劑、張力調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、防腐劑和/或佐劑。在一些實施方案中，本發(fā)明可以使用的賦形劑和/或載體包括但不限于：水、鹽溶液、緩沖液、葡萄糖、甘油、乙醇、多元醇中的一種或多種。

83、本發(fā)明的藥物組合物可以以例如無菌制劑的形式提供。無菌制劑的形式例如等滲水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液等。藥物組合物的溶劑或介質(zhì)可以是水、乙醇或多元醇中的一種或幾種。本發(fā)明可以通過例如無菌過濾膜過濾的方式使藥物組合物無菌。在組合物凍干時，可在凍干、復(fù)溶、稀釋之前或之后使用此方法進行滅菌。用于腸胃外施用的組合物可以凍干形式或在溶液中儲存?？梢酝ㄟ^例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。本發(fā)明的藥物組合物可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他形式提供，例如可以作為緩釋或控釋組合物提供。用于制備緩釋或控釋藥物的技術(shù)(如脂質(zhì)體載劑、生物易蝕微粒、多孔珠?；蚍e存注射)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如注射用組合物的延長吸收可通過在組合物中包含延緩吸收的輔料如單硬脂酸或明膠來實現(xiàn)。藥物組合物可以以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、粘性組合物、固體、晶體或以凍干粉末的形式儲存于無菌小瓶中。所述藥物組合物可儲存成即用形式或在施用前復(fù)溶經(jīng)處理使用的形式。本發(fā)明的藥物組合物的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。

84、本發(fā)明的藥物組合物可以以任何方便的方式使用，包括通過噴霧、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本發(fā)明的藥物組合物可通過例如經(jīng)口、經(jīng)鼻、通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(腦實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈或病灶內(nèi)途徑注射，還可以通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或通過植入裝置進行施用。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物通過胃腸外完成施用。胃腸外遞送方法包括局部、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、子宮內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或鼻內(nèi)施用。

85、施用包含本發(fā)明的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞的藥物組合物的治療有效量將取決于例如治療程度和目標。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，用于治療的合適的劑量水平將部分取決于所遞送的分子、適應(yīng)癥、施用途徑和患者情況(體重、體表或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康狀況)。在一些實施方案中，臨床醫(yī)生可調(diào)整劑量并改變施用途徑來獲得最佳的治療效果。

86、給藥頻率將取決于本發(fā)明的藥物組合物的藥物動力學參數(shù)。臨床醫(yī)生通常施用藥物組合物直到達到實現(xiàn)所需效果的劑量。因此，藥物組合物可作為單劑量施用，或隨時間以兩次或多劑量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通過植入裝置或?qū)Ч芤赃B續(xù)輸液的方式施用。

87、根據(jù)本公開的第八方面，本發(fā)明提供一種如本公開第五方面所述的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或如本公開第七方面所述的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途。

88、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述疾病或病癥包括與cd7表達相關(guān)的疾病或病癥。

89、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述疾病或病癥包括與cd7表達相關(guān)的癌癥或腫瘤。

90、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述與cd7表達相關(guān)的疾病或病癥包括淋巴瘤或白血病。

91、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述疾病或病癥包括t細胞淋巴瘤、t細胞白血病、b細胞白血病或nk細胞淋巴瘤。

92、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述疾病或病癥包括t細胞非霍奇金淋巴瘤。

93、在一些實施方案中，本發(fā)明提供的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述疾病或病癥包括t淋巴母細胞淋巴瘤(t-lbl)、外周t細胞淋巴瘤(ptcl)、急性t淋巴細胞白血病(t-all)、t淋巴母細胞白血病、急性髓系白血病(aml)或慢性淋巴細胞白血病(cll)。

94、本發(fā)明的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞可以與其他藥物組合使用。在組合用藥時，所述細胞和其他藥物可以同時施用或在不同時間施用，例如在短期內(nèi)先后施用。細胞和試劑可以混合或以單獨的包裝或劑型存在。組合用藥可以在相同的治療過程中施用，例如在用抗cd7免疫療法治療受試者的過程中，可以同時或順序地(例如，在用抗cd7免疫療法治療之前、期間或之后)向受試者施用有效量的本發(fā)明的細胞。

