本發(fā)明涉及犬巴貝斯蟲(chóng)病的病原體檢測(cè)，尤其涉及一種區(qū)分犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)的引物探針組合物、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、犬巴貝斯蟲(chóng)?。╟anine?babesiosis）是由巴貝斯蟲(chóng)（babesia）寄生于犬紅細(xì)胞內(nèi)引起的疾病。巴貝斯蟲(chóng)是一種經(jīng)蜱傳播的血源性原蟲(chóng)，犬感染巴貝斯蟲(chóng)后表現(xiàn)發(fā)熱、嗜睡癥狀，隨后出現(xiàn)溶血性貧血，紅細(xì)胞破裂，肝、肺、腎臟凝血異常，電解質(zhì)失衡，器官功能障礙，通常呈急性經(jīng)過(guò)，嚴(yán)重威脅犬的健康。

2、目前在我國(guó)境內(nèi)犬巴貝斯蟲(chóng)病的發(fā)生和分布呈流行性和廣泛性，一年中的春季、夏季和秋季屬多發(fā)季節(jié)，在只要能滋生蜱的地區(qū)，都有可能存在本病的傳播，并且近些年該病的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。

3、在我國(guó)引起犬巴貝斯蟲(chóng)病的病原體主要為犬巴貝斯蟲(chóng)（babesia?canis）和吉氏巴貝斯蟲(chóng)（babesia?gibsoni）。其中犬巴貝斯蟲(chóng)蟲(chóng)體較大，一般長(zhǎng)4-5μm，韋氏巴貝斯蟲(chóng)（babesia?canis?vogeli）、犬巴貝斯蟲(chóng)（babesia?canis）和羅氏巴貝斯蟲(chóng)（babesia?canisrossi）是我國(guó)較為常見(jiàn)的3種犬巴貝斯蟲(chóng)。吉氏巴貝斯蟲(chóng)蟲(chóng)體很小，長(zhǎng)度1-2.5μm。是我國(guó)巴貝斯蟲(chóng)病的主要致病蟲(chóng)種。在臨床上犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)引起的臨床癥狀類(lèi)似，但是在用藥治療上存在差異，三氮脒和氧二苯醚羥乙基磺酸鹽對(duì)犬巴貝斯蟲(chóng)高度有效但不能清除吉氏巴貝斯蟲(chóng)，阿托伐醌和阿奇霉素聯(lián)合治療吉氏巴貝斯蟲(chóng)最有效，因此，有效區(qū)分致病蟲(chóng)體對(duì)犬巴貝斯蟲(chóng)病的預(yù)防和治療有重要意義。

4、目前臨床中較為直接的診斷方法為靜脈采血后進(jìn)行血涂片染色法，不僅方便快捷，而且可以根據(jù)蟲(chóng)體大小區(qū)分吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)，但血涂片受限于涂片和讀片技術(shù)，對(duì)操作者要求較高，且在感染早期難以發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體，很容易造成漏檢。

5、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量pcr技術(shù)憑借超高靈敏度和特異性在犬巴貝斯蟲(chóng)病的診斷中被廣泛應(yīng)用，但是目前尚無(wú)能同時(shí)有效區(qū)分吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)的鑒別檢測(cè)方法。并且，現(xiàn)有的熒光定量pcr試劑配制繁瑣，需要專(zhuān)業(yè)pcr實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，在2h左右，限制了其在寵物醫(yī)院的推廣使用。

6、因此，現(xiàn)有技術(shù)有待進(jìn)一步改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種可快速準(zhǔn)確的區(qū)分犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)的引物探針組合物、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，可快速且有效區(qū)分樣品中的吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)，適合推廣應(yīng)用，對(duì)犬巴貝斯蟲(chóng)病的預(yù)防和治療有重要意義。

2、第一方面，本技術(shù)提供一種區(qū)分犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)的引物探針組合物，其包括：

3、用于檢測(cè)吉氏巴貝斯蟲(chóng)的特異基因trap的引物探針：序列如seq?id?no.1所示的上游引物吉巴-f，序列如seq?id?no.2所示的下游引物吉巴-r，序列如seq?id?no.3所示的熒光探針吉巴-p；

4、用于檢測(cè)犬巴貝斯蟲(chóng)的16s?rrna的引物探針：序列如seq?id?no.4所示的上游引物犬巴-f，序列如seq?id?no.5所示的下游引物犬巴-r，序列如seq?id?no.6所示的熒光探針犬巴-p；

