(一)本發(fā)明屬于生物，特別涉及一種d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體及在制備d-阿洛酮糖中的應用。

背景技術：

0、(二)背景技術

1、d-阿洛酮糖是d-果糖的c-3差向異構體。在立體化學中，含有多個手性碳原子的立體異構體，除了一個手性碳原子的構型不相同，其余的構型都相同的非對映體，叫做差向異構體，也稱作差向立體異構體。d-阿洛酮糖作為一種新功能性稀少糖，近來研究表明d-阿洛酮糖還具有很多生理功能，并且在膳食、醫(yī)藥、保健等領域具有重要應用潛力，吸引著越來越多國內(nèi)外科學家的廣泛關注。因此開發(fā)天然健康稀有糖代替已有的甜味劑成為研究熱點。而日本厚生省批準可應用于食品生產(chǎn)中，并于2011年注冊了阿洛酮糖的商標并正式申請了特定保健食品。美國食品藥物管理局(fda)也認定d-阿洛酮糖為食品安全級gras。

2、目前在生產(chǎn)d-阿洛酮糖的方法中認為生物法制備d-阿洛酮糖是最為有效的方法，關鍵是尋找能使d-果糖轉(zhuǎn)變?yōu)閐-阿洛酮糖的酶。然而，目前的d-阿洛酮糖3-差向異構酶存在對果糖催化活性低，且溫度穩(wěn)定性差等問題，不適合工業(yè)化生產(chǎn)d-阿洛酮糖。隨著d-阿洛酮糖的市場需求量的日益增加，高效的生物催化劑的開發(fā)對其工業(yè)應用至關重要。

3、為滿足工業(yè)化應用的需求，不同屬性的d-阿洛酮糖3-差向異構酶基于蛋白質(zhì)工程技術開展酶分子熱穩(wěn)定性改造已進行開展研究。而基于計算機輔助的酶熱穩(wěn)定性分子改造對于滿足人民群眾日益增長的攝糖需求也具有重要意義。

4、因此開發(fā)具有高催化活性和高熱穩(wěn)定性的d-阿洛酮糖3-差向異構酶對d-阿洛酮糖的生產(chǎn)有重要的意義。

技術實現(xiàn)思路

0、(三)
技術實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體及在制備d-阿洛酮糖中的應用，以解決目前d-阿洛酮糖-3-差向異構酶在工業(yè)生產(chǎn)中活性低、熱穩(wěn)定性差的技術問題。

2、本發(fā)明采用的技術方案是：

3、本發(fā)明提供了一種d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體，所述突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列第13位、49位、54位、第100位、第235位、第242位進行單突變或多突變獲得的。

4、進一步，所述突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列突變?yōu)橄铝兄唬?1)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸；(2)第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?3)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?4)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?00位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０罚?5)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?42位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸；(6)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?00位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０罚?42位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，核苷酸序列為seq?id?no.3，氨基酸序列為seq?id?no.4。

5、由于氨基酸序列的特殊性，任何seq?id?no.4所示氨基酸序列的多肽的變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95％以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

6、本發(fā)明還提供一種所述d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體的編碼基因，優(yōu)選seq?id?no.3所示。

7、由于核苷酸序列的特殊性，任何seq?id?no.3所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有95％以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變編碼氨基酸的功能。

8、本發(fā)明還涉及含有所述d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組載體，及重組載體構建的重組菌。所述重組載體以pet-28a為基礎載體，重組菌以e.coli?bl21(de3)為宿主菌。構建含有所述d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)，將培養(yǎng)液分離得到含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶的菌體細胞，即可作為酶源用于微生物催化d-果糖異構化制備d-阿洛酮糖。

9、本發(fā)明還涉及所述d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體在微生物催化d-果糖異構化制備d-阿洛酮糖中的應用，所述應用為：以含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌超聲破碎獲得的純酶液為酶源，以d-果糖為底物，以鈷離子為助催劑，以ph6.0-8.0的緩沖液(優(yōu)選50mm?pb(ph6.5)緩沖液)為反應介質(zhì)構成反應體系，在50～80℃、100～200r/min條件下反應，反應完全后，獲得d-阿洛酮糖。

