本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種用于檢測單個外泌體亞群的探針組合物、crispr/cas12a報(bào)告器及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體(exosome,exo)是由真核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(extracellularvesicles,evs)，反映了親本細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的變化。作為細(xì)胞間通訊的信使，它們廣泛參與癌癥轉(zhuǎn)移、免疫反應(yīng)和組織修復(fù)。exo在分子特征上表現(xiàn)出復(fù)雜的異質(zhì)性，源于具有不同結(jié)構(gòu)和組成的多個外顯子亞群的產(chǎn)生。特別是，腫瘤來源的外泌體(tumor-derivedexosomes,texo)亞群可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展，作為癌癥篩查和治療監(jiān)測的理想無創(chuàng)生物標(biāo)志物具有巨大的前景。然而，由于復(fù)雜的背景干擾、異質(zhì)的exo亞型和不同的外泌體蛋白表達(dá)，texo亞群的精確鑒定仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。目前，超速離心是分離exo最常用的技術(shù)，但它效率低且無法定量分離exo亞群。大多數(shù)其他類型的檢測方法往往涉及操作復(fù)雜的純化步驟和專用設(shè)備，不適合在科研和臨床應(yīng)用中高效操作；而且大多數(shù)分析方法只能用于鑒定evs的單一生物標(biāo)志物，這也降低了evs分析的特異性，這阻礙了evs在癌癥診斷中的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測單個外泌體亞群的探針組合物、crispr/cas12a報(bào)告器及其制備與應(yīng)用，用于解決目前分析外泌體異質(zhì)性的困難，檢測方式復(fù)雜等問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供了一種探針組合物，包括第一適配體探針(即hp探針)和第二適配體探針(即he探針)；

3、所述第一適配體探針的核苷酸序列包括第一適配體區(qū)域和第一互補(bǔ)區(qū)域，所述第一適配體區(qū)域包括可特異性結(jié)合exo膜上的細(xì)胞程序性死亡配體1(programmed?celldeath?1ligand?1,pd-l1)蛋白的適配體，所述第一互補(bǔ)區(qū)域與crrna部分序列互補(bǔ)；

4、所述第二適配體探針的核苷酸序列包括第二適配體區(qū)域和第二互補(bǔ)區(qū)域，所述第二適配體區(qū)域包括可特異性結(jié)合exo膜上的上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial?celladhesion?molecule,epcam)蛋白的適配體，所述第二互補(bǔ)區(qū)域與crrna部分序列互補(bǔ)；

5、所述第一探針和第二探針的核苷酸序列高度非互補(bǔ)。

6、在一些實(shí)施例中，所述可特異性結(jié)合exo膜上的pd-l1蛋白的適配體為mj5c適配體。

7、在一些實(shí)施例中，所述可特異性結(jié)合exo膜上的epcam蛋白的適配體為syl3c適配體。

8、在一些實(shí)施例中，所述第一適配體區(qū)域位于所述第一適配體探針的頭部。

9、在一些實(shí)施例中，所述第二適配體區(qū)域位于所述第二適配體探針的尾部。

10、在一些實(shí)施例中，所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

11、在一些實(shí)施例中，所述第一互補(bǔ)區(qū)域?yàn)閠1，所述t1的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

12、在一些實(shí)施例中，所述第二互補(bǔ)區(qū)域?yàn)閠2，所述t2的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

13、在一些實(shí)施例中，所述第一適配體探針的核苷酸序列還包括位于所述第一適配體區(qū)域和第一互補(bǔ)區(qū)域之間的第一間隔區(qū)域，所述第一間隔區(qū)域?yàn)楹?0～40個堿基t的重復(fù)序列。

14、在一些實(shí)施例中，所述第二適配體探針的核苷酸序列還包括位于所述第二適配體區(qū)域和第二互補(bǔ)區(qū)域之間的第二間隔區(qū)域，所述第二間隔區(qū)域?yàn)楹?0～40個堿基t的重復(fù)序列。

