本技術(shù)屬于基因工程，具體涉及atp合酶β亞基在糙皮側(cè)耳生長發(fā)育及顏色形成中的功能研究。

背景技術(shù)：

1、atp合酶是一種基于水溶性atp分子的高能磷酸鍵，是耦合可溶性體相生物能與跨膜電化學離子電位形成的膜生物能相結(jié)合的大分子機器。atp合酶由兩個結(jié)合的亞基組成：膜內(nèi)f0和親水性f1。需氧生物的能量需求主要通過atp合酶的作用來滿足。這些酶存在于線粒體內(nèi)膜、光合作用生物的葉綠體類囊體膜和細菌的質(zhì)膜中，利用電化學跨膜質(zhì)子梯度的能量催化adp和pi合成atp。f1有三個催化和三個非催化核苷酸結(jié)合位點。atp合酶的f1部分由α3、β3、γ、δ和ε五個亞基組成，其中β亞基是f1上的催化單位。

2、atp合酶功能的基本原理的建立主要是基于化學滲透假說和構(gòu)象變化機制。atp合酶在真菌生長發(fā)育中起到重要作用，催化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的合成，參與dna和rna的合成以及為跨膜主動運輸提供能量。f1是氧化磷酸化反應的直接參與者。而質(zhì)子會作為f1構(gòu)象變化的激活劑，通過f0轉(zhuǎn)移的質(zhì)子在酸化f0和堿化f1之間形成了一個ph梯度。它促進了亞基間的質(zhì)子定向轉(zhuǎn)移到f1，同時被用于atp合成反應。前人研究表明：葉綠體中atp合酶可對轉(zhuǎn)類囊體電勢進行動態(tài)調(diào)節(jié)，這表明atp合酶是形成跨膜質(zhì)子環(huán)的關(guān)鍵因素。線粒體中atp合成酶活性降低在代謝紊亂的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明f1f0-atp合酶β亞基參與疾病形成與發(fā)展，其可作為抗真菌藥靶。在線蟲的研究中，atp-f1β亞基可調(diào)節(jié)atp合酶的活性，這也為真菌中atp合酶的研究奠定了基礎(chǔ)。

3、我國是世界糙皮側(cè)耳栽培大國，也是日常餐桌上味美價廉的食用菌種類之一。糙皮側(cè)耳菌蓋顏色是消費者在選購時的一個重要參考標準。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)要解決的技術(shù)問題是：如何調(diào)控側(cè)耳的生長發(fā)育。具體的，本技術(shù)要解決的技術(shù)問題是：如何調(diào)控的側(cè)耳的子實體菌蓋顏色、側(cè)耳的原基形成。

2、為解決上述技術(shù)問題，本技術(shù)提供atp-f1β蛋白或調(diào)控所述atp-f1β蛋白編碼基因表達的物質(zhì)或調(diào)控所述atp-f1β蛋白含量的物質(zhì)在下述任一項中的應用，

3、a1)、在調(diào)控側(cè)耳菌蓋顏色中的應用；

4、a2)、在制備調(diào)控側(cè)耳菌蓋顏色的產(chǎn)品中的應用；

5、a3)、在調(diào)控側(cè)耳原基形成數(shù)量中的應用；

6、a4)、在制備調(diào)控側(cè)耳原基形成數(shù)量的產(chǎn)品中的應用；

7、a5)、在調(diào)控側(cè)耳atp含量和/或復合體v活性中的應用；

8、a6)、在制備調(diào)控側(cè)耳atp含量和/或復合體v活性的產(chǎn)品中的應用；

9、a7)、在側(cè)耳育種或側(cè)耳輔助育種中應用；

10、a8)、在制備側(cè)耳育種或側(cè)耳輔助育種的產(chǎn)品中應用；

11、所述atp-f1β蛋白可為下述任一種蛋白質(zhì)：

12、a1)、氨基酸序列含有seq?id?no.3所示的蛋白質(zhì)；

13、a2)、將a1)所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與a1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性，且與側(cè)耳菌蓋顏色相關(guān)的蛋白質(zhì)；

14、a3)、在a1)或a2)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)。

15、進一步地，a1)所述蛋白質(zhì)也可為氨基酸序列是seq?id?no.3的蛋白質(zhì)。

16、本技術(shù)中，所述側(cè)耳可為側(cè)耳科大型真菌。

17、進一步地，所述側(cè)耳科大型真菌可為側(cè)耳屬大型真菌。

18、進一步地，所述側(cè)耳屬大型真菌可為糙皮側(cè)耳(pleurotus?ostreatus)、佛羅里達側(cè)耳(pleurotus?florida?eger.)、白黃側(cè)耳(pleurotus?cornucopiae)、美味側(cè)耳(pleurotus?sapidus)和/或肺形側(cè)耳