95、本發(fā)明所應(yīng)用的crispr/cas系統(tǒng)中，grna的設(shè)計需要考慮很多因素，例如長度、堿基組成、靶基因的結(jié)合位置、與非靶標位點的結(jié)合率、是否包含snp、二級結(jié)構(gòu)等等。目前已經(jīng)可以通過各種在線工具來設(shè)計grna。然而，由于cas蛋白可以切割任何鄰近pam位點的靶序列，針對特定的靶基因而言，在線工具設(shè)計的大量grna的編輯效率都不盡相同，甚至差異很大。因此，篩選特異性高的grna對于crispr/cas系統(tǒng)編輯效率的提高至關(guān)重要。本發(fā)明的grna經(jīng)過大量篩選并經(jīng)過細胞內(nèi)源性基因敲除率的驗證，具備較好的基因編輯效率，經(jīng)基因修飾后的細胞與野生型細胞(內(nèi)源性cd7基因未經(jīng)基因修飾而正常表達cd7抗原的對照細胞)相比，cd7抗原的表達顯著降低，甚至不表達。因此，施用本發(fā)明的修飾的細胞或包含所述細胞的藥物組合物，能夠改善治療中存在的脫靶風險。

96、本發(fā)明公開的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含這些細胞的藥物組合物，可以施用于患有腫瘤細胞上表達cd7抗原的惡性腫瘤疾病的患者。這些患者是靶向cd7抗原的免疫療法的合適的受試者，但由于免疫療法存在不利的脫靶風險，導(dǎo)致服藥的風險大于獲益，使得患者無法正常用藥。本發(fā)明的基因修飾方法能夠使相關(guān)施用細胞上的cd7抗原表達降低，因此，施用本發(fā)明的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞或包含這些細胞的藥物組合物，能夠改善免疫療法的脫靶風險，因為靶向cd7的免疫治療藥物無法有效的靶向本發(fā)明的細胞。

97、在向受試者施用靶向cd7的細胞療法如car-t細胞療法時，由于car-t細胞表面表達靶向cd7的car，同時一部分car-t細胞表面還表達cd7抗原，因此導(dǎo)致car-t細胞之間的“自相殘殺”會影響該療法的有效性，故可能存在這種風險：在實現(xiàn)期望的臨床結(jié)果(如患者體內(nèi)表達cd7的惡性細胞被消除)之前，大部分或所有car-t效應(yīng)細胞均已因“自相殘殺”被消除。而施用本發(fā)明的內(nèi)源性cd7基因修飾的細胞，例如cd7抗原表達被降低的car-t細胞作為細胞療法中的免疫效應(yīng)細胞，能夠消弭這種“自相殘殺”現(xiàn)象及其對治療效果帶來的負面影響。

98、crispr/cas系統(tǒng)可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法遞送進入細胞，例如，通過用編碼cas蛋白和grna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將所述系統(tǒng)直接應(yīng)用于人細胞、使用病毒載體遞送或物理方式遞送。在體細胞基因治療中通常選擇腺病毒載體(aav)用于體內(nèi)基因遞送。crispr/cas系統(tǒng)遞送的病毒載體可以選自腺病毒、慢病毒和噬菌體；非病毒載體可以選自脂質(zhì)體如lipofectaminetm、聚合物和金納米顆粒。crispr/cas基因編輯系統(tǒng)遞送的物理方法可以選自電穿孔法、顯微注射法等。電穿孔技術(shù)能夠通過將電場施加到細胞上以增加細胞膜的滲透性，從而允許將化學物質(zhì)、藥物、dna、rna或蛋白質(zhì)引入細胞。并且由于病毒(包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)轉(zhuǎn)導(dǎo)t細胞的效率較低，且其存在與crispr/cas的延長表達相關(guān)的毒性，因此，電穿孔法已作為一種高效率、低毒性的遞送方法應(yīng)用于crispr/cas系統(tǒng)的遞送中。

99、grna可通過化學合成和/或通過酶促合成。例如，grna可使用基于亞磷酰胺的標準固相合成方法合成?；蛘?，通過將編碼grna的dna可操作地連接至被噬菌體、rna聚合酶識別的啟動子控制序列，可在體外合成grna。合適的噬菌體啟動子序列的示例包括t7、t3、sp6啟動子序列或其變體。

100、grna可以通過pcr擴增或構(gòu)建質(zhì)粒表達。使用質(zhì)粒表達可以將編碼grna的核酸對退火并連接到質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞。例如，將grna克隆到質(zhì)粒例如pspcas9(bb)中，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株。

101、grna可以作為rna分子被引入細胞內(nèi)。例如，rna分子可以是體外轉(zhuǎn)錄的和/或可以是化學合成的；rna可以從合成的dna分子(例如，基因片段)轉(zhuǎn)錄而來，然后，grna可以作為rna分子被引入細胞內(nèi)。grna也可以以非rna核酸分子(例如，dna分子)的形式被引入細胞內(nèi)。例如，可以將編碼grna的dna可操作地鏈接至啟動子控制序列，以在目標細胞內(nèi)進行g(shù)rna的表達?？梢詫na編碼序列可操作地連接至被rna聚合酶iii(pol?iii)識別的啟動子序列?？捎糜诒磉_grna的質(zhì)粒載體包括但不限于px330載體和px333載體。在一些實施方案中，質(zhì)粒載體(例如，px333載體)可包含至少兩個編碼grna的dna序列。

