本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種能夠廣譜結(jié)合多分支h5nx亞型禽流感病毒ha蛋白的單克隆抗體、中和表位鑒定及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、h5亞型高致病性禽流感病毒（avian?influenza?virus,?aiv）呈世界性分布，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，并且能夠?qū)е露喾N哺乳動(dòng)物包括人類的感染與發(fā)病，因此還具有重要的公共衛(wèi)生意義。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2005年1月至2022年11月，全球已報(bào)告了8534起h5亞型高致病性禽流感疫情，發(fā)病死亡和被撲殺銷毀的家禽多達(dá)3.89億只（shi?j,?zeng?x,cui?p,?et?al.?alarming?situation?of?emerging?h5?and?h7?avian?influenza?andeffective?control?strategies?[j].?emerg?microbes?infect,?2023,?12(1):2155072）。截至2024年7月19日，世界衛(wèi)生組織通報(bào)h5n1亞型aiv自2003年以來(lái)已累計(jì)引起896例確診的人感染病例，其中463例發(fā)生死亡，致死率超過(guò)了50%（https://www.who.int/）。此外，h5n2、h5n6和h5n8亞型aiv也能導(dǎo)致人類的感染發(fā)病。

2、血凝素（haemagglutinin,?ha）是aiv表面最主要的抗原性糖蛋白，具有凝集紅細(xì)胞的能力，是疫苗、中和抗體與診斷制劑的核心靶點(diǎn)。然而，ha基因也是aiv基因組中變異程度最大的基因，直接影響病毒抗原性。已知h5亞型高致病性aiv衍生出了眾多ha基因進(jìn)化分支（clade），包括clade?0~9的一級(jí)分支及其多級(jí)亞分支。其中，2.3.2和2.3.4分支的h5亞型高致病性aiv在我國(guó)長(zhǎng)期占據(jù)優(yōu)勢(shì)流行，且兩分支之間具有明顯的抗原性變異，因此分別研發(fā)了不同的疫苗株來(lái)應(yīng)對(duì)其流行。此外，2.3.2與2.3.4兩分支內(nèi)部的病毒株也在不斷進(jìn)化變異而導(dǎo)致抗原性差異。針對(duì)2.3.2分支進(jìn)一步衍生出2.3.2.1d、2.3.2.1e等流行分支，國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)使用的h5亞型禽流感病毒重組滅活疫苗從re-6更新為re-12；而針對(duì)2.3.4分支不斷進(jìn)化出2.3.4.4g、2.3.4.4h、2.3.4.4b等主流亞分支，疫苗株則至少歷經(jīng)了從re-5、re-8、re-11到現(xiàn)行使用的re-13、re-14（曾顯營(yíng),?田國(guó)彬,?陳化蘭.?中國(guó)h5/h7亞型禽流感疫苗研制和應(yīng)用進(jìn)展[j].?中國(guó)科學(xué):?生命科學(xué),?2023,?53(12):?1700-1712）。

3、由于流行株與疫苗株的抗原匹配程度是決定疫苗免疫保護(hù)效力的關(guān)鍵，因此監(jiān)測(cè)并篩選抗原性一致的流行株作為疫苗候選株至關(guān)重要。而且，應(yīng)對(duì)新變異h5亞型aiv的商品化疫苗通常滯后于流行株的出現(xiàn)，這很可能加劇了變異毒株因逃逸抗原匹配程度不佳的疫苗而導(dǎo)致疫情傳播擴(kuò)散。因此，研制具有廣泛保護(hù)作用的通用疫苗對(duì)于有效防控h5亞型高致病性禽流感有著極其重要的實(shí)際意義，然而通用疫苗設(shè)計(jì)的前提是發(fā)現(xiàn)保守的廣譜性抗原表位，通過(guò)解析具有廣譜識(shí)別能力的單克隆抗體所針對(duì)的抗原表位則是發(fā)現(xiàn)廣譜性抗原表位的主要途徑之一。由于靶向ha蛋白球狀頭部結(jié)構(gòu)域的抗體能夠特異性中和病毒并可通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，不少的流感通用疫苗設(shè)計(jì)也是關(guān)注ha蛋白的該區(qū)域。