19、(pleurotus?pulmonarius)。

20、本技術(shù)中，所述側(cè)耳育種的指標可包括側(cè)耳子實體的菌蓋顏色。

21、本技術(shù)中，所述側(cè)耳育種的目的可包括培育子實體菌蓋顏色改變的側(cè)耳。

22、本技術(shù)中，所述調(diào)控可為提高或促進或上調(diào)。

23、本技術(shù)中，所述調(diào)控也可為降低或抑制或下調(diào)。

24、本技術(shù)中，所述蛋白質(zhì)可來源于糙皮側(cè)耳(pleurotus?ostreatus)。

25、本技術(shù)中，seq?id?no.3由537個氨基酸殘基組成。

26、上述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

27、所述蛋白標簽(protein-tag)是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化。所述蛋白標簽可為flag蛋白標簽、his蛋白標簽、mbp蛋白標簽、ha蛋白標簽、myc蛋白標簽、gst蛋白標簽和/或sumo蛋白標簽等。

28、進一步地，a3)所述的連接可為所述標簽的n末端與a1)或a2)所述蛋白質(zhì)的c末端通過脫水縮合形成肽鍵連接?；?，a3)所述的連接可為所述標簽的c末端與a1)或a2)所述蛋白質(zhì)的n末端通過脫水縮合形成肽鍵連接。

29、進一步地，所述的應用中，所述調(diào)控atp-f1β蛋白編碼基因表達的物質(zhì)或調(diào)控所述atp-f1β蛋白含量的物質(zhì)為生物材料，所述生物材料可為下述任一種：

30、b1)、編碼所述atp-f1β蛋白的核酸分子；

31、b2)、含有b1)所述核酸分子的表達盒；

32、b3)、含有b1)所述核酸分子的重組載體或含有b2)所述表達盒的重組載體；

33、b4)、含有b1)所述核酸分子的重組微生物、含有b2)所述表達盒的重組微生物或含有b3)所述重組載體的重組微生物；

34、b5)、抑制或降低所述atp-f1β蛋白編碼基因表達的核酸分子；

35、b6)、含有b5)所述核酸分子的表達盒；

36、b7)、含有b5)所述核酸分子的重組載體或含有b6)所述表達盒的重組載體；

37、b8)、含有b5)所述核酸分子的重組微生物、含有b6)所述表達盒的重組微生物或含有b7)所述重組載體的重組微生物。

38、進一步地，所述的應用中，b1)所述核酸分子可為如下g1)-g3)任一項所述的dna分子：

39、g1)、編碼鏈的編碼序列是seq?id?no.2的dna分子；

40、g2)、編碼鏈的核苷酸序列是seq?id?no.1的dna分子；

41、g3)、與g1)或g2)所述dna分子具有80％以上的同一性，且調(diào)控側(cè)耳菌蓋顏色的dna分子。

42、進一步地，所述的應用中，b5)所述核酸分子可為靶向上述的atp-f1β蛋白的編碼基因的rna或編碼所述rna的dna。

43、進一步地，所述rna靶向于上述的atp-f1β蛋白的編碼基因中的核苷酸序列是seqid?no.2第1-600位的區(qū)段?；蛩鰎na的靶序列為seq?id?no.2第1-600位。

44、b5)所述核酸分子具體可為雙鏈rna分子，所述雙鏈rna分子的一條鏈序列為核苷酸序列是序列表中序列4的第1位至第600位的dna片段轉(zhuǎn)錄得到的rna序列。

45、b5)所述核酸分子還可為編碼所述雙鏈rna分子的基因。該基因的結(jié)構(gòu)式為式(i)：

46、seq正向-x-seq反向式(i)。

47、所述seq正向是編碼鏈的核苷酸序列是seq?id?no.4的第1位至第600位的雙鏈dna片段；所述seq反向是編碼鏈與seq?id?no.4的第1位至第600位反向互補的雙鏈dna片段；所述x是所述seq正向與所述seq反向之間的間隔片段，所述x的核苷酸序列與所述seq正向的編碼鏈及所述seq反向的編碼鏈均不互補。

48、所述雙鏈rna分子的基因具體可為編碼鏈的核苷酸序列是seq?id?no.4的dna分子。其中seq?id?no.4第1-600位為seq正向片段的序列，seq?id?no.4第601-657位為x片段的序列，seq?id?no.5第658-1257位為seq反向片段的序列。