102、本發(fā)明的grna可以以本領(lǐng)域中任何合適的方式遞送到細胞。包括用于遞送crispr/cas系統(tǒng)的方法，例如，通過電穿孔的方式將grna復(fù)合物導(dǎo)入細胞中、將編碼cas核酸酶和grna的mrna電穿孔遞送到細胞中、或者通過病毒載體遞送編碼rna或dna，例如通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送。在一些實施方案中，將靶細胞分別與cas核酸酶和grna接觸，并在細胞內(nèi)形成grna復(fù)合物。在一些實施方案中，使靶細胞與編碼cas核酸酶和/或grna的核酸接觸，例如dna或rna。在一些實施方案中，將靶細胞與grna復(fù)合物接觸。

103、cas9核酸酶識別crispr重復(fù)序列中的短基序或前間區(qū)序列鄰近基序(pam)以幫助區(qū)分自我與非自我。cas9核酸酶序列和結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。cas9的直系同源物已經(jīng)在多種物種中描述，例如包括釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌。基于本公開，其他合適的cas9核酸酶和序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。

104、在嵌合抗原受體(car)的構(gòu)建中，可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備本發(fā)明使用到的單鏈抗體、單域抗體、重鏈抗體或納米抗體，例如本領(lǐng)域熟知的噬菌體展示技術(shù)。或者，本發(fā)明的各種抗體可在其他細胞系中表達。可用編碼本發(fā)明各抗體的序列轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細胞。轉(zhuǎn)化可采用任何已知的方法進行，例如包括將多核苷酸包裝在病毒(或病毒載體中)并用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細胞。所用的轉(zhuǎn)化程序取決于將轉(zhuǎn)化的宿主。用于將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包封在脂質(zhì)體中和將dna直接微注射至核中等?？捎糜诒磉_的宿主哺乳動物細胞系為本領(lǐng)域所熟知，例如可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)獲得的多種永生化細胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(cho)細胞、hela細胞、幼倉鼠腎(bhk)細胞、猴腎細胞(cos)、人肝細胞癌(hepg2)細胞等。

105、可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備本發(fā)明使用到的嵌合抗原受體，可參見例如parket?al,trends?bio?technol.,29:550-557,2011；grupp?et?al,n?engl?j?med.,368:1509-1518,2013；han?et?al,j.hematol.oncol.,6:47,2013。

106、在嵌合抗原受體(car)的構(gòu)建中，本發(fā)明使用到的單鏈抗體、單域抗體、重鏈抗體、納米抗體或嵌合抗原受體的核酸全長序列或其片段可以用常規(guī)技術(shù)獲得，例如通常可以用pcr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。用人工合成的方法來合成有關(guān)序列是一種可行的方法，尤其是對于片段長度較短的序列。通常，可以通過先合成多個小片段，然后再進行連接以獲得序列較長的片段。此外，還可將重鏈的編碼序列和表達標簽(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。

107、一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。本發(fā)明所涉及的生物分子(核酸、多肽等)包括以分離的形式存在的生物分子。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或載體)和細胞中。此外，還可以通過化學合成方法將突變引入本發(fā)明的多肽序列中。

108、病毒載體技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且在sambrook等人的molecular?cloning:alaboratory?manual.cold?spring?harbor?laboratory?press,cold?spring?harbor.(2001)([分子克?。簩嶒炇沂謨註，紐約冷泉港的冷泉港實驗室，2001年)以及其他病毒學和分子生物學手冊中有記載。

109、現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)開發(fā)了許多基于病毒的系統(tǒng)用于將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)將異源核酸插入載體并包裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后可以在體外或離體分離重組病毒并將其遞送至工程化哺乳動物細胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。在一些實施方案中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領(lǐng)域已知的。在一些實施方案中，使用慢病毒載體。使用本領(lǐng)域已知的方法，所得慢病毒載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞(例如原代人t細胞)。在一些實施方案中，使用自滅活慢病毒載體。在一些實施方案中，攜帶免疫調(diào)節(jié)劑(例如免疫檢查點抑制劑)編碼序列的自滅活慢病毒載體和/或攜帶嵌合抗原受體的自滅活慢病毒載體可以用本領(lǐng)域已知的方案包裝。

110、用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟為本領(lǐng)域所熟知。另一種方法是使用mgcl2。此外，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法、常規(guī)機械方法如顯微注射法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。

111、獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達本發(fā)明的核酸分子所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。

112、在上述方法中的多肽或蛋白可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的多肽或蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)以及這些方法的結(jié)合。

113、采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法(如通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等)可以將編碼嵌合抗原受體的核酸序列引入免疫效應(yīng)細胞中。