4、近年來(lái)，抗ha蛋白的單克隆抗體還被廣泛應(yīng)用于研究流感病毒的抗原性。例如，鄭清炳等利用抗2009甲型h1n1大流感疫苗株a/califomia/07/2009的多個(gè)ha蛋白單克隆抗體，對(duì)病毒分離株進(jìn)行了抗原差異性分析，并鑒定出sa抗原區(qū)的128、158位，ca2抗原區(qū)的225位，sb抗原區(qū)的188位等關(guān)鍵氨基酸的突變能夠顯著影響病毒的抗原性（鄭清炳,?陳毅歆,?曾奮,?等.?利用血凝素單抗監(jiān)測(cè)甲型h1n1流感病毒的抗原性變異情況[c]//中華醫(yī)學(xué)會(huì),?中華醫(yī)學(xué)會(huì)微生物學(xué)與免疫學(xué)分會(huì).?2012全國(guó)臨床微生物與感染免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.?國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,2012:?1）。zhang等通過(guò)結(jié)合一組抗h5亞型aiv疫苗株re-8的ha蛋白單克隆抗體，鑒定出第120、126、141、156、185、189位是重要的抗原性位點(diǎn)，其對(duì)于2.3.4.4分支h5流感病毒抗原圖譜的繪制具有重要意義（zhang?y,?cui?p,?shi?j,?et?al.?key?amino?acid?residues?thatdetermine?the?antigenic?properties?ofhighly?pathogenic?h5?influenza?virusesbearing?the?clade?2.3.4.4?hemagglutinin?gene?[j].?viruses.?2023,?15(11):2249）。

5、然而，由于單克隆抗體針對(duì)的是單一抗原表位，反應(yīng)譜通常較為局限，往往僅能識(shí)別同屬于一個(gè)ha分支的病毒，因此鑒定到能夠同時(shí)識(shí)別多分支h5病毒ha蛋白的廣譜中和性單克隆抗體，將為h5亞型aiv抗原監(jiān)測(cè)與疫苗研制提供重要生物材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開(kāi)了1種能夠廣譜結(jié)合多分支h5nx亞型禽流感病毒ha蛋白的單克隆抗體1g10。該單克隆抗體靶向ha蛋白，在間接免疫熒光和western?blot試驗(yàn)中均能與ha蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合，且能夠與2.3.2.1d、2.3.4.4b、2.3.4.4d等多個(gè)ha進(jìn)化分支的h5n1、h5n6和h5n8等h5nx亞型禽流感病毒發(fā)生特異性血凝抑制反應(yīng)，并具有中和活性。

2、本發(fā)明所述的一種廣譜結(jié)合多分支h5nx亞型禽流感病毒ha蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)包含vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，輕鏈可變區(qū)包含vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；

3、所述的vhcdr1的氨基酸序列為seq?id?no.?5所示；

4、所述的vhcdr2的氨基酸序列為seq?id?no.?6所示；

5、所述的vhcdr3的氨基酸序列為seq?id?no.?7所示；

6、所述的vlcdr1的氨基酸序列為seq?id?no.?8所示；

7、所述的vlcdr2的氨基酸序列為seq?id?no.?9所示；

8、所述的vlcdr3的氨基酸序列為seq?id?no.?10所示。

9、進(jìn)一步地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.?2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.?4所示。

10、本發(fā)明中，所述的廣譜結(jié)合多分支h5nx亞型禽流感病毒ha蛋白的單克隆抗體所述重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.?1所示、所述輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?idno.?3所示。能夠利用常規(guī)基因工程或蛋白質(zhì)工程的方法表達(dá)抗體，避免了雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)期凍存抗體基因的丟失，同時(shí)有利于在基因和蛋白水平上進(jìn)行抗體優(yōu)化，提高抗體的特異性和親和力。

11、本發(fā)明還公開(kāi)了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有上述所述的重鏈可變區(qū)核苷酸序列及輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

12、本發(fā)明還公開(kāi)了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有上述所述的表達(dá)載體。

13、本發(fā)明還公開(kāi)了所述的單克隆抗體在流感病毒抗原性變異分析中的應(yīng)用。

14、進(jìn)一步地，公開(kāi)了所述的單克隆抗體在制備h5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體識(shí)別的中和性抗原表位的鑒定，通過(guò)將野生型h5亞型禽流感病毒液與本發(fā)明具有中和特性的ha蛋白單克隆抗體混合孵育，接種spf雞胚制備血凝抑制效價(jià)顯著降低的逃逸突變株，并將逃逸突變株ha基因序列與野生型進(jìn)行比對(duì)，確定第170和231位差異氨基酸位點(diǎn)為所述單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位，且大數(shù)據(jù)分析指出170n和231t在不同進(jìn)化分支h5亞型流感病毒中具有良好的保守性。

16、本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體在研究h5亞型禽流感病毒抗原性變異中的應(yīng)用，通過(guò)篩選逃逸突變株鑒定出ha蛋白n170d、t231n突變能夠顯著影響抗原性。

17、本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明公開(kāi)了一種廣譜結(jié)合多分支h5nx亞型禽流感病毒ha蛋白的中和性單克隆抗體1g10，能夠與多株2.3.2.1和2.3.4.4流行分支h5n1、h5n6和h5n8亞型禽流感病毒發(fā)生血凝抑制反應(yīng)，并在間接免疫熒光和western?blot試驗(yàn)中均能特異性識(shí)別h5亞型禽流感病毒ha蛋白，可進(jìn)一步應(yīng)用于h5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑的制備、通用疫苗的設(shè)計(jì)和抗原變異的研究。