5、熒光探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光探針的3’端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)。

6、優(yōu)選地，所述引物探針組合物還包括用于檢測(cè)內(nèi)參基因actb的引物探針：序列如seq?id?no.7所示的上游引物actb?-f，序列如seq?id?no.8所示的下游引物actb?-r，序列如seq?id?no.9所示的熒光探針actb?-p。

7、可選地，所述引物探針組合物中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自fam、hex、cy5、rox、vic；熒光淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、bhq3。

8、第二方面，本技術(shù)還提供一種區(qū)分犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)的檢測(cè)試劑盒，其包括前述的引物探針組合物。

9、可選地，所述檢測(cè)試劑盒包括凍干pcr試劑，所述凍干pcr試劑是由pcr混合液通過(guò)凍干制備而成，所述pcr混合液包括：前述的引物探針組合物、dna聚合酶、dntps、緩沖液和凍干保護(hù)劑；

10、優(yōu)選的，所述凍干保護(hù)劑由以下成分組成：4%?w/v%海藻糖和3%?w/v%葡聚糖；

11、優(yōu)選地，所述pcr混合液主要由以下成分制備而成：0.1-1μm的引物探針、0.2-0.8μl的super?taq?dna聚合酶、2.5μl的10x?buffer、12.5μl的凍干保護(hù)劑。

12、優(yōu)選的，所述試劑盒中凍干pcr試劑中引物的濃度為0.4-1μm；探針的濃度為0.1-0.5μm。

13、優(yōu)選地，所述dna聚合酶為super?taq?dna聚合酶。所述super?taq?dna聚合酶是經(jīng)改造優(yōu)化的taq?dna聚合酶，對(duì)抑制物具有更好的耐受和更高的擴(kuò)增延伸效率；

14、可選地，所述檢測(cè)試劑盒中，所述pcr混合液還包括：pcr變性促進(jìn)劑，所述pcr變性促進(jìn)劑為以下一種或多種成分的組合：1%-15%?w/v%甜菜堿、1%-15%?v/v%dmso和1%-15%?v/v%甲酰胺。

15、優(yōu)選的，所述pcr混合液還包括：核酸釋放劑；所述核酸釋放劑包括以下濃度的各成分：100mm的koh、5mm?的edta、100mm的tris-hcl和5%v/v%的山梨糖醇；

16、可選地，所述pcr混合液還包括復(fù)溶液，復(fù)溶液為包含5%?v/v%甘油的無(wú)菌水溶液。

17、優(yōu)選的，所述pcr變性促進(jìn)劑為1~15%?v/v%的dmso。更優(yōu)選地，所述pcr變性促進(jìn)劑為15%?v/v%的dmso。

18、可選地，所述檢測(cè)試劑盒還包括：陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，所述陽(yáng)性質(zhì)控為吉氏巴貝斯蟲(chóng)質(zhì)粒和犬巴貝斯蟲(chóng)質(zhì)粒和犬a(chǎn)ctb內(nèi)參質(zhì)粒的混合物，三者的比例為1:1:1；所述陰性對(duì)照為無(wú)菌去離子水。

19、第三方面，一種前述的凍干pcr試劑的制備方法，其包括以下步驟：將所有成分混勻后通過(guò)多段式凍干程序進(jìn)行凍干，所述多段式凍干程序?yàn)椋?/p>

20、預(yù)凍階段：-45℃，維持2h；一次升華干燥：升溫至-30℃，同時(shí)開(kāi)啟真空泵快速抽真空到1mbar，維持2h；然后升溫至-15℃，維持2h；二次升華干燥：繼續(xù)升溫至10℃，維持2h；結(jié)束后升溫至25℃，維持2h。壓蓋：冷凍干燥程序運(yùn)行結(jié)束后，沖入氮?dú)馄胶庵链髿鈮?，然后進(jìn)行八連排管蓋壓蓋封袋，完成凍干。

21、第四方面，本技術(shù)還提供一種非疾病診斷目的的區(qū)分犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)的檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

22、s1、向樣本中加入核酸釋放劑，渦旋震蕩后，吸取懸濁液加入到復(fù)溶液，震蕩混勻后，將混合液加入到凍干pcr試劑中，混勻并離心得到反應(yīng)混合物；

23、s2、將上述反應(yīng)混合物進(jìn)行超快速熒光定量pcr擴(kuò)增；超快速熒光定量pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