114、將載體或分離的核酸引入免疫效應(yīng)細胞的方法是本領(lǐng)域已知的。所描述的載體可以通過物理、化學或生物學方法轉(zhuǎn)移到免疫效應(yīng)細胞中。

115、將載體引入免疫效應(yīng)細胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。用于制備包含載體和/或外源核酸的細胞的方法是本領(lǐng)域眾所公知的，并且在例如sambrook,j.,fritsch,e.f.and?maniatis,t.(2001)molecular?cloning:alaboratory?manual.cold?spring?harbor?laboratory?press,cold?spring?harbor.以及其他病毒學和分子生物學手冊中有記載。在一些實施方案中，通過電穿孔方法將載體引入免疫效應(yīng)細胞中。

116、將載體引入免疫效應(yīng)細胞的生物學方法包括使用dna和rna載體。病毒載體已成為將基因插入哺乳動物細胞(例如人類細胞)中最廣泛使用的方法。

117、將載體引入免疫效應(yīng)細胞的化學方法包括膠體分散系統(tǒng)，例如包括大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠粒和基于脂質(zhì)的體系，例如包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外遞送載體的示例性膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體。

118、在一些實施方案中，編碼本文所述的任何嵌合抗原受體的核酸分子可以通過常規(guī)方法(例如體外轉(zhuǎn)錄)制備，然后通過已知方法例如mrna電穿孔引入免疫效應(yīng)細胞(參見peter?mrabinovich.human?gene?therapy,17:1027-1035(2006))。

119、在一些實施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的免疫效應(yīng)細胞在引入載體或分離的核酸后進行離體培養(yǎng)增殖。在一些實施方案中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的免疫效應(yīng)細胞以增殖至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天。

120、術(shù)語解釋

121、除非另有說明，否則本文中所使用的所有術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解的相同。

122、本發(fā)明所用術(shù)語“基因編輯”(gene?editing)是指在活體基因中，使用基因編輯系統(tǒng)作為工具，對基因進行定點修飾，從而實現(xiàn)對特定的基因序列的剪切刪除、插入或單個堿基的突變等。基因編輯系統(tǒng)是指至少包含核酸酶(或核酸酶結(jié)構(gòu)域)和可編碼核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個或多個分子的系統(tǒng)，所述核酸酶和所述可編碼核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是必需的，并且足以通過核酸酶(或者核酸酶結(jié)構(gòu)域)在靶向序列上引導(dǎo)并實現(xiàn)對核酸的修飾(例如，靶向序列上單鏈或雙鏈斷裂)。傳統(tǒng)的基因編輯可以總結(jié)為3個步驟：基因編輯工具的定位、通過核酸酶介導(dǎo)的dna損傷(一般會產(chǎn)生dna雙鏈斷裂)以及通過細胞內(nèi)dna損傷修復(fù)機制例如同源定向修復(fù)(hdr)或非同源末端連接(nhej)介導(dǎo)的dna修復(fù)，達到基因組刪除、插入、基因點突變的目的?；蚓庉嬒到y(tǒng)包括：例如鋅指核酸酶(zinc?finger?nucleases，zfns)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription?activator?like?effector?nucleases，talens)、規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇(clustered?regularly?interspaced?short?palindromicrepeats/crispr-associated?protein)，這些系統(tǒng)可以對基因組進行高效靶向修飾，通過在基因組的特定位置添加、去除或改變遺傳物質(zhì)來進行修飾。基因編輯是修飾基因組的核苷酸序列的過程，在一些實施方案中，本發(fā)明的基因編輯方法，通過使用crispr/cas系統(tǒng)修飾細胞的內(nèi)源性基因，實現(xiàn)降低或消除細胞上一種或多種抗原的表達。使用crispr/cas9系統(tǒng)進行基因編輯是本領(lǐng)域公知的，例如ran,f.,hsu,p.,wright,j.et?al.genomeengineering?using?the?crispr-cas9?system.nat?protoc?8,2281–2308(2013).

123、本發(fā)明所用術(shù)語“crispr系統(tǒng)”、“cas系統(tǒng)”或“crispr/cas系統(tǒng)”，包括向?qū)na分子(grna)和grna引導(dǎo)的核酸酶或其他效應(yīng)分子。crispr/cas系統(tǒng)可以包括grna和cas蛋白，例如cas9蛋白。grna和cas蛋白可以形成核糖核酸蛋白(rnp)復(fù)合物。其中cas蛋白具有切割dna雙鏈的功能，grna發(fā)揮引導(dǎo)作用，在原間隔序列相鄰基序(pam)存在的情況下，cas9蛋白可以在grna的引導(dǎo)作用下到達不同的靶部位，切割靶基因，實現(xiàn)dna雙鏈斷裂，并激活非同源末端連接(nhej)或通過同源定向修復(fù)(hdr)機制創(chuàng)建外源供體dna可能插入的位點。nhej修復(fù)途徑是活性最高的修復(fù)途徑，能夠頻繁地在雙鏈斷裂(dsb)位點處造成小核苷酸插入或缺失(插入缺失)。nhej介導(dǎo)的dsb修復(fù)的隨機性具有重要的實踐意義，在大多數(shù)情形中，nhej在靶向dna中產(chǎn)生小的插入缺失，進而導(dǎo)致氨基酸缺失、插入或框移突變。理想的效果是靶向基因的功能喪失或突變。

