(一)本發(fā)明涉及一種耐高溫的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體及在制備d-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、阿洛酮糖作為一種功能性的稀有糖，具有蔗糖70％的甜度，但其所具有的熱量僅為蔗糖的0.31％，被認(rèn)為是蔗糖和果葡糖漿理想的替代品。同時(shí)，2011年，阿洛酮糖已被美國食品和藥物管理局(fda)作為一種安全的食品添加劑，并進(jìn)一步于2019年被排除在“添加糖”、“總糖”標(biāo)簽之外。阿洛酮糖在預(yù)防肥胖，動(dòng)脈粥樣硬化治療，抗高脂血癥，抗炎，抗氧化，抗高血糖以及神經(jīng)保護(hù)等方面具有特異性生理機(jī)制。此外，d-阿洛酮糖還可以在食物加工和儲(chǔ)存過程中改善食物凝膠行為，增加風(fēng)味，減少氧化反應(yīng)。因此被廣泛的應(yīng)用于飲料、健康食物等領(lǐng)域，具有廣泛的前景。

2、阿洛酮糖由于其稀有性，因此很難通過自然界大量獲得。而化學(xué)合成具有不理想的副反應(yīng)、純化困難以及污染嚴(yán)重等問題，目前在工業(yè)應(yīng)用上尚未取得突破；相比之下，生物途徑具有高特異性以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)izumoring策略，d-阿洛酮糖可由d-阿洛酮糖-3-差相異構(gòu)酶催化d-果糖異構(gòu)化而得到，因此d-阿洛酮糖-3-差相異構(gòu)酶成為了學(xué)者們的研究重點(diǎn)。然而，野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶往往存在催化活性低、熱穩(wěn)定性差等問題，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)工藝的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種耐高溫的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(cldae)突變體及在制備d-阿洛酮糖中的應(yīng)用，擴(kuò)展了d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的來源，有效提高了酶的熱穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化效率，提高了d-阿洛酮糖的生產(chǎn)效率，增加d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種耐高溫的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體，所述突變體是將seqid?no.2所示氨基酸序列第17位、118位、121位、165位、197位、249位進(jìn)行單突變或多突變獲得的。

4、進(jìn)一步，所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體是將seq?id?no.2所示氨基酸序列突變?yōu)橄铝兄唬?1)第17位天冬酰胺突變?yōu)榫彼幔?2)第118位甘氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?3)第121位組氨酸突變?yōu)樘於彼幔?4)165位蘇氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔?5)197位異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?6)249位苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔?7)第121位組氨酸突變?yōu)樘於彼帷⒌?49位苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?，氨基酸序列如seq?id?no.4所示，核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

5、由于氨基酸序列的特殊性，任何seq?id?no.4所示氨基酸序列的多肽的變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95％以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

6、本發(fā)明還提供一種所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體的編碼基因。

7、由于核苷酸序列的特殊性，任何seq?id?no.3所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有95％以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變編碼氨基酸的功能。

8、本發(fā)明還提供了一種含所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組質(zhì)粒，及由重組質(zhì)粒構(gòu)建的重組基因工程菌；所述重組質(zhì)粒以載體pet28a為基礎(chǔ)載體；所述工程菌的宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌，也可以是枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母或乳酸菌。

9、本發(fā)明還提供了一種所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體在微生物催化d-果糖異構(gòu)化制備d-阿洛酮糖中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為：以含d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體基因的重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎提取的純酶液為酶源，以d-果糖為底物，以鈷離子為助催劑，以ph6.5的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在50～80℃(優(yōu)選70℃)、1000r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得d-果糖和d-阿洛酮糖混合物。

10、進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中，濕菌體用量為2.5～10g/l，優(yōu)選2.5g/l；鈷離子終濃度為0.1～10mm，優(yōu)選1mm；底物初始加入濃度為50～700g/l，優(yōu)選50g/l。所述鈷離子以cocl2水溶液的形式加入。

11、進(jìn)一步，所述濕菌體按如下方法制備獲得：將含d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至od600＝0.8～1.0，獲得種子液；將種子液以體積濃度1～5％的接種量轉(zhuǎn)入含終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8，添加終濃度0.1mm的iptg，于28℃、180r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12～14h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)菌懸液，將誘導(dǎo)培養(yǎng)菌懸液離心，收集得到濕菌體。

12、進(jìn)一步，所述純酶液按如下步驟制備：將1g濕菌體懸浮于10ml?ph?6.5、50mm磷酸鈉鹽緩沖液中，在120w下超聲破碎30min，超聲2s，暫停2s，離心，取上清，獲得粗酶液；粗酶液采用nickel-nta親和層析柱(bio-scale?mini?profinity?imac預(yù)裝柱，40mm長×12.6mm內(nèi)徑)進(jìn)行純化，先用平衡緩沖液平衡層析柱，粗酶液以1ml/min的速度上樣4個(gè)柱體積，再使用洗脫液以2ml/min的速度進(jìn)行洗脫，采用紫外檢測(cè)器和電導(dǎo)率檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，當(dāng)紫外檢測(cè)器的信號(hào)和電導(dǎo)率檢測(cè)器信號(hào)同時(shí)上升時(shí)收集相應(yīng)的洗脫液，當(dāng)電導(dǎo)率檢測(cè)器信號(hào)不變且紫外檢測(cè)器的信號(hào)下降時(shí)停止收集，收集的酶液即為純酶液；所述平衡緩沖液組成：50mmpb緩沖液，300mm?nacl，20mm咪唑，ph?8.0；所述洗脫液組成：50mm?pb緩沖液，300mm?nacl，500mm咪唑，ph?8.0。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

14、(1)本發(fā)明篩選得到一種耐高溫的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體，能夠耐受45～70℃高溫，提高了突變酶的tm值，延長了酶的半衰期。突變體cldae/h121d/f249y在65℃時(shí)t1/2值2295min，是野生型cldae的38.25倍；tm值由野生型cldae的58.5℃上升為71.3℃，提高了12.8℃。

15、(2)本發(fā)明提供的突變體提高了酶對(duì)底物d-阿洛酮糖的親和力和轉(zhuǎn)化效率，在底物濃度為50g/l、反應(yīng)溫度70℃時(shí)，野生型cldae的酶活達(dá)到2324.6u/(g·wet?cellweight)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到30％；突變體cldae/h121d/f249y的酶活達(dá)到2960.6u/(g·wet?cellweight)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到34.1％。

16、(3)本發(fā)明獲得的突變體顯著提高了d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性及催化能力，擴(kuò)展了相對(duì)稀少的酶庫，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提高了d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。