15、在一些實(shí)施例中，所述第一適配體探針的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

16、在一些實(shí)施例中，所述第二適配體探針的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

17、在一些實(shí)施例中，所述第一適配體探針還包括熒光基團(tuán)和/或淬滅基團(tuán)。

18、在一些實(shí)施例中，所述第二適配體探針還包括熒光基團(tuán)和/或淬滅基團(tuán)。

19、在一些實(shí)施例中，所述熒光基團(tuán)包括但不局限于6-fam等，所述淬滅基團(tuán)包括但不局限于bhq1等。

20、本發(fā)明還提供一種用于檢測單個外泌體亞群的crispr/cas12a報(bào)告器，包括反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括如上所述的探針組合物，還包括靶標(biāo)外泌體、cas12a/crrna復(fù)合物(cas12a/crrna?complex)和報(bào)告鏈(f-h-q)；所述cas12a/crrna復(fù)合物由cas12a酶與crrna連接而成；

21、所述第一適配體探針和第二適配體探針識別外泌體(exo)膜上的靶蛋白后，發(fā)生變構(gòu)，暴露出所述第一互補(bǔ)區(qū)域和第二互補(bǔ)區(qū)域；所述第一互補(bǔ)區(qū)域和第二互補(bǔ)區(qū)域通過寡核苷酸雜交與crrna特異性結(jié)合，協(xié)同激活cas12a酶的反式切割活性，切割報(bào)告鏈(f-h-q)，產(chǎn)生熒光信號。

22、在一些實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系為均相體系，包括如上所述的探針組合物，還包括靶標(biāo)外泌體、cas12a酶、crrna和報(bào)告鏈(f-h-q)。

23、在一些實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系為液滴體系，所述液滴體系包括水相1和水相2，所述水相1包括cas12a酶、crrna和報(bào)告鏈(f-h-q)，所述水相2包括如上所述的探針組合物，還包括靶標(biāo)外泌體；所述水相1、水相2與液滴生成油共同生成液滴。其中，所述液滴生成油為液滴微流控技術(shù)中常用的液滴生成油，包括但不局限于礦物油、棕櫚酸異丙酯、drop-surf氟油等。

24、在一些實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系中，所述第一適配體探針、第二適配體探針、cas12a酶、crrna和報(bào)告鏈(f-h-q)的摩爾含量相同。

25、在一些實(shí)施例中，所述報(bào)告鏈(f-h-q)的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

26、在一些實(shí)施例中，所述報(bào)告鏈(f-h-q)還包括熒光基團(tuán)和/或淬滅基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)包括但不局限于6-fam等，所述淬滅基團(tuán)包括但不局限于bhq1等。

27、在一些實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系還包括緩沖液、溶劑等，所述緩沖液包括但不局限于pbs緩沖液、ne緩沖液等，所述溶劑包括但不局限于超純水、去離子水等。

28、本發(fā)明還提供一種如上所述的用于檢測單個外泌體亞群的crispr/cas12a報(bào)告器的制備方法，包括：

29、當(dāng)所述反應(yīng)體系為均相體系時，配制所述均相體系，進(jìn)行孵育反應(yīng)；

30、和/或，當(dāng)所述反應(yīng)體系為液滴體系時，分別配制水相1和水相2，將水相1和水相2分別導(dǎo)入微流控芯片，與液滴生成油共同生成液滴，將生成的液滴進(jìn)行孵育反應(yīng)。

31、在一些實(shí)施例中，所述孵育反應(yīng)溫度為37℃。

32、在一些實(shí)施例中，所述孵育反應(yīng)時間30min。

33、在一些實(shí)施例中，在配制所述反應(yīng)體系前，還包括：對所述第一適配體探針、第二適配體探針、crrna和報(bào)告鏈(f-h-q)進(jìn)行變性，退火處理。在一具體實(shí)施例中，變性溫度為95℃，變性時間為5min。

34、本發(fā)明還提供如上所述的探針組合物、如上所述的crispr/cas12a報(bào)告器和/或如上所述的方法制得的crispr/cas12a報(bào)告器在制備單個外泌體亞群檢測試劑和/或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。