124、crispr-cas系統(tǒng)包括兩類，第1類可以使用多個cas蛋白形成的復(fù)合物切割外源核酸的效應(yīng)因子，第2類可以使用單一的大cas蛋白用于切割外源核酸的效應(yīng)因子。1類可分為i型、iii型和iv型，2類可分為ii型、v型和vi型。這6種系統(tǒng)類型可進一步劃分為19個亞型。

125、cas蛋白的非限制性示例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas5d、cas5t、cas5h、cas5a、cas6、cas7、cas8、cas9(也稱為csn1或csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、csy4、cse1、cse2、cse3、cse4、cse5e、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm1、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、csd1、csd2、cst1、cst2、csh1、csh2、csa1、csa2、csa3、csa4、csa5、cas12a/cpf1、cas12b/c2c1、cas12c/c2c3、cas12d/casy、cas12e/casx、cas12g、cas12h、cas12i、和cas12j/casφ、carf、ding、其同源物、或其經(jīng)修飾的版本。未修飾的cas蛋白可具有dna切割活性。cas蛋白可引導(dǎo)靶向序列的一條或兩條鏈的切割，諸如在靶向序列內(nèi)和/或在靶向序列的互補序列內(nèi)。例如，cas蛋白可引導(dǎo)從靶向序列的第一個或最后一個核苷酸起約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多個堿基對內(nèi)的一條或兩條鏈的切割。在一些實施方案中，cas9蛋白是經(jīng)修飾的cas9蛋白。cas9蛋白通過兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域ruvc和hnh的組合活性產(chǎn)生dsb。

126、cas9蛋白可以是從化膿性鏈球菌(streptococcus?pyogenes?cas9,spcas9)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus?cas9,sacas9)、嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophilus?cas9,stcas9)、腦膜炎奈瑟球菌(neisseria?meningitidis?cas9,nmcas9)、新弗朗西斯菌(francisella?novicida?cas9,fncas9)或空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni?cas9,cjcas9)中分離得到的相應(yīng)cas9蛋白。在一些實施方案中，cas蛋白是來源于野生型cas蛋白的cas變體。示例性的cas9變體可以是高保真度的cas9蛋白。在一些實施方案中，cas9是變體cas9蛋白。變體cas9蛋白的氨基酸序列相比野生型cas9蛋白的氨基酸序列有至少一個氨基酸不同(例如，具有缺失、插入、置換、融合)。在一些實施方案中，變體cas9蛋白相比野生型cas9蛋白的氨基酸序列有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個氨基酸不同。在一些實例中，變體cas9蛋白具有氨基酸變化(例如，缺失、插入或置換)，該變化降低了cas9蛋白的核酸酶活性。例如，在一些實例中，變體cas9蛋白具有低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、或低于1％的對應(yīng)野生型cas9蛋白的核酸酶活性。在一些實施方案中，變體cas9蛋白基本上沒有核酸酶活性。當cas9蛋白是基本上沒有核酸酶活性的變體cas9蛋白時，它可以被稱為“dcas9”。在一些實施方案中，cas變體可以與另一種酶融合，例如活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(aid)。在自然界，dna結(jié)合和切割通常需要蛋白質(zhì)和兩種rna。但是，單向?qū)na可以經(jīng)工程改造以將多種crrna和tracrrna并入單一rna物質(zhì)中。參見，例如，jinek?m.等人,science?337:816-821(2012)。在一些實施方案中，cas蛋白或grna復(fù)合物可以與用于同源定向修復(fù)(hdr)的模板一起施用。在一些實施方案中，cas蛋白或grna復(fù)合物在沒有hdr模板的情況下施用。

127、“grna”或“向?qū)na”是指一種合成或重組的多核苷酸，其對于目標結(jié)構(gòu)域的序列具有特異性。grna可以靶向結(jié)構(gòu)域的任何外顯子或內(nèi)含子。在一些實施方案中，grna可包含修飾。修飾可以在grna的任何位置?？梢詫我坏膅rna進行多于一個的修飾。grna的修飾可以是置換、插入、缺失、化學修飾、物理修飾、穩(wěn)定化、純化或其任意組合。grna可在修飾后進行質(zhì)量控制。在一些實施方案中，質(zhì)量控制可包括page、hplc、ms或其任意組合。