49、本技術(shù)還提供一種調(diào)控側(cè)耳菌蓋顏色的方法，所述方法包括調(diào)控受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或調(diào)控受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量，來調(diào)控受體側(cè)耳的菌蓋顏色。

50、進一步地，所述的方法中，所述調(diào)控可為提高或促進或上調(diào)。

51、進一步地，所述的方法中，所述調(diào)控也可為降低或抑制或下調(diào)。

52、進一步地，所述方法可包括m1)和/或m2)，

53、m1)、提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量，來提高受體側(cè)耳的菌蓋顏色；

54、m2)、降低受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或降低受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量，來降低受體側(cè)耳的菌蓋顏色，所述受體側(cè)耳含有所述atp-f1β蛋白的編碼基因。

55、進一步地，所述的方法中，m1)中通過將所述atp-f1β蛋白的編碼基因?qū)胨鍪荏w側(cè)耳來提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量；

56、進一步地，所述的方法中，m2)中通過將靶向所述atp-f1β蛋白的編碼基因的rna的編碼基因?qū)胨鍪荏w側(cè)耳來降低受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或降低受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量。

57、本技術(shù)中，所述提高受體側(cè)耳的菌蓋顏色可為使受體側(cè)耳的顏色變深。

58、本技術(shù)中，所述降低受體側(cè)耳的菌蓋顏色可為使受體側(cè)耳的顏色變淺。

59、本技術(shù)中，所述菌蓋顏色可通過色差儀測定。

60、本技術(shù)還提供一種獲得菌蓋顏色改變的目的側(cè)耳的方法，所述方法可包括n1)和/或n2)，

61、n1)、通過提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量，獲得菌蓋顏色比受體側(cè)耳深的目的側(cè)耳；

62、n2)、通過降低受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或降低受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量，獲得菌蓋顏色比受體側(cè)耳淺的目的側(cè)耳，所述受體側(cè)耳含有所述atp-f1β蛋白的編碼基因。

63、進一步地，所述的方法中，n1)中通過將所述atp-f1β蛋白的編碼基因?qū)胨鍪荏w側(cè)耳來提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或提高受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量；

64、進一步地，所述的方法中，n2)中通過將靶向所述atp-f1β蛋白編碼基因的rna的編碼基因?qū)胨鍪荏w側(cè)耳來降低所述受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的編碼基因表達量和/或降低所述受體側(cè)耳中所述atp-f1β蛋白的含量。

65、本技術(shù)中，所述atp-f1β蛋白的編碼基因可為如下g1)-g3)任一項所述的dna分子：

66、g1)、編碼鏈的編碼序列是seq?id?no.2的dna分子；

67、g2)、編碼鏈的核苷酸序列是seq?id?no.1的dna分子；

68、g3)、與g1)或g2)所述dna分子具有80％以上的同一性，且調(diào)控側(cè)耳菌蓋顏色的dna分子；

69、進一步地，所述rna的靶序列位于seq?id?no.2第1-600位?；蛩鰎na的靶序列為seq?id?no.2第1-600位。

70、進一步地，所述rna的編碼基因為核苷酸序列是seq?id?no.4的dna分子。

71、上述的重組微生物和/或上述方法制備獲得的目的側(cè)耳也是本技術(shù)的保護范圍。

72、本技術(shù)中所述的atp-f1β蛋白以及所述的生物材料也是本技術(shù)的保護范圍。

73、本技術(shù)中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性?？墒褂脟H互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點測定氨基酸序列(或核苷酸序列)的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gapcost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進行檢索一對氨基酸序列的同一性進行計算，然后即可獲得同一性的值(％)。

74、上述80％或80％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

75、所述80％以上的同一性可為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可為至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可為至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

76、本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)h2o2可以影響糙皮側(cè)耳菌蓋顏色的形成，通過轉(zhuǎn)錄組學挖掘到能量產(chǎn)生及代謝參與調(diào)控了菌蓋顏色形成。在此基礎(chǔ)上，本研究度對atp-f1β基因進行生物信息學分析并通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建糙皮側(cè)耳atp-f1β的過表達菌株和rnai菌株，通過出菇實驗及酶活測定來探究其對糙皮側(cè)耳菌蓋顏色形成的調(diào)控作用。

77、本技術(shù)取得的有益技術(shù)效果如下：

78、本技術(shù)首次揭示了atp-f1β基因在調(diào)控側(cè)耳菌蓋顏色中的作用。側(cè)耳基因atp-f1β可廣泛應用于側(cè)耳遺傳育種、種質(zhì)資源篩選、基因工程育種等領(lǐng)域，對側(cè)耳的育種以及側(cè)耳子實體菌蓋顏色形成的機理研究具有重要作用。