10、進一步，所述反應體系中，濕菌體用量為10～70g/l，優(yōu)選25g/l，純酶液以蛋白含量計用量為0.01-0.5mg/ml，優(yōu)選0.03mg/ml；鈷離子終濃度為0.1～10mm，優(yōu)選1mm；底物初始濃度為50～500g/l，優(yōu)選100g/l。所述鈷離子以cocl2形式加入。

11、進一步，所述濕菌體按如下方法制備：將含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至od600＝0.8～1.0，獲得種子液；種子液以體積濃度1～5％的接種量轉(zhuǎn)入含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8，添加終濃度0.1mm的iptg，于28℃、180r/min誘導培養(yǎng)12～14h，離心，收集濕菌體。

12、進一步，所述純酶液按如下方法制備：將1g濕菌體懸浮于10ml?50mm?tris-hcl(ph9.0)緩沖液中，在120w超聲破碎20min，超聲1s，暫停2s，4℃、8000r/min、離心10min，收集上清液，獲得粗酶液；粗酶液采用nickel-nta親和層析柱(bio-scale?miniprofinityimac預裝柱，40mm長×12.6mm內(nèi)徑)進行純化，先用平衡緩沖液(50mm?pb緩沖液，300mmnacl，20mm咪唑，ph?8.0)平衡層析柱，粗酶液以1ml/min的速度上樣4個柱體積，再使用洗脫液(50mm?pb緩沖液，300mm?nacl，500mm咪唑，ph?8.0)以2ml/min的速度進行洗脫，采用紫外檢測器和電導率檢測器監(jiān)測，當紫外檢測器的信號和電導率檢測器信號同時上升時收集相應的流出液，當電導率檢測器信號不變且紫外檢測器的信號下降時停止收集，得到純酶液。

13、進一步，所述反應以d-葡萄糖為底物，按如下步驟進行：以含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌超聲破碎獲得的純酶液為酶源，以葡萄糖異構酶重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的純酶液為輔酶，以d-葡萄糖為底物，以鈷離子為助催劑，以ph6.0-8.0的緩沖液(優(yōu)選50mm?pb(ph6.5)緩沖液)為反應介質(zhì)構成轉(zhuǎn)化體系，在50～80℃、100～200r/min條件下反應，反應完全后，獲得d-阿洛酮糖。所述葡萄糖異構酶氨基酸序列如seq?id?no.5所示，所述葡萄糖異構酶重組菌的純酶液采用含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌純酶液方法制備；所述轉(zhuǎn)化體系中，輔酶加入量以蛋白含量計為0.01-0.5mg/ml，優(yōu)選0.03mg/ml；酶源加入量以濕菌體重量計為10～70g/l，優(yōu)選25g/l；酶源以蛋白含量計用量為0.01-0.5mg/ml，優(yōu)選0.03mg/ml；鈷離子終濃度為0.1～10mm，優(yōu)選1mm；底物初始濃度為50～500g/l，優(yōu)選100g/l。

14、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

15、(1)本發(fā)明篩選得到一種熱穩(wěn)定性提高的d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體，能夠耐受40～80℃高溫，增強了突變酶的半衰期，疊加突變體a13sd/100n/v235i/i242v在70℃的條件下孵育24h，殘余酶活仍然達到75％以上，tm值由野生酶的55.1℃分別上升為74.1℃，突變體酶最適溫度上升為80℃，與野生酶相比提高了20℃。

16、(2)提高了酶對合成d-阿洛酮糖所用底物d-果糖的底物親和力和轉(zhuǎn)化效率，在底物濃度為100g/l、反應溫度70℃時，野生型d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶的酶活達到223.5u/(g·wetcell?weight)，轉(zhuǎn)化率達到29.2％；d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體的酶活達到557.1/(g·wetcell?weight)，轉(zhuǎn)化率達到31.7％。

17、(3)本發(fā)明通過突變改善野生酶高溫下半衰期過短問題，突變酶相對作用時間長，擴展了相對稀少的酶庫，展示了d-果糖在合成d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶綠色環(huán)保、毒性低，副產(chǎn)物少的技術優(yōu)勢，克服了化學合成法易產(chǎn)生三廢問題，具有重要的工業(yè)應用前景。