128、本發(fā)明所用術(shù)語“前間區(qū)序列鄰近基序(pam)”或“pam樣基序”是指緊隨在由crispr系統(tǒng)中cas蛋白靶向的靶向序列下游的2至6個堿基對。pam序列可以位于切割位點下游3-4個核酸處。pam序列對于靶標結(jié)合至關(guān)重要，cas蛋白需要pam序列來識別靶向序列。在grna與靶向序列配對后，cas蛋白介導(dǎo)pam上游約3nt的雙鏈斷裂。pam序列可以是本領(lǐng)域中已知的任何pam序列。合適的pam序列包括但不限于，ngg、nga、ngc、nag、ngn、ngt、ngtt、ngcg、ngag、ngan、ngng、ngcn、ngtn、nngrrt、nnnrrt、nggng、nngrr(n)、tttv、tycv、tatv、nnnngatt、nnagaaw或naaaa，其中n是任意核酸堿基，r是嘌呤，y是嘧啶，w是a或t。例如，cas9的pam序列可以是ngg，例如，來自釀膿鏈球菌的cas9蛋白(spcas9)，其需要標準的ngg序列作為pam序列以結(jié)合特定的核酸區(qū)域，“ngg”中的“n”可以是腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、鳥嘌呤(g)或胞嘧啶(c)，并且g是鳥嘌呤。在一些實施方案中，cas蛋白被工程化/修飾以識別一種或多種pam序列。在一些實施方案中，cas蛋白被工程化/修飾，以識別與cas蛋白未經(jīng)工程化/修飾時識別的pam序列不同的一個或多個pam序列，例如，cas變體可以識別修改后的pam序列，如ngg、ngan、ngng、ngag、ngcg、nng、tttn、ytn或yg。

129、“免疫效應(yīng)細胞”是指可以執(zhí)行免疫效應(yīng)功能(例如細胞毒性細胞殺傷活性、分泌細胞因子、誘導(dǎo)adcc和/或cdc)的免疫細胞。例如，免疫效應(yīng)細胞可以是t細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞、nk細胞和/或nkt細胞，或者是衍生自干細胞，例如成體干細胞、胚胎干細胞、臍帶血干細胞、祖細胞、骨髓干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞、全能干細胞或造血干細胞等的免疫細胞。當免疫效應(yīng)細胞是t細胞時，t細胞可以是任何t細胞，如體外培養(yǎng)的t細胞，例如原代t細胞，或者來自體外培養(yǎng)的t細胞系例如jurkat、supt1等的t細胞，或獲得自受試者的t細胞。受試者的實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉(zhuǎn)基因物種。t細胞可以從多種來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾組織及腫瘤。t細胞也可以被濃縮或純化。t細胞可以處于任何發(fā)育階段，包括但不限于，cd4+/cd8+t細胞、cd4+輔助t細胞(例如th1和th2細胞)、cd8+t細胞(例如細胞毒性t細胞)、cd4-/cd8-t細胞、腫瘤浸潤細胞、記憶t細胞、幼稚t細胞、γδ-t細胞、αβ-t細胞等。

130、本發(fā)明所用術(shù)語“來源于”表示兩者之間的關(guān)系，通常是指兩者之間的結(jié)構(gòu)相似性。例如，在來源于cd3ζ的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的情況下，細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域保留足夠的cd3ζ結(jié)構(gòu)，使得其具有所需的功能，即在適當條件下產(chǎn)生信號的能力。它沒有暗示或包括對產(chǎn)生細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特定過程的限制，例如，它并不意指為了提供細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，必須從cd3ζ序列開始并刪除不需要的序列，或強加突變，以到達細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

131、本發(fā)明所用術(shù)語“抗體”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白質(zhì)或多肽序列，所述蛋白質(zhì)或多肽序列與抗原(如靶抗原)特異性結(jié)合?？贵w可以是來源于天然來源或重組來源的完整免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?？贵w的非限制性實例包括單克隆抗體(包括完整抗體)、單域抗體(sdab)、單鏈抗體(scfv)、重鏈抗體(hcab)、納米抗體(也稱重鏈單域抗體，vhh)、輕鏈抗體(lcab)、單價抗體，“抗體”還包括能夠表現(xiàn)期望的生物活性的攜帶一個或多個cdr序列的抗體片段或合成多肽，尤其是抗原結(jié)合片段，例如fab，f(ab’)2和fv。在本發(fā)明一些實施例中，術(shù)語“免疫球蛋白(ig)”和“抗體”可互換地使用?？贵w的“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指抗體的重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域可分別稱為“vh”和“vl”。這些結(jié)構(gòu)域通常是抗體的最可變的部分(相對于相同類型的其它抗體)并含有抗原結(jié)合位點。