35、在一些實(shí)施例中，所述外泌體為腫瘤來源的外泌體。

36、本發(fā)明還提供一種用于檢測單個外泌體亞群的系統(tǒng)，包括如上所述的探針組合物、如上所述的crispr/cas12a報(bào)告器和/或如上所述的方法制得的crispr/cas12a報(bào)告器，還包括以下檢測設(shè)備中的至少一種：熒光分光光度計(jì)、微流控液滴生成儀和熒光顯微鏡，但不局限于此。

37、本發(fā)明還提供一種非疾病診斷或治療目的的單個外泌體亞群檢測方法，包括采用如上所述的探針組合物、如上所述的crispr/cas12a報(bào)告器和/或如上所述的方法制得的crispr/cas12a報(bào)告器。

38、在一些實(shí)施例中，所述檢測方法包括：

39、當(dāng)所述反應(yīng)體系為均相體系時，配制所述均相體系，進(jìn)行孵育反應(yīng)，得反應(yīng)物；檢測所得反應(yīng)物的熒光信號，基于檢測得到的熒光信號檢測單個外泌體亞群；

40、和/或，當(dāng)所述反應(yīng)體系為液滴體系時，分別配制水相1和水相2，將水相1和水相2分別導(dǎo)入微流控芯片，與液滴生成油共同生成液滴，將生成的液滴進(jìn)行孵育反應(yīng)，再置于熒光顯微鏡下進(jìn)行成像，基于成像結(jié)果檢測單個外泌體亞群。

41、在一些實(shí)施例中，所述孵育反應(yīng)溫度為37℃。

42、在一些實(shí)施例中，所述孵育反應(yīng)時間30min。

43、在一些實(shí)施例中，在配制所述反應(yīng)體系前，還包括：對所述第一適配體探針、第二適配體探針、報(bào)告鏈(f-h-q)和crrna進(jìn)行變性，退火處理。在一具體實(shí)施例中，變性溫度為95℃，變性時間為5min。

44、如上所述，本發(fā)明的用于檢測單個外泌體亞群的探針組合物、crispr/cas12a報(bào)告器及其制備與應(yīng)用，具有以下有益效果：

45、本發(fā)明基于兩種蛋白激活的適配體探針和雙靶標(biāo)激活的crispr/cas12a系統(tǒng)，構(gòu)建得到一種具有良好流體和空間雙重限域的crispr/cas12a報(bào)告器，并與液滴微流控相結(jié)合，開發(fā)出了一種快速且高靈敏的檢測策略，能將exo膜表面的蛋白信號最終轉(zhuǎn)換為熒光信號進(jìn)行輸出，實(shí)現(xiàn)了對單個texo亞群進(jìn)行直接檢測。

46、(1)本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針能特異性地與crispr/cas12a系統(tǒng)結(jié)合，利用cas12a酶的反式切割活性產(chǎn)生熒光信號，將texo膜表面的蛋白信號最終轉(zhuǎn)換為熒光信號進(jìn)行輸出。

47、(2)本發(fā)明中的流體和空間的雙重限域效應(yīng)顯著增強(qiáng)了報(bào)告鏈的熒光信號提高了對靶exo檢測的靈敏度。

48、(3)現(xiàn)有外泌體檢測技術(shù)中，很多外泌體檢測需要通過洗滌去除未結(jié)合的探針，但本發(fā)明的方法不需要洗滌，大大簡化了操作流程，實(shí)現(xiàn)了一步法檢測。

49、(4)本發(fā)明利用適配體探針識別exo膜表面的pd-l1和epcam，與抗體相比，適配體可通過簡單的設(shè)計(jì)進(jìn)行改造，其較小的空間位阻可有效識別靶exo。

50、(5)本發(fā)明集成了crispr/cas12a系統(tǒng)和液滴微流控技術(shù)，可根據(jù)泊松分布進(jìn)行直接定量。