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D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體及應(yīng)用

文檔序號:40547347發(fā)布日期:2025-01-03 11:06閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體,其特征在于,所述突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列第13位、49位、54位、第100位、第235位、第242位進行單突變或多突變獲得的。

2.如權(quán)利要求1所述的突變體,其特征在于,所述突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列突變?yōu)橄铝兄唬?1)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸;(2)第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?3)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸,第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?4)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸,第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,?00位的天冬氨酸突變?yōu)樘於0罚?5)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸,第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,?42位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸;(6)第13位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸,第235位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?00位的天冬氨酸突變?yōu)樘於0?,?42位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸。

3.一種含有權(quán)利要求1所述d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體的編碼基因的重組菌。

4.一種權(quán)利要求1所述d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體在微生物催化d-果糖異構(gòu)化制備d-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于,所述應(yīng)用為:以含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌超聲破碎獲得的純酶液為酶源,以d-果糖為底物,以鈷離子為助催劑,以ph6.0-8.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系,在50~80℃、100~200r/min條件下反應(yīng),反應(yīng)完全后,獲得d-阿洛酮糖。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述反應(yīng)體系中,濕菌體用量為10~70g/l,純酶液以蛋白含量計用量為0.01-0.5mg/ml;鈷離子終濃度為0.1~10mm;底物初始濃度為50~500g/l。

7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述濕菌體按如下方法制備:將含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min培養(yǎng)至od600=0.8~1.0,獲得種子液;種子液以體積濃度1~5%的接種量轉(zhuǎn)入含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中,于37℃、180r/min培養(yǎng)至od600=0.6~0.8,添加終濃度0.1mm的iptg,于28℃、180r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12~14h,離心,收集濕菌體。

8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述純酶液按如下方法制備:將1g濕菌體懸浮于10ml?ph9.0、50mm?tris-hcl緩沖液中,在120w超聲破碎20min,超聲1s,暫停2s,4℃、8000r/min離心10min,收集上清液,獲得粗酶液;粗酶液采用nickel-nta親和層析柱進行純化,先用平衡緩沖液平衡層析柱,粗酶液以1ml/min的速度上樣4個柱體積,再使用洗脫液以2ml/min的速度進行洗脫,采用紫外檢測器和電導(dǎo)率檢測器監(jiān)測,當紫外檢測器的信號和電導(dǎo)率檢測器信號同時上升時收集相應(yīng)的流出液,當電導(dǎo)率檢測器信號不變且紫外檢測器的信號下降時停止收集,得到純酶液;所述平衡緩沖液:50mm?pb緩沖液,300mm?nacl,20mm咪唑,ph?8.0;洗脫液:50mm?pb緩沖液,300mm?nacl,500mm咪唑,ph?8.0。

9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于,所述應(yīng)用按如下步驟進行:以含d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體編碼基因的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌超聲破碎獲得的純酶液為酶源,以葡萄糖異構(gòu)酶重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的純酶液為輔酶,以d-葡萄糖為底物,以鈷離子為助催劑,以ph6.0-8.0的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系,在50~80℃、100~200r/min條件下反應(yīng),反應(yīng)完全后,獲得d-阿洛酮糖;所述葡萄糖異構(gòu)酶氨基酸序列如seq?idno.5所示。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其特征在于,所述轉(zhuǎn)化體系中,輔酶加入量以蛋白含量計為0.01-0.5mg/ml;酶源以濕菌體重量計為10~70g/l;酶源以蛋白含量計用量為0.01-0.5mg/ml;鈷離子終濃度為0.1~10mm;底物初始濃度為50~500g/l。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種D?阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體及應(yīng)用,所述突變體是將SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列第13位、49位、54位、第100位、第235位、第242位進行單突變或多突變獲得的。本發(fā)明D?阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶突變體能夠耐受40~80℃高溫,增強了突變酶的半衰期,提高了酶對合成D?阿洛酮糖所用底物D?果糖的底物親和力和轉(zhuǎn)化效率,擴展了相對稀少的酶庫,展示了D?果糖在合成D?阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶綠色環(huán)保、毒性低,副產(chǎn)物少的技術(shù)優(yōu)勢,克服了化學(xué)合成法易產(chǎn)生三廢問題,具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員:金利群,鄭琳,周曉靜,柳志強,鄭裕國
受保護的技術(shù)使用者:浙江工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/1/2
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