132、本發(fā)明所用術(shù)語“抗原”或“ag”是指引起免疫應(yīng)答的分子。免疫應(yīng)答可以涉及抗體的產(chǎn)生或特定免疫活性細胞的活化，或兩者皆有。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解實際上包括所有蛋白質(zhì)或肽的任何大分子都可以作為抗原。此外，抗原可以源自重組或基因組dna。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解包含編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna都因此編碼“抗原”?？乖梢酝ㄟ^合成產(chǎn)生，或可以源自生物樣品，或者可以是除多肽外的大分子。這樣的生物樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細胞或具有其他生物組分的細胞或液體。

133、本發(fā)明所用術(shù)語“抗原結(jié)合片段”或“抗體片段”，是指包含完整抗體或其重組變體的至少一部分，一般包含完整抗體的抗原結(jié)合位點并因此保留結(jié)合抗原的能力?？贵w片段的實例包括但不限于：fab、單鏈抗體(scfv)、單域抗體(sdab)、抗體的重鏈可變區(qū)(vh)、重鏈抗體(hcab)、納米抗體(也稱重鏈單域抗體，vhh)、輕鏈抗體(lcab)、線性抗體、抗原的天然配體或其功能性片段等。

134、本發(fā)明所用術(shù)語“功能性片段”或“功能性變體”是指基本上包含親本的氨基酸序列但與該親本氨基酸序列相比含有至少一個氨基酸修飾(例如取代、缺失或插入)的變體，條件是所述變體保留親本氨基酸序列的生物活性。在一些實施方案中，所述氨基酸修飾是保守型修飾。

135、本發(fā)明所用術(shù)語“重鏈抗體”是源自駱駝科生物或軟骨魚科生物的抗體。相比4鏈抗體，重鏈抗體缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(ch1)，僅包含2條由可變區(qū)(vhh)和其他恒定區(qū)組成重鏈，可變區(qū)通過類似鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)與恒定區(qū)相連。駱駝科重鏈抗體的每條重鏈包含1個可變區(qū)(vhh)和2個恒定區(qū)(ch2和ch3)，軟骨魚科重鏈抗體的每條重鏈含有1個可變區(qū)和5個恒定區(qū)(ch1-ch5)。重鏈抗體的抗原結(jié)合片段包括vhh和單鏈重鏈抗體。通過與人igg?fc的恒定區(qū)融合，重鏈抗體可以具有人igg?fc的ch2和ch3。

136、單域抗體(sdab)可以具有相同或不同的來源，并且具有相同或不同的大小。示例性的sdab包括但不限于來自僅重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如vhh)、天然沒有輕鏈的結(jié)合分子、單結(jié)構(gòu)域(例如vh或vl)衍生自常規(guī)4鏈抗體、由表達人類重鏈片段的轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠產(chǎn)生的人類單域抗體，以及非衍生自抗體的工程域和單域支架。本領(lǐng)域已知的或由本發(fā)明公開的任何sdab，包括本發(fā)明公開的單域抗體，可用作本發(fā)明所述的嵌合抗原受體中的細胞抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。sdab可以來源于任何物種，包括但不限于小鼠、大鼠、人、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、鯊魚、山羊、兔和牛。本發(fā)明的單域抗體還包括來自駱駝科和鯊魚以外的物種的天然存在的單域抗體分子。

137、“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指嵌合抗原受體的與靶抗原特異性結(jié)合的部分，嵌合抗原受體可以利用其抗原結(jié)合特性將t細胞和/或其他免疫細胞定向至所選擇的靶標。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以典型地包含抗體輕鏈可變區(qū)(vl)和抗體重鏈可變區(qū)(vh)，但是其不必同時包含這兩個可變區(qū)。例如，可包括具有抗原結(jié)合活性的fab片段，fab’片段、單一fv片段例如scfv、單域抗體等。

138、“跨膜結(jié)構(gòu)域”是用于連接嵌合抗原受體的細胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?？缒そY(jié)構(gòu)域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括，tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrζ、cd28、cd3ζ、cd3ε、cd3γ、cd3δ、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154、ox40、icos、lag-3、2b4、btla、ctla-4、pd-1。

139、“胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”是指蛋白質(zhì)的功能性部分，即足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的功能性部分。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負責在抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合抗原以后的細胞內(nèi)初級信號傳遞，從而導(dǎo)致免疫細胞和免疫反應(yīng)的活化。換言之，胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負責活化其中表達car的免疫細胞的正常的效應(yīng)子功能的至少一種。例如，t細胞的效應(yīng)子功能可以是細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因子的分泌。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合抗原受體包含的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是t細胞受體和共受體的細胞質(zhì)序列，其在抗原受體結(jié)合以后一同起作用以引發(fā)信號傳導(dǎo)，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含許多免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor?tyrosine-based?activation?motifs,itam)。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括但不限于fcrγ、fcrβ、tcrζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(icos)、fcεri、dap10、dap12或cd66d。