24、變性溫度為88-95℃，反應(yīng)時(shí)間為1-8s；

25、退火溫度為58-70℃，反應(yīng)時(shí)間為3-15s，并采集熒光；

26、反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35~45個(gè)循環(huán)；

27、s3、根據(jù)熒光定量pcr反應(yīng)體系中的三個(gè)通道的ct值分析判斷待測(cè)樣本中是否感染吉氏巴貝斯蟲(chóng)和/犬巴貝斯蟲(chóng)。

28、上述區(qū)分犬巴貝斯蟲(chóng)和吉氏巴貝斯蟲(chóng)的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，特異性和準(zhǔn)確性高，且檢測(cè)周期得到極大的縮短。從加樣到出具報(bào)告總時(shí)長(zhǎng)可短至20-30min，具有周期短，效率高的優(yōu)點(diǎn)。

29、可選地，所述s2步驟是在超快速熒光定量pcr儀上進(jìn)行操作。

30、優(yōu)選的，所述超快速熒光定量pcr儀體積小，重量輕，包含8個(gè)pcr反應(yīng)孔和4個(gè)熒光通道，4個(gè)熒光通道為fam、hex、rox和cy5。

31、進(jìn)一步優(yōu)選地，s2步驟中，超快速熒光定量pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃，2s；65℃，5s；擴(kuò)增進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

32、優(yōu)選地，s3步驟中使用智能結(jié)果分析報(bào)告解讀軟件，該軟件包含各種預(yù)存常用項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(kù)，并能通過(guò)對(duì)熒光定量pcr結(jié)果的自動(dòng)識(shí)別生成解讀報(bào)告。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，更便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的快速展示。

33、可選地，所述檢測(cè)方法中，s3步驟的具體分析判斷方法為：

34、若熒光探針吉巴-p的熒光通道為第一熒光通道，熒光探針犬巴-p使用的熒光通道為第二熒光通道；

35、當(dāng)?shù)谝粺晒馔ǖ纁t值<40，第二熒光通道無(wú)ct值時(shí)，說(shuō)明樣品中只含有吉氏巴貝斯蟲(chóng)；

36、當(dāng)?shù)谝粺晒馔ǖ罒o(wú)ct值，第二熒光通道ct值<40時(shí)，說(shuō)明樣品中只有犬巴貝斯蟲(chóng)；

37、當(dāng)?shù)谝粺晒馔ǖ纁t值<40，第二熒光通道ct值<40時(shí)，說(shuō)明樣品中含有吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)；

38、當(dāng)?shù)谝粺晒馔ǖ罒o(wú)ct值，第二熒光通道無(wú)ct值時(shí)，說(shuō)明樣品中無(wú)吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)。

39、可選地，所述檢測(cè)方法中，若熒光探針actb–p使用的熒光通道為第三熒光通道，則當(dāng)?shù)谌裏晒馔ǖ赖腸t值<40，說(shuō)明樣本取樣合格。

40、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第一熒光通道為fam，第二熒光通道為hex，第三熒光通道為cy5。

41、本發(fā)明具有以下有益效果：

42、1.本發(fā)明首次在同一個(gè)pcr反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)，并根據(jù)其特異性基因序列有效區(qū)分吉氏巴貝斯蟲(chóng)和犬巴貝斯蟲(chóng)，為感染巴貝斯蟲(chóng)的犬提供精準(zhǔn)的用藥方案，對(duì)犬巴貝斯蟲(chóng)病的預(yù)防和治療有重要意義，對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展具有極大的促進(jìn)作用。

43、2.本發(fā)明采用血液樣本直接釋放，全預(yù)混凍干pcr試劑，超快速核酸擴(kuò)增程序以及配套超快速熒光定量pcr檢測(cè)分析系統(tǒng)，設(shè)備小巧便捷，操作方便，試劑盒可以常溫運(yùn)輸保存，檢測(cè)時(shí)間短，報(bào)告解讀立等可取，從加樣到出具報(bào)告≤30min，有利于在寵物醫(yī)院推廣使用。

44、3.本發(fā)明使用pcr-熒光探針?lè)ǎ瑪U(kuò)增反應(yīng)及檢測(cè)采用完全封閉的系統(tǒng)，避免產(chǎn)生氣溶膠污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性，操作方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，檢測(cè)成本低，靈敏度和特異性好。