140、“鉸鏈區(qū)”是指用于連接跨膜結(jié)構(gòu)域和抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何寡肽或多肽。具體地，鉸鏈區(qū)用來為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供更大的靈活性和可及性。鉸鏈區(qū)可以包含最多達300個氨基酸，優(yōu)選10至100個氨基酸并且最優(yōu)選25至50個氨基酸。鉸鏈區(qū)可以全部或部分源自天然分子，例如全部或部分源自cd8或cd28的胞外區(qū)，或全部或部分源自抗體恒定區(qū)?；蛘撸q鏈區(qū)可以是對應(yīng)于天然存在的鉸鏈序列的合成序列，或可以是完全合成的鉸鏈序列。

141、car的不同結(jié)構(gòu)域也可以通過肽接頭相互融合。這取決于單域抗體和/或各種域的結(jié)構(gòu)和/或功能特征，car中的每個肽接頭可以具有相同或不同的長度和/或序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獨立地選擇和優(yōu)化每個肽接頭。

142、肽接頭可以具有任何合適的長度。在一些實施方案中，肽接頭的長度為約1個氨基酸至約10個氨基酸、約1個氨基酸至約20個氨基酸、約1個氨基酸至約30個氨基酸、約5個氨基酸至約15個氨基酸、約10個氨基酸至約25個氨基酸、約5個氨基酸至約30個氨基酸、約10個氨基酸至約30個氨基酸、約30個氨基酸至約50個氨基酸、約50個氨基酸至約100個氨基酸、或約1個氨基酸至約100個氨基酸。

143、肽接頭可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自僅重鏈抗體的鉸鏈區(qū)的序列可以用作接頭。參見，例如wo1996/34103。在一些實施方案中，肽接頭是柔性接頭。示例性柔性接頭包括但不限于甘氨酸聚合物(g)n，甘氨酸-絲氨酸聚合物(例如(gs)n、(gsg)n、(gggs)n和(ggggs)n，其中n是至少1的整數(shù))、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和本領(lǐng)域已知的其他柔性接頭。

144、“共刺激信號結(jié)構(gòu)域”可以是來自共刺激分子的細胞內(nèi)功能性信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其包含所述共刺激分子的整個細胞內(nèi)部分，或其功能片段?！肮泊碳し肿印笔侵冈趖細胞上與共刺激配體特異性結(jié)合，由此介導(dǎo)t細胞的共刺激反應(yīng)(例如增殖)的同源結(jié)合配偶體。共刺激結(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括但不限于以下蛋白質(zhì)的胞內(nèi)區(qū)：mhc?i類分子、tnf受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整聯(lián)蛋白、信號傳導(dǎo)淋巴細胞活化分子(slam蛋白)、激活性nk細胞受體、tlr1-10、card11、cd134(ox40)、cd2、cd3、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cds、icam、cd137(4-1bb)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)或它們的任何組合。

145、“信號肽”可以使得嵌合抗原受體在細胞(例如t細胞)中表達時，使新生蛋白質(zhì)被引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并隨后引導(dǎo)至細胞表面。通常，信號肽的核心可以含有長的疏水性氨基酸區(qū)段，其具有形成單個α-螺旋的傾向。信號肽指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)穿過膜的轉(zhuǎn)運和/或分泌。在信號肽的末端，通常有被信號肽酶識別和切割的氨基酸區(qū)段。信號肽酶可以在移位期間或完成后切割，以產(chǎn)生游離信號肽和成熟蛋白。然后，游離信號肽被特定蛋白酶消化。信號肽也可以被稱為靶向信號、轉(zhuǎn)運肽、定位信號或信號序列。例如，信號序列可以是共翻譯或翻譯后信號肽。

146、本發(fā)明所用術(shù)語“患者”、“受試者”、“個體”、“對象”在本文中可互換使用，包括任何生物體，優(yōu)選動物，更優(yōu)選哺乳動物(例如大鼠、小鼠、狗、貓、兔等)，且最優(yōu)選的是人。

147、“治療”指向受試者采用本發(fā)明所述治療方法以達到至少一種陽性治療效果(例如癌細胞數(shù)目減少、腫瘤體積減小、癌細胞浸潤至周邊器官的速率降低或腫瘤轉(zhuǎn)移或腫瘤生長的速率降低)。有效治療患者的治療方法可根據(jù)多種因素(例如患者的疾病狀態(tài)、年齡、體重以及療法激發(fā)受試者的抗癌反應(yīng)能力)調